Phương pháp phân tích vi sinh trong thực phẩm
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.29 MB, 41 trang )
Report
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THỰC PHẨM
I.
XÁC ĐỊNH TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ
1. Giới thiệu
Vi sinh vật hiếu khí là vi vinh sinh vật cần oxy để phát triển, trong điều kiện không có oxy,
chúng sẽ chết hoặc không hoạt động. Tổng vi sinh vật hiếu khí có trong mẫu thực phẩm
dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, mức độ vệ sinh trong quá trình chế
biến, bảo quản và tốc dộ hư hỏng của thực phẩm.
Tổng vi sinh vật hiếu khí trong thực phẩm được xác định bằng phương pháp nuôi cấy
trên trên thạch hoặc trên petrifilm. Số lượng colonies đếm được trên đĩa và trên petrifilm thể
hiện tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật trên mẫu. Kết quả số vi sinh vật phát triển trong mẫu
chính xác khi số lượng colonies đếm được trên tất cả các đĩa lớn hơn 15 và nhở hơn 300.
Nếu tổng số colonies đếm được trong tất cả các đĩa quá lớn thì phải tiến hành pha loãng
mẫu. Tuy nhiên, đối với một số trường hợp số colonies trên tất cả các đĩa nằm trong giới hạn
nào đó thì sẽ có những cách tính số vi sinh vật trên mẫu phù hợp.
2. Môi trường và thiết bị sử dụng
2.1 Môi trường
- Buffered peptone water (BPW)
- Plate count agar (PCA)
- Petrifilm
2.2 Dụng cụ/ thiết bị
- Dao; kéo; túi nilon (nhựa) không thấm nước; ống nghiệm;erlen 250ml; ống đong
500ml, 100ml; chai thủy tinh có nắp 500ml, 250 ml; micropipette 1ml, 5ml; đĩa cấy;
đèn cồn;
- Bể ổn nhiệt (water bath), cân, máy lắc votex, máy ủ, máy hấp, oven.
3. Quy trình thử nghiệm
3.1 Chuẩn bị môi trường
- Tất cả các dụng cụ cần phải khử trùng trước khi sử dụng
Buffered peptone water (BPW):
Thành phần
Casein enzymic hydrolysate
Sodium chloride
Disodium phosphate
Mono-potassium Phosphate
Nước cất
m (gram)
10
5
3.5
1.5
1000ml
-
Cân 20 gram các thành phần đổ vào 1L nước cất và khuấy đều cho đến khi tan hết.
Đun nóng để hòa tan nếu cần thiết. Điều chỉnh pH = 7.0 ±0.2. Sau đó hấp ở 121 0C
trong 15 phút. Để nguội xuống 450C - 550C rồi sử dụng.
Plate count agar (PCA):
-
Thành phần
m (gram)
Casein enzymic hydrolysate
5
Yeast extract
2.5
Dextrose
1
Agar
15
Nước cất
1000ml
Cân 23.5 gram các thành phần được liệt kê trên bảng đổ vào 1L nước cất và khuấy
đều. Điều chỉnh pH = 7.0 ±0.2. Đun nóng để hòa tan nếu cần thiết. Hấp để khử trùng
ở 1210C trong 15 phút. Để nguội xuống 450C - 550C rồi sử dụng.
- Đổ agar vào đĩa cấy với độ dày từ 3-4mm (khoảng 15-20ml agar).
3.2 Quy trình cấy mẫu
Bước 1: Cân 25 gram mẫu vào túi nilon (nhựa) không thấm nước.
Cách lấy mẫu: Đối với thịt nguyên khối, cắt nhỏ (cạo) phần vỏ xung quanh khối thịt
(phần tiếp xúc với không khí); đối với thịt xay nhuyễn lấy bất kì; đối với dung dịch nước
hút phần dịch nước)
Bước 2: Đồng nhất mẫu: Đong 225ml PBW vào 25 gr mẫu pha loãng mẫu ở 10-1
Bước 3: Pha loãng mẫu thành 10-2 10-3 10-4
Cách pha loãng mẫu: Chuẩn bị 3 ống nghiệm, đong 9 ml PBW đổ vào mỗi ống nghiệm.
Lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10 -1 đổ vào ống nghiệm thứ nhất ta được độ pha
loãng 10-2 dùng máy lắc, lắc đều. Sau đó lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10 -2 cho vào
ống nghiệm thứ 2 ta được độ pha loãng 10 -3dùng máy lắc, lắc đều. Tiếp theo, lấy 1ml
dung dịch ở độ pha loãng 10-3 cho vào ống nghiệm thứ 3 ta được độ pha loãng 10-4 dùng
máy lắc, lắc đều.
3.2.1
Cấy mẫu trên petrifilm
Bước 1: Chuẩn bị petrifilm. Chuẩn bị 6 petrifilm (mỗi độ pha loãng cần làm ít nhất 2 lần). Label
tên mẫu,độ pha loãng, ngày cấy lên petrifilm.
