Nghiên cứu chuyển gen GUS vào giống ngô LVN99 Việt Nam (LV thạc sĩ)

1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
ĐẶNG THỊ HOÀNG HÀ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GUS VÀO
GIỐNG NGÔ LVN99 VIỆT NAM

Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên, năm 2016

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


2

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây ngô (Zea mays L.) là một trong năm loại cây lương thực chính của
thế giới. Ở Việt Nam, ngô là cây trồ ng quan tr ọng thứ hai sau lúa gạo. Hạt ngô
chứa khá đầy đủ các chất dinh dưỡng cho người và gia súc. Trong những năm
gần đây sản xuất ngô ở Việt Nam tăng nhanh nhờ sự thúc đẩy của ngành chăn
nuôi và công nghiệp chế biến.
Hạt ngô cũng như các loại ngũ cốc khác dễ bị mọt xâm hại

. Mọt ngô

(Sitophilus zeamais Motsch.) là loại đa thực, chúng có thể ăn được hầu hết các

loại ngũ cốc, các loại đậu, hạt có dầu và nhiều sản phẩm thực vật khác. Thức ăn
thích hợp nhất với mọt là hạt ngô và gạo. Mọt trưởng thành dùng vòi khoét một
lỗ sâu vào hạt, rồi đẻ trứng ở đó và tiết ra một thứ dịch nhầy để bít kín lỗ đó lại.
Sâu non nở ra trong hạt ngô, thường ăn phôi trước, sau đó mới đến nội nhũ và
các bộ phận khác làm cho hạt chỉ còn lại một lớp vỏ mỏng. Khi đẫy sức, sâu non
đục những lỗ nhỏ lộ rõ trên hạt để vũ hoá bay ra ngoài [16]. Defensin thực vật là
peptide cation và thuộc về một siêu họ lớn của các peptide kháng khuẩn.
Defensin thực vật hoạt động sẽ tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến chức
năng kênh protein màng, làm suy yếu vi sinh vật, tăng cường khả năng chống
chịu kẽm, làm thay đổi trạng thái oxi hoá khử ascorbic acid và đặc biệt ức chế
hoạt động của α-amylase ở côn trùng [16]. Liu và cs (2006) đã phân lập defensin 1
từ cây đậu xanh (VrD1) và chứng minh được vai trò chống côn trùng, kháng mọt
của protein VrD1. VrD1 ức chế hoạt động của α-amylase cho nên kìm hãm sự tiêu
hóa tinh bột trong ruột mọt [23]. Năm 2008, Pelegrini và cs đã thông báo phân lập
protein defensin1 từ cây đậu đũa (VuD1) có khả năng ức chế hoạt động của αamylase ở ấu trùng mọt [25].
Các giống ngô lai cho năng suất cao nhưng sản lượng, giá thành, chất
lượng bị giảm nhiều do hạt của các gi ống ngô này rất dễ bị mọt xâm hại. Hiê ̣n
nay, nhiề u bi ện pháp bảo quản hạt ngô sau thu hoạch đã đươ ̣c áp du ̣ng , nhưng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


3

tốn thời gian, hiệu quả thấp và tổn thất sau thu hoạch vẫn rất lớn. Nghiên cứu
ứng dụng công ngh ệ sinh học hiện đại tạo giống ngô kháng mọt đang được nhiều
nhà khoa học quan tâm , trong đó có chi ến lược tạo cây ngô chuyển gen kháng
mọt ở Việt Nam. Do vậy viê ̣c nghiên cứu xây dựng quy trình chuyể n gen ở cây
ngô làm cơ sở cho viê ̣c chuyể n thành công gen defensin vào giống ngô Việt Nam
phục vụ tạo dòng ngô chuyển gen có khả năng kháng mọt cao là rất cần thiết

.

Xuấ t phát từ những lý do trên chúng tôi đã xây dựng và thực hiê ̣n đ ề tài luâ ̣n văn
thạc sĩ là: “Nghiên cứu chuyển gen gus vào giố ng ngô LVN 99 Viê ̣t Nam”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được tuổi phôi non thích hợp cho biến nạp gen thông qua

A.

tumefaciens và đề xuất được quy trình chuyển gen ở cây ngô.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của tuổi phôi ngô non phu ̣c vu ̣ chuyể n
gen và ảnh hưởng của mâ ̣t đô ̣ tế bào vi khuẩ n

A. tumefaciens, nồ ng đô ̣

acetosyringone (AS), nồ ng đô ̣ kanamycin và thời gian nhiễm khuẩ n đến hiệu quả
chuyể n gen gus ở giống ngô lai LVN99.
3.2. Nghiên cứu chuyể n gen gus và tạo cây ngô chuyển gen từ giống ngô

lai

LVN99.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Về khoa ho ̣c , kế t quả nghiên cứu đã xác đ ịnh được tuổi phôi non thích
hợp đố i với sự tá i sinh in vitro và hoàn thi ện quy trình tái sinh từ phôi ngô non
phục vụ chuyển gen ở ngô. Chuyển thành công gen gus và đề xuất quy trình
chuyển gen vào giống LVN99.
Về thực tiễn, kế t quả chuy ển thành công gen gus và tạo cây ngô chuyển
gen là cơ sở của việc ứng dụng quy trình chuyển gen ở ngô nhằm tạo cây ngô

chuyể n gen có sự tăng cường khả năng chố ng chiụ các stress từ ngoa ̣i cảnh .