Bước 2: Nhỏ 1ml các mẫu đã pha loãng 10-2 10-3 10-4 lên petrifilm
Bước 3: Ủ ở 35oC trong 48h ± 2h
Bước 4.Đếm số colonies trên film.
Hình ảnh minh họa vi sinh vật hiếu khí trên petriflim.
3.2.2
Cấy mẫu trên đĩa cấy
Bước 1: Chuẩn bị đĩa cấy. Chuẩn bị 6 đĩa cấy, label tên mẫu, độ pha loãng, ngày cấy lên đĩa)
Bước 2: Nhỏ 1ml các mẫu đã pha loãng 10-2 10-3 10-4 lên đĩa
Bước 3: Đổ 15-20ml agar ở 450C-550C vào đĩa đã có 1ml mẫu, sau đó lắc nhẹ
Cách đổ: Đổ một lượng nhỏ agar (5-10ml) vào đĩa có chứa mẫu, sau đó lắc đều. Lắc nhẹ theo
chiều kim đồng hồ và ngược lại, lắc ngang sau đó lắc dọc để mẫu hòa tan đều vào agar, tránh
trường hợp nơi có mẫu thì mọc quá nhiều, nơi không có mẫu thì không có vsv phát triển, dẫn
đến đếm sô colonies bị sai. Lưu ý, khi lắc tránh trường hợp agar bị dính lên thành, lên nắp hoặc
văng ra ngoài.Sau đó đổ thêm mottj lượng nhỏ agar vào đĩa.
Bước 4. Ủ ở 35oC trong 48h ± 2h
Bước 5: Đếm số colonies trên đĩa.
Hình ảnh minh họa vi sinh vật hiếu khí trên điã cấy
Dựa vào số colonies đếm được trên đĩa cấy hoặc trên film, ta có công thức tính CFU/g
or ml
Công thức:
-
Trong đó:
là tổng colonies đếm được từ hai đĩa, trong hai đĩa đó số colonies phải lớn hơn 15
colonies và nhỏ hơn 300 colonies
là thể tích được sử dụng để cho vào mỗi đĩa (ml)
số đĩa ở độ pha loãng thư nhất
số đĩa ở độ pha loãng thứ 2
d hệ số pha loãng ở độ pha loãng thứ nhất
VD1:
Đĩa 1
10-2
270
10-3
150
-4
10
10
10-4 loại vì số colonies <15. Áp dụng công thức ta được:
41909 4.2x104 CFU/g
Đĩa 2
295
207
8
VD2:
Đĩa 1
Đĩa 2
10
270
305
10-3
150
207
10-4
10
8
-2
-4
10 loại vì số colonies trên điã 2 > 300, 10 loại vì số colonies <15. Áp dụng công thức ta
-2
được:
16227 1.6x104 CFU/g
Ngoài ra, dựa vào số colonies trên tất cả các điã cấy sẽ có những công thức tính CFU phù hợp.
Trường hợp 1.Số colonies trong tất cả các đĩa cấy nhỏ hơn 25.
Công thức:
Trường hợp 2. Số colonies trong tất cả đĩa cấy lớn hơn 25 và nhỏ hơn 250
Công thức:
Trường hợp 3.Số colonies trong tất cả các đĩa lớn hơn 250.
Chọn đĩa có số colonies đếm được gần với 250 nhất
Công thức:
Trong đó 10^a là hệ số pha loãng được chọn; vd hệsố pha loãng là 10-3 thì 10^a=10^3.
II.
XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ COLIFORM
1. Giới thiệu
Coliform là một loại vi khuẩn gram âm kỵ khí, hình que, không tạo bào tử..Chúng thường
tồn tại trong thiên nhiên cũng như trong ruột phân các động vật máu nóng.Xác định coliform
để đánh giá chất lượng thức ăn, nước uống cũng như mức độ vệ sinh trong quá tình chế
biến và bảo quản.
Coliform được xác định bằng phương pháp most probable number (MPN), nuôi cấy trên
thạch và trên petrifilm.Coliform có thể lên men lactose sinh ra khí và acid ở 35 0C-370C trong
24-48h.
2. Môi trường và thiết bị sử dụng
2.1 Môi trường
- Buffered peptone water (BPW)
- Enrichment medium: Lauryl sulphate tryptose broth (LST)
- Selective confirmatory medium: Brilliant green bile lactose (agar)
- Petrifilm
II.2.
Dụng cụ/ thiết bị
- Dao; kéo; túi nilon (nhựa) không thấm nước; ống nghiệm; erlen 250ml; ống đong
500ml, 100ml; chai thủy tinh có nắp 500ml, 250 ml; micropipette 1ml, 5ml; đĩa cấy;
đèn cồn;
- Bể ổn nhiệt (water bath), cân, máy lắc votex, máy ủ, máy hấp, oven.