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


4

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY NGÔ

1.1.1. Nguồn gốc, đặc điểm sinh học của cây ngô
Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ hoà thảo
(Gramineae), bộ hoà thảo (Graminales). Từ loài Zea mays Line, dựa vào cấu
trúc nội nhũ của hạt và hình thái bên ngoài, ngô được phân thành các loài phụ:
ngô đá rắn, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa răng
ngựa. Từ các loài phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngô được phân chia thành các
thứ. Ngoài ra ngô còn được phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh
trưởng và thương phẩm.
Căn cứ vào hầu hết các kết quả khảo cổ học, các dẫn liệu lịch sử và tế bào
học... cho thấy ngô có nguồn gốc từ châu Mỹ. Tuy nhiên dạng ngô dại hiện
không còn tồn tại nên có nhiều giả thuyết khác nhau về nguồn gốc di truyền của
cây ngô. Điều quan trọng nhất là hình thành vô số loài phụ, các thứ và nguồn dị
hợp thể của cây ngô, các dạng cây và biến dạng của chúng đã tạo cho nhân loại
một loài ngũ cốc có giá trị đứng cạnh lúa mì và lúa nước [32].
Cơ quan sinh dưỡng của cây ngô gồm rễ, thân, lá làm nhiệm vụ duy trì đời
sống cá thể. Hạt được coi là cơ quan khởi đầu của cây.
Sau khi gieo hạt, ngô phát triển thành cây mầm. Cây mầm chủ yếu sử
dụng nguồn dinh dưỡng chứa trong nội nhũ hạt. Bộ phận phía trên hạt phát triển
lên mặt đất gồm có trụ giữa lá mầm. Phần đỉnh trụ lá mầm có mấu bao lá mầm,

từ đó phát sinh bao lá mầm và bên trong bao lá mầm là thân lá mầm. Trên trục
của cây mầm, một đầu hình thành rễ cây mầm, sau đó phát triển thành rễ chính,
từ rễ chính hình thành các rễ phụ.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


5

Ngô là cây có hệ rễ chùm tiêu biểu cho bộ rễ cây hoà thảo. Hệ rễ có 3 loại:
rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng. Ngô ra lớp rễ đốt đầu tiên lúc 3- 4 lá mầm và
mọc theo thứ tự từ dưới lên trên. Rễ đốt giúp cho cây ngô hút nước và dinh
dưỡng. Rễ chân kiềng mọc xung quanh các đốt phần thân sát gốc trên mặt đất, rễ
này giúp cây chống đổ, bám chặt vào đất và tham gia vào hút nước và thức ăn
cho cây. Số lượng rễ, số lông rễ và độ dài rễ khác nhau ở mỗi giống. Đây là chỉ
tiêu quan trọng để đánh giá khả năng chịu hạn của cây.
Thân cây ngô thường phát triển mạnh, thẳng, cứng, dạng bền chắc. Thân
chia làm nhiều gióng, các gióng nằm giữa các đốt, các gióng dài và to dần từ
dưới lên.
Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen kẽ nhau. Độ lớn và số lá
ngô dao động từ 6 – 22 là tuỳ thuộc vào giống và điều kiện tự nhiên. theo hình
thái và vị trí lá trên cây, lá ngô được chia thành các nhóm: lá mầm, lá thân, lá
ngọn, lá bi. Lá ngô trưởng thành bao gồm các bộ phận: bẹ lá, phiến lá, thìa lá.
Trên lá có rất nhiều khí khổng. Cơ chế đóng mở của lỗ khí khổng liên quan chặt
chẽ tới điều kiện hạn hán.
Bắp ngô phát sinh từ mầm nách lá trên thân. Số mầm nách lá trên thân
nhiều nhưng chỉ 1 – 3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp. Tuỳ thuộc vào
giống, điều kiện sinh thái và chăm sóc, thời vụ mà số bắp trên cây, số hạt trên
bắp, vị trí đóng bắp, thời gian phun râu và trỗ cờ... là khác nhau.
Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 4 bộ phận chính: vỏ hạt, lớp alơron,

phôi và nội nhũ (Hình 1.1). Phía dưới hạt có gốc hạt gắn liền với lõi ngô. Vỏ hạt
bao bọc xung quanh, màu sắc vỏ hạt tuỳ thuộc vào từng giống. Nằm sau lớp vỏ
hạt là lớp alơron bao bọc lấy nội nhũ và phôi. Nội nhũ là bộ phận chính chiếm
70- 78% trọng lượng hạt, thành phần chủ yếu là tinh bột, ngoài ra có chứa
protein, lipit, vitamin, khoáng và enzym để nuôi phôi phát triển. Phôi ngô lớn
(chiếm 8- 15%) nên cần chú trọng bảo quản [32].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