3. Quy trình thử nghiệm
3.1 Chuẩn bị môi trường
- Tất cả các dụng cụ cần phải khử trùng trước khi sử dụng
Buffered peptone water (BPW):
Thành phần
Casein enzymic hydrolysate
Sodium chloride
Disodium phosphate
Mono-potassium Phosphate
Nước cất
-
m (gram)
10
5
3.5
1.5
1000ml
Cân 20 gram các thành phần đổ vào 1L nước cất và khuấy đều cho đến khi tan hết.
Đun nóng để hòa tan nếu cần thiết. Điều chỉnh pH = 7.0 ±0.2. Sau đó hấp ở 121 0C
trong 15 phút. Để nguội xuống 450C - 550C rồi sử dụng.
Lauryl sulphate tryptose broth (LST)
Thành phần
Tryptose
Lactose
Sodium chloride
Dipotasium phosphate
Monopotasium phosphate
Sodiuml lauryl sulphate
Nước cất
-
m (gram)
20
5
5
2.75
2.75
0.1
1000ml
Cân 35.6 gram các thành phần đổ vào 1L nước cất và khuấy đều cho đến khi tan
hết.. Điều chỉnh pH = 6.8 ±0.2. Sau đó hấp ở 121 0C trong 15 phút. Để nguội xuống
450C - 550C rồi sử dụng.
Brilliant Green Lactose Bile agar
Thành phần
Agar
Veg. Peptone
Lactose
Sodium sulphite
m (gram)
10.15
8.25
1.9
0.205
-
Ferric chloride
Monopotassium phosphate
Erioglaucine
Basic fuchsin
Brilliant green
Sodium deoxycholate
0.0295
0.0153
0.0649
0.0776
0.0295
0.00295
Nước cất
1000ml
Cân 20.7 gram các thành phần đổ vào 1L nước cất và khuấy đều cho đến khi tan
hết.. Điều chỉnh pH = 6.9 ±0.2. Sau đó hấp ở 121 0C trong 15 phút. Để nguội xuống
450C - 550C rồi sử dụng.
3.2 Quy trình cấy mẫu
Bước 1: Cân 25 gram mẫu vào túi nilon (nhựa) không thấm nước.
Cách lấy mẫu: Đối với thịt nguyên khối, cắt nhỏ (cạo) phần vỏ xung quanh khối thịt
(phần tiếp xúc với không khí); đối với thịt xay nhuyễn lấy bất kì; đối với dung dịch nước
hút phần dịch nước)
Bước 2: Đồng nhất mẫu: Đong 225ml PBW vào 25 gr mẫu pha loãng mẫu ở 10-1
Bước 3: Pha loãng mẫu thành 10-2 10-3
Cách pha loãng mẫu: Chuẩn bị 2 ống nghiệm, đong 9 ml PBW đổ vào mỗi ống nghiệm.
Lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10 -1 đổ vào ống nghiệm thứ nhất ta được độ pha
loãng 10-2 dùng máy lắc, lắc đều. Sau đó lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10 -2 cho vào
ống nghiệm thứ 2 ta được độ pha loãng 10-3dùng máy lắc, lắc đều.
3.2.1
Cấy mẫu trên petrifilm
Bước 1: Chuẩn bị petrifilm. Chuẩn bị 6 petrifilm (mỗi độ pha loãng cần làm ít nhất 2 lần). Label
tên mẫu,độ pha loãng, ngày cấy lên petrifilm.
Bước 2: Nhỏ 1ml các mẫu đã pha loãng 10-110-210-3 lên petrifilm
Bước 3: Ủ ở 30oC or 37oC trong 24h ± 2h
Bước 4.Đếm số colonies trên film.Coliform là những colonies có màu đỏ và xanh xung quanh
có khí.
Hình ảnh minh họa vi sinh vật Coliform trên petriflim.
3.2.2
Cấy mẫu trên đĩa cấy
Bước 1: Chuẩn bị đĩa cấy. Chuẩn bị 6 đĩa cấy, label tên mẫu, độ pha loãng, ngày cấy lên đĩa)
Bước 2: Nhỏ 1ml các mẫu đã pha loãng 10-1 10-2 10-3 lên đĩa
Bước 3: Đổ 15-20ml agar ở 450C-550C vào đĩa đã có 1ml mẫu, sau đó lắc nhẹ
Cách đổ: Đổ một lượng nhỏ agar (5-10ml) vào đĩa có chứa mẫu, sau đó lắc đều. Lắc nhẹ theo
chiều kim đồng hồ và ngược lại, lắc ngang sau đó lắc dọc để mẫu hòa tan đều vào agar, tránh
trường hợp nơi có mẫu thì mọc quá nhiều, nơi không có mẫu thì không có vsv phát triển, dẫn
đến đếm sô colonies bị sai. Lưu ý, khi lắc tránh trường hợp agar bị dính lên thành, lên nắp hoặc
văng ra ngoài.Sau đó đổ thêm mottj lượng nhỏ agar vào đĩa.
Bước 4. Ủ ở 30oC or 37oC trong 24h ± 2h
Bước 5: Đếm số colonies trên đĩa.
Hình ảnh minh họa Coliformtrên điã cấy
Dựa vào số colonies đếm được trên đĩa cấy hoặc trên film, ta có công thức tính CFU/g
or ml
Công thức:
-
Trong đó:
là tổng colonies đếm được từ hai đĩa, trong hai đĩa đó số colonies phải lớn hơn 15
colonies và nhỏ hơn 300 colonies
là thể tích được sử dụng để cho vào mỗi đĩa (ml)
số đĩa ở độ pha loãng thư nhất
số đĩa ở độ pha loãng thứ 2
d hệ số pha loãng ở độ pha loãng thứ nhất
Ngoài ra, dựa vào số colonies trên tất cả các điã cấy sẽ có những công thức tính CFU phù hợp.
Trường hợp 1.Số colonies trong tất cả các đĩa cấy nhỏ hơn 25.
Công thức:
Trường hợp 2. Số colonies trong tất cả đĩa cấy lớn hơn 25 và nhỏ hơn 250
Công thức:
Trường hợp 3.Số colonies trong tất cả các đĩa lớn hơn 250.
Chọn đĩa có số colonies đếm được gần với 250 nhất
Công thức:
Trong đó 10^a là hệ số pha loãng được chọn; vd hệ số pha loãng là 10-3 thì 10^a=10^3.
3.2.3
Most probable number (MPN)
Bước 1: Chuẩn bị 9 ống nghiệm, đong 10ml LST broth vào mỗi ống nghiệm. label lên ống tên
mẫu, thời gian cấy.
Bước 2: Chuyển 1ml các mẫu đã pha loãng vào các ống ngiệm. chuyển 1ml 10 -1 vào 3 ống
nghiệm có chứa LST broth,tiếp theo chuyển 1ml 10 -2 vào 3 ống nghiệm có chứa LST broth, cuối
cùngchuyển 1ml 10-3 vào 3 ống nghiệm có chứa LST broth.
Bước 3: Ủ ở 30oC or 37oC trong 24h ± 2h
Bước 4: Quan sát hiện tượng, Coliform có trong ống nghiệm có bọt khí xuất hiện. Dựa vào số
lượng ống nghiệm xuất hiện bọt khí để tính MPN/g.
Nồng
loãng
độ
pha
Ống nghiệm thứ Ống nghiệm thứ Ống nghiệm thứ
1
2
3
10-1
10-2
10-3
Sau đó dựa bào bảng MPN để tính MPN/g của mẫu.
Bảng MPN
Tổng số ống
nghiệm có khí
xuất hiện
VD: Trong hình là kết quả sau khi test coliform
Nồng
loãng
độ
pha
Ống nghiệm thứ Ống nghiệm thứ Ống nghiệm thứ
1
2
3
10-1
+
+
10-2
+
+
-3
10
(+: có bọt khí xuất hiện; -: không có bọt khí xuất hiện)
+
-
Tổng số ống
nghiệm có khí
xuất hiện
3
2
0
Đối chiếu kết quả ở bảng trên vào bảng MNP ta được: tổng số Coliform = 93 MNP/g
III.
XÁC ĐỊNH E.COLI
1. Giới thiệu
E. coli là vi khuẩn gram âm, hình que, thường được tìm thấy trong môi trường, thực phẩm
và trong đường ruột của động vật máu nóng. Sự có mặt của E.coli trong nước, thực phẩm chỉ
thị sự ô nhiễm phân.
E. coli là một nhóm của Coliform, vì thế xác định E.coli trong thực phẩm, nước uống để
đánh giá chất lượng thực phẩm cũng như mức độ vệ sinh thực phẩm. E. coli có thể tồn tại từ
50C-450C nhưng nhiệt độ để chúng phát triển tốt nhất là 370C.
E.coli được xác định bằng phương pháp most probable number (MPN), nuôi cấy trên thạch
và trên petrifilm.E.coli có thể lên men lactose sinh ra khí và acid ở 350C-370C trong 24-48h.
2. Môi trường và thiết bị sử dụng
2.1 Môi trường
- Buffered peptone water (BPW)
- Selective enrichment medium Lauryl sulphate tryptose broth ( LST)
- Escherichia coli broth (EC broth)
- Peptone water
- Kovacs’ Indole reagent
- Petrifilm
2.2 Dụng cụ/ thiết bị
- Dao; kéo; túi nilon (nhựa) không thấm nước; ống nghiệm; erlen 250ml; ống đong
500ml, 100ml; chai thủy tinh có nắp 500ml, 250 ml; micropipette 1ml, 5ml; đĩa cấy;
đèn cồn;
- Bể ổn nhiệt (water bath), cân, máy lắc votex, máy ủ, máy hấp, oven.