6

Hình 1.1. Sơ đồ hạt ngô bổ dọc [43].
Các chất trong hạt ngô dễ được đồng hoá nên có giá trị dinh dưỡng cao.
Hạt ngô chứa phần lớn tinh bột. Hàm lượng tinh bột ở ngô tẻ nhiều hơn ngô nếp
(68% so với 65%) và được chia thành tinh bột mềm (tinh bột bột) và tinh bột
cứng (tinh bột sừng). Ngô nếp được cấu tạo hoàn toàn từ amilopectin nên có độ
dẻo hơn ngô tẻ. Hàm lượng lipit cao thứ hai trong các loại hạt ngũ cốc (3,5- 7%)
và phụ thuộc vào từng giống, điệu kiện tự nhiên. Lipit được tập trung ở phôi và
tầng alơron. Dầu ngô chứa đến 50% axit linoleic liên kết với các glyxerit, axit
oleic, panmitic, rixinic. Hàm lượng lipit là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá
chất lượng hạt.
Phôi ngô chiếm 1/3 thể tích của hạt và gồm có các phần: ngù (phần ngăn
cách giữa nội nhũ và phôi), lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm [32].
1.1.2. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam
Ngô vừa là cây lương thực, vừa là cây thức ăn cho gia súc. Ngô là cây có
địa bàn phân bố rộng rãi nhất. Trong những năm gần đây, diện tích ngô trên toàn
thế giới tăng lên gấp rưỡi, năng suất tăng gấp 2,5 lần. Diện tích, sản lượng và
năng suất ngô trên thế giới có xu hướng tăng qua các năm từ niên vụ 2001 –
2002 đến niên vụ 2014 – 2015. Diện tích từ 173,3 triệu ha trong niên vụ 2001 2002 tăng lên 177,4 triệu ha trong niên vụ 2013 – 2014, tăng 29% trong vòng 13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


7

niên vụ. Năng suất cũng tăng 26% trong giai đoạn 2001 – 2013. Sản lượng ngô
thế giới tăng 63%, bình quân 4,2%/năm. Trong đó, sản lượng tăng do tăng diện
tích là 2,2%/năm và do tăng năng suất là 2%. Hoa Kỳ là nước dẫn đầu về sản
lượng ngô, đạt trên 353 triệu tấn trong niên vụ 2013 – 2014, kế đến là Trung
Quốc đạt trên 217 triệu tấn. Đứng hàng thứ ba là Brazil với sản lượng 80,5 triệu
tấn, khối EU-27 đứng thứ tư với sản lượng gần 65 triệu tấn. Tổng lượng cung
ngô trên thế giới có xu hướng tăng liên tục từ niên vụ 2001 đến 2014, bình quân
3,6%/năm chủ yếu do tăng sản lượng hàng năm. Lượng ngô dự trữ qua các năm
biến động không lớn, năm dự trữ thấp nhất là 104 triệu tấn, năm cao nhất 152
triệu tấn, trung bình khoảng 131 triệu tấn/năm.
Ở Việt Nam, các giống ngô lai được trồng ở hầu hết các địa phương có đất
cao dễ thoát nước: Đông Nam Bộ, Tây Nguyên, các tỉnh miền núi phía Bắc,
đồng bằng sông Hồng, Duyên hải miền Trung. Trong khi đó, các giống ngô địa
phương chủ yếu tập trung ở khu vực miền núi phía Bắc và đang đứng trên nguy
cơ bị xói mòn quỹ gen. Diê ̣n tić h, năng suấ t , sản lượng ngô trong 5 năm (20112015) gầ n như tăng không đáng kể (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Diê ̣n tích, năng suấ t và sản lượng ngô trong 5 năm (2011 - 2015) ở
Việt Nam

Diện tích (1000 ha)
Năng suất (tạ/ha)
Sản lượng (1000
tấn)

2011

2012

2013

2014

2015

1121,3

1156,6

1179,5

1200,0

1300,0

43,1

43,0

44,3

44,5

45,0

4835,6

4973,6

5188,5

5625,0

5980,0

“Nguồn: Bản đồ thương mại thế giới” [42]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