3. Quy trình thử nghiệm
3.1 Chuẩn bị môi trường
- Tất cả các dụng cụ cần phải khử trùng trước khi sử dụng
Buffered peptone water (BPW):
Thành phần
Casein enzymic hydrolysate
Sodium chloride
Disodium phosphate
Mono-potassium Phosphate
Nước cất
-
m (gram)
10
5
3.5
1.5
1000ml
Cân 20 gram các thành phần cho vào 1L nước cất và khuấy đều cho đến khi tan hết.
Đun nóng để hòa tan nếu cần thiết. Điều chỉnh pH = 7.0 ±0.2. Sau đó hấp ở 121 0C
trong 15 phút. Để nguội xuống 450C - 550C rồi sử dụng.
Lauryl sulphate tryptose broth (LST)
Thành phần
Tryptose
Lactose
Sodium chloride
Dipotasium phosphate
Monopotasium phosphate
Sodiuml lauryl sulphate
Nước cất
-
m (gram)
20
5
5
2.75
2.75
0.1
1000ml
Cân 35.6 gram các thành phần cho vào 1L nước cất và khuấy đều cho đến khi tan
hết.. Điều chỉnh pH = 6.9 ±0.2. Sau đó hấp ở 121 0C trong 15 phút. Để nguội xuống
450C - 550C rồi sử dụng.
Escherichia coli broth (EC broth)
Thành phần
Casein enzymic hydrolysate
Lactose
Bile salt mixture
Dipotassium phosphate
Monopotasium phosphate
Sodium chloride
Nước cất
-
m (gram)
20
5
1.5
4
1.5
5
1000ml
Cân 37 gram các thành phần cho vào 1L nước cất và khuấy đều cho đến khi tan hết..
Điều chỉnh pH = 6.9 ±0.2. Sau đó hấp ở 121 0C trong 15 phút. Để nguội xuống 45 0C 550C rồi sử dụng.
Peptone water (PW):
-
Thành phần
m (gram)
Peptic digest of animal tisue
10
Sodium chloride
5
Nước cất
1000ml
Cân 15 gram các thành phần cho vào 1L nước cất và khuấy đều cho đến khi tan hết..
Điều chỉnh pH = 7.2 ±0.2. Sau đó hấp ở 121 0C trong 15 phút. Để nguội xuống 45 0C 550C rồi sử dụng.
Kovacs’ Indole reagent:
Thành phần
p-Dimethylaminobenzaldehyde
Hydrochloric acid đậm đặc
Amyl alcohol
5g
25ml
75ml
Brilliant Green Lactose Bile agar
-
Thành phần
Agar
Veg. Peptone
Lactose
Sodium sulphite
Ferric chloride
Monopotassium phosphate
Erioglaucine
Basic fuchsin
Brilliant green
Sodium deoxycholate
m (gram)
10.15
8.25
1.9
0.205
0.0295
0.0153
0.0649
0.0776
0.0295
0.00295
Nước cất
1000ml
Cân 20.7 gram các thành phần đổ vào 1L nước cất và khuấy đều cho đến khi tan
hết.. Điều chỉnh pH = 6.8 ±0.2. Sau đó hấp ở 121 0C trong 15 phút. Để nguội xuống
450C - 550C rồi sử dụng.
3.2 Quy trình cấy mẫu
Bước 1: Cân 25 gram mẫu vào túi nilon (nhựa) không thấm nước.
Cách lấy mẫu: Đối với thịt nguyên khối, cắt nhỏ (cạo) phần vỏ xung quanh khối thịt
(phần tiếp xúc với không khí); đối với thịt xay nhuyễn lấy bất kì; đối với dung dịch nước
hút phần dịch nước)
Bước 2: Đồng nhất mẫu: Đong 225ml PBW vào 25 gr mẫu pha loãng mẫu ở 10-1
Bước 3: Pha loãng mẫu thành 10-2 10-3
Cách pha loãng mẫu: Chuẩn bị 2 ống nghiệm, đong 9 ml PBW đổ vào mỗi ống nghiệm.
Lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10 -1 đổ vào ống nghiệm thứ nhất ta được độ pha
loãng 10-2 dùng máy lắc, lắc đều. Sau đó lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10 -2 cho vào
ống nghiệm thứ 2 ta được độ pha loãng 10-3dùng máy lắc, lắc đều.
3.2.1
Cấy mẫu trên petrifilm
Bước 1: Chuẩn bị petrifilm. Chuẩn bị 6 petrifilm (mỗi độ pha loãng cần làm ít nhất 2 lần). Label
tên mẫu,độ pha loãng, ngày cấy lên petrifilm.
Bước 2: Nhỏ 1ml các mẫu đã pha loãng 10-1 10-2 10-3 lên petrifilm
Bước 3: Ủ ở 37oC trong 24h ± 2h
Bước 4.Đếm số colonies trên film.E.coli là những colonies có màu xanh xung quanh có khí.
Hình ảnh minh họa vi sinh vật E.coli trên petriflim.
3.2.2
Cấy mẫu trên đĩa cấy
Bước 1: Chuẩn bị đĩa cấy. Chuẩn bị 6 đĩa cấy, label tên mẫu, độ pha loãng, ngày cấy lên đĩa
Bước 2: Nhỏ 1ml các mẫu đã pha loãng 10-1 10-2 10-3 lên đĩa
Bước 3: Đổ 15-20ml agar ở 450C-550C vào đĩa đã có 1ml mẫu, sau đó lắc nhẹ
Cách đổ: Đổ một lượng nhỏ agar (5-10ml) vào đĩa có chứa mẫu, sau đó lắc đều. Lắc nhẹ theo
chiều kim đồng hồ và ngược lại, lắc ngang sau đó lắc dọc để mẫu hòa tan đều vào agar, tránh
trường hợp nơi có mẫu thì mọc quá nhiều, nơi không có mẫu thì không có vsv phát triển, dẫn
đến đếm sô colonies bị sai. Lưu ý, khi lắc tránh trường hợp agar bị dính lên thành, lên nắp hoặc
văng ra ngoài.Sau đó đổ thêm mottj lượng nhỏ agar vào đĩa.
Bước 4. Ủ ở 37oC trong 24h ± 2h
Bước 5: Đếm số colonies trên đĩa.
Hình ảnh minh họa, trên đĩa cấy không xác định được E.coli, vid E.coli thuộc Coliform,
trên đĩa cấy chỉ xác định được Coliform
Công thức:
-
Trong đó:
là tổng colonies đếm được từ hai đĩa, trong hai đĩa đó số colonies phải lớn hơn 15
colonies và nhỏ hơn 300 colonies
là thể tích được sử dụng để cho vào mỗi đĩa (ml)
số đĩa ở độ pha loãng thư nhất
số đĩa ở độ pha loãng thứ 2
d hệ số pha loãng ở độ pha loãng thứ nhất
Ngoài ra, dựa vào số colonies trên tất cả các điã cấy sẽ có những công thức tính CFU phù hợp.
Trường hợp 1.Số colonies trong tất cả các đĩa cấy nhỏ hơn 25.
Công thức:
Trường hợp 2. Số colonies trong tất cả đĩa cấy lớn hơn 25 và nhỏ hơn 250
Công thức:
Trường hợp 3.Số colonies trong tất cả các đĩa lớn hơn 250.
Chọn đĩa có số colonies đếm được gần với 250 nhất
Công thức:
Trong đó 10^a là hệ số pha loãng được chọn; vd hệ số pha loãng là 10-3 thì 10^a=10^3.
3.2.4
Most probable number (MPN)
Bước 1: Chuẩn bị 9 ống nghiệm, đong 10ml LST broth vào mỗi ống nghiệm. label lên ống tên
mẫu, thời gian cấy.
Bước 2: Chuyển 1ml các mẫu đã pha loãng vào các ống ngiệm. chuyển 1ml 10 -1 vào 3 ống
nghiệm có chứa LST broth,tiếp theo chuyển 1ml 10 -2 vào 3 ống nghiệm có chứa LST broth, cuối
cùngchuyển 1ml 10-3 vào 3 ống nghiệm có chứa LST broth.
Bước 3: Ủ ở 37oC trong 24h ± 2h
Bước 4: Quan sát hiện tượng, ống nghiệm xuất hiện bọt khí hoặc mờ đục.
Bước 5: Đong 10ml EC broth vào ống nghiệm. Dựa vào số ống nghiệm có hiện tượng bị mờ
đục hoặc có khí ở LST broth để chuẩn bị ống nghiệm EC broth.
Bước 6: Sử dụng que cấy, cấy truyền từ LST broth sang EC broth. Quan sát hiện tượng ở LST
để cấy truền, chỉ cấy chuyền những ống nghiệm có khí gas và bị đục.
Bước 7: Ủ ở 44oC trong 24h ± 2h
Bước 8: Đong 10ml peptone water (giữ nhiệt ở 44 0C) vào ống nghiệm. Dựa vào số ống nghiệm
có xuất hiện bọt khí hoặc mờ đục ở EC broth để chuận bị ống chưa peptone water.
Bước 9: Sử dụng que cấy, cấy truyền từ EC broth sang peptone water.
Bước 10: Ủ ở 44oC trong 48h ± 2h
Bươc 11: Thêm 0.5ml của indole reagent vào các ống nghiệm có chứa peptone water. Lắc đều,
chờ trong 1 phút và quan sát hiện tượng (Màu đỏ xuất hiện)
VD: Trong hình là kết quả sau khi test E.coli
Nồng
loãng
độ
pha
Ống nghiệm thứ Ống nghiệm thứ Ống nghiệm thứ
1
2
3
10-1
+
+
10-2
+
10-3
Sau đó dựa bào bảng MPN để tính MPN/g của mẫu.
E.coli = 93 MPN/g
Bảng MPN
+
+
-
Tổng số ống
nghiệm có khí
xuất hiện
3
2
0
IV.
Xác định nấm men và nấm mốc (yeasts and molds)
1. Giới thiệu chung
Nấm men và nấm mốc thuộc họ nấm, chúng có khả năng tấn công thực phẩm và làm
phân hủy thực phẩm ở nhiều điểu kiện thích hợp. Nấm men và nấm mốc là vi sinh vật hiếu khí
bắt buộc, sống trong môi trường pH và nhiệt độ khá rộng rộng, pH từ 2 tới pH lớn hơn 9,
nhiệt độ thích hợp từ 5 – 350C (một số loài còn sống ngoài mức này).
Nhiễm bẩn thực phẩm do nấm men và nấm mốc có thể gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho
các nhà sản xuất, xử lý, và người tiêu dùng. Chúng cũng có thể gây nguy hiểm cho sức khỏe
con người hay động vật bởi vì chúng sản xuất các chất chuyển hóa độc hại. Hầu hết các độc
tố nấm mốc là những hợp chất ổn định mà không bị phá hủy trong quá trình chế biến thực
phẩm hoặc nấu ăn. Một số nấm men cũng có thể gợi ra những phản ứng dị ứng hoặc có thể
gây ra nhiễm trùng,...
Xác định nấm men và nấm mốc trong thực phẩm để đánh giá mức độ nhiễm bẩn của
thực phẩm có thể gây nguy hiểm cho con người.
2. Môi trường và thiết bị sử dụng
2.1 Môi trường
- Peptone water (PW)
- Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC agar)
- Chloramphenicol selective supplement (disolved with methnol)
- Petrifilm
2.2 Dụng cụ/ thiết bị
- Dao; kéo; túi nilon (nhựa) không thấm nước; ống nghiệm; erlen 250ml; ống đong
500ml, 100ml; chai thủy tinh có nắp 500ml, 250 ml; micropipette 1ml, 5ml; đĩa cấy;
đèn cồn;
Bể ổn nhiệt (water bath), cân, máy lắc votex, máy ủ, máy hấp, oven.
3. Quy trình thử nghiệm
3.1 Chuẩn bị môi trường
- Tất cả các dụng cụ cần phải khử trùng trước khi sử dụng
Peptone water (PW):
-
Thành phần
Peptic digest of animal tissue
Sodium chloride
Nước cất
-
m (gram)
10
5
1000ml
Cân 15 gram các thành phần cho vào 1L nước cất và khuấy đều cho đến khi tan hết.
Đun nóng để hòa tan nếu cần thiết. Điều chỉnh pH = 7.2 ±0.2. Sau đó hấp ở 121 0C
trong 15 phút. Để nguội xuống 450C - 550C rồi sử dụng.
Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC agar)
Thành phần
Peptic digest of animal tissue
Dextrose
Khối lượng
5
10
-
Monopotassium phosphate
1
Magnesium sulfate
0.5
Rose bengal
0.025
Dichloran
0.002
Agar
13
Cân 29.527 gram các thành phần cho vào 1L nước cất và khuấy đều cho đến khi tan
hết. Đun nóng để hòa tan nếu cần thiết. Điều chỉnh pH = 5.6 ±0.2. Sau đó hấp ở
1210C trong 15 phút. Để nguội xuống 450C - 550C rồi sử dụng.
3.2 Quy trình
Bước 1: Cân 25 gram mẫu vào túi nilon (nhựa) không thấm nước.
Cách lấy mẫu: Đối với thịt nguyên khối, cắt nhỏ (cạo) phần vỏ xung quanh khối thịt
(phần tiếp xúc với không khí); đối với thịt xay nhuyễn lấy bất kì; đối với dung dịch nước
hút phần dịch nước)
Bước 2: Đồng nhất mẫu: Đong 225ml PBW vào 25 gr mẫu pha loãng mẫu ở 10-1
Bước 3: Pha loãng mẫu thành 10-2 10-3 10-4
Cách pha loãng mẫu: Chuẩn bị 2 ống nghiệm, đong 9 ml PBW đổ vào mỗi ống nghiệm.
Lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10 -1 đổ vào ống nghiệm thứ nhất ta được độ pha
loãng 10-2 dùng máy lắc, lắc đều. Sau đó lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10 -2 cho vào
ống nghiệm thứ 2 ta được độ pha loãng 10 -3 dùng máy lắc, lắc đều. Tiếp theo, lấy 1ml
dung dịch ở độ pha loãng 10-3 cho vào ống nghiệm thứ 2 ta được độ pha loãng 10 -4
dùng máy lắc, lắc đều.
3.2.1
Cấy mẫu trên petrifilm
Bước 1: Chuẩn bị petrifilm. Chuẩn bị 6 petrifilm (mỗi độ pha loãng cần làm ít nhất 2 lần). Label
tên mẫu,độ pha loãng, ngày cấy lên petrifilm.
Bước 2: Nhỏ 0.1ml các mẫu đã pha loãng 10-2 10-3 10-4 lên petrifilm
Bước 3: Ủ ở 25oC trong 3 ngày và 5 ngày
Bước 4. Đếm số colonies trên film.
Hình ảnh minh họa nấm men và nấm mốc trên petrifilm
3.2.2
Cấy mẫu trên đĩa cấy
Bước 1: Chuẩn bị đĩa cấy. Chuẩn bị 6 đĩa cấy, label tên mẫu, độ pha loãng, ngày cấy lên đĩa
Bước 2: Đổ 15-20ml agar ở 450C-550C vào đĩa, sau đó chờ cho agar đông lại
Bước 3: Nhỏ 0.1ml các mẫu đã pha loãng 10-2 10-3 10-4 lên bề mặt đĩa
Bước 4. Ủ ở 25oC trong 36h ± 2h và 5 ngày
Bước 5: Đếm số colonies trên đĩa.
Hình ảnh minh họa, trên đĩa cấy
Công thức:
Trong đó:
-
là tổng colonies đếm được từ hai đĩa, trong hai đĩa đó số colonies phải lớn hơn 15
colonies và nhỏ hơn 300 colonies
là thể tích được sử dụng để cho vào mỗi đĩa (ml)
số đĩa ở độ pha loãng thư nhất
số đĩa ở độ pha loãng thứ 2
d hệ số pha loãng ở độ pha loãng thứ nhất
Ngoài ra, dựa vào số colonies trên tất cả các điã cấy sẽ có những công thức tính CFU phù hợp.
Trường hợp 1.Số colonies trong tất cả các đĩa cấy nhỏ hơn 25.
Công thức:
Trường hợp 2. Số colonies trong tất cả đĩa cấy lớn hơn 25 và nhỏ hơn 250
Công thức:
Trường hợp 3.Số colonies trong tất cả các đĩa lớn hơn 250.
Chọn đĩa có số colonies đếm được gần với 250 nhất
Công thức:
Trong đó 10^a là hệ số pha loãng được chọn; vd hệ số pha loãng là 10-3 thì 10^a=10^3.
V.
XÁC ĐỊNH SALMONELLA
1. Giới thiệu
Salmonella là một vi khuẩn gây ô nhiễm phổ biến nhất trong thực phẩm và nước.
Salmonella được tìm thấy trên toàn thế giới, chúng gây ra các bệnh như sốt thương hàn, phó
thương hàn sốt và ngộ độc thực phẩm, chúng được gọi là thực phẩm gây ra tác nhân gây
bệnh.
Salmonella là vi khuẩn Gram âm, kỵ khí tuỳ ý, tế bào que, không bào tử, cử động dể
dàng với đường kính khoảng 0,7-1,5 mm, chiều dài 2-5 mm và roi xung quanh. Samonella lấy
năng lượng từ quá trình oxy hóa khử từ các chất hữu cơ. Salmonella can produce acid from
glucose and mannitol fermentation, about 90% of Samonella produce hydrogen sulfide (H2S).
Trong mẫu thực phẩm có chứa nhiều loại vi khuẩn với mức độ khác nhau, và lượng
Samonella trong thực phẩm tương đối ít, bên cạnh đó, sự phát triển của một số loài vi
khuẩn còn có khả năng ức chế sự phát triển của Samonella. Vì vậy, các phương pháp được
sử dụng để phát hiện các Samonalla dựa trên BS EN 12824, nó chứa 4 bước chính là: Preenrichment culture, enrichment culture, plating out and confirmation.
nào đó thì sẽ có những cách tính số vi sinh vật trên mẫu phù hợp.
2. Môi trường và thiết bị sử dụng
2.1 Môi trường
- Pre-enrichment broth: Buffered 1% peptone water (BPW)
- Enrichment broth: Rappaport-Vassiliadis Soybean (RVS) broth
- Selective agar: Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar; Bismuth sulphite (BS) agar;
- Non-selective agar: Nutrient agar
- Triple sugar iron (TSI)
- Samonella agglutinating sera
- Saline water 0.85%
- Petrifilm
2.2 Dụng cụ/ thiết bị
- Dao; kéo; túi nilon (nhựa) không thấm nước; ống nghiệm;erlen 250ml; ống đong
500ml, 100ml; chai thủy tinh có nắp 500ml, 250 ml; micropipette 1ml, 5ml; đĩa cấy;
đèn cồn;
Bể ổn nhiệt (water bath), cân, máy lắc votex, máy ủ, máy hấp, oven.
3. Quy trình thử nghiệm
3.1 Chuẩn bị môi trường
- Tất cả các dụng cụ cần phải khử trùng trước khi sử dụng
Buffered peptone water (BPW):
-
Thành phần
Casein enzymic hydrolysate
Sodium chloride
Disodium phosphate
Mono-potassium Phosphate
Nước cất
m (gram)
10
5
3.5
1.5
1000ml