8

Năng suất giống ngô địa phương thường thấp nhưng có ưu điểm như chất
lượng cao, khả năng chịu hạn và kháng sâu bệnh tốt và có thể gieo trồng trên
nhiều loại đất khác nhau. Vì vậy, việc sưu tập, nghiên cứu và đánh giá một cách
toàn diện nguồn gen các giống ngô địa phương là hết sức cần thiết cho công tác
giống, và bảo tồn nguồn gen quý.
1.2. NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY PHÔI NGÔ
1.2.1. Lịch sử về nuôi cấy phôi ngô
Lịch sử nuôi cấy in vitro cây ngô được bắt đầu từ rất sớm vào những năm
1930, khi Lampe và Mills nuôi cấy nội nhũ và phôi non trong môi trường có bổ
sung dịch chiết khoai tây [49], nhưng mô chỉ sinh trưởng có giới hạn. Lần đầu
tiên nuôi cấy liên tục trong một thời gian dài là nghiên cứu của Larue , phôi non
và phôi trưởng thành của ngô được nuôi cấy để xác định nhu cầu dinh dưỡng cho
sự sinh trưởng và phát triển [22].
Tái sinh cây từ phôi non hoặc bộ phận khác của những loài ngũ cốc lần đầu
tiên được miêu tả trong những năm 1960 đến 1980 [36]. Phôi non đã được sử

dụng làm nguồn vật liệu chính trong các nghiên cứu nuôi cấy mô ngô. Lu sử dụng
phôi có kích thước 1 - 1,5 mm thu được sau 2 tuần thụ phấn được cấy vào môi
trường MS bổ sung 2,4-D từ 0,25 đến 2,0 mg l-1 và sucrose từ 3 đến 12% [23].
Năm 1987, Wang đã tái sinh thành công từ phôi trưởng thành của hai
dòng B73 và Mo17, nhưng khả năng tái sinh phụ thuộc nhiều vào kiểu gen và tỉ
lệ tái sinh rất thấp (4 – 5 %). Đối với dòng ngô A632 đã không thu được cây tái
sinh [38].
Năm 1989, Vain và cs đã đánh giá ảnh hưởng của ethylene trong nuôi cấy
mô, AgNO3 được sử dụng nhu một chất ức chế hoạt động của ethylene. Tỉ lệ tạo
mô sẹo dạng II (mô sẹo xốp, vàng, cho tỉ lệ tái sinh cao) được nâng cao khi phôi
non được nuôi cấy trong môi trường MS chứa AgNO3 từ 5 đến 20 mg/l. Nghiên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


9

cứu đã chỉ ra rằng khả năng tái sinh của mô sẹo trong môi trường có AgNO3
được tăng cao [36].
Năm 2004, Zhang và cs đã nghiên cứu 15 dòng ngô Tangsipingtou thuần
bằng nuôi cấy in vitro để đánh giá ảnh hưởng của kiểu gen, môi trường, chất
kích thích sinh trưởng và phương pháp tạo mô sẹo có nguồn gốc từ phôi non và
tái sinh cây. Nghiên cứu cho thấy mô sẹo có thể được tạo ra từ tất cả 15 dòng
được thử nghiệm và khả năng tái sinh cây giảm đến một mức độ nhất định cùng
với sự già hóa của mô sẹo [41].
Shohael và đồng tác giả (2003) tiến hành nghiên cứu trên 3 dòng CML161; CML-323; CML-327. Phôi non được nuôi cấy trên môi trường N6, tỉ lệ tạo
mô sẹo giao động từ 56,33 đến 72,0 %. Kết quả cho thấy môi trường đạt tỉ lệ mô
sẹo cao nhất (72,0 %) là môi trường N6 có bổ sung L-proline 2,3 g/l, casein
hydroysate 200 mg/l và 2,4-D 1,0 mg/l. Khi nuôi cấy trong môi trường MS, tỉ lệ
mô sẹo được tạo ra từ 39,0 đến 68,66 %. Môi trường cho tỉ lệ mô sẹo cao nhất

(68,66%) là MS có bổ sung L-asparagine 150 mg/l, thiamin 50 mg/l và 2,4-D
mg/l. Cây được tái sinh thành công trong môi trường MS và N6 không bổ sung
chất điều hòa sinh trưởng đạt lỉ lệ tương ứng là từ 52,83 đến 61,0 % và từ 35,66
đến 42,49 % [29].
Năm 2004, Huang và Wei đã tái sinh cây thành công từ phôi trưởng thành
của 7 dòng ngô nội phối với tần số tương đối cao (19,8 - 32,4 %). Và đặc biệt
với dòng Mo17 đạt 25,6% [18].
Binott và cs (2005) nuôi cấy phôi non từ 12 dòng ngô bố mẹ thuần chủng
và con lai tương ứng của chúng để đánh giá khả năng tạo mô sẹo, phôi hóa và tái
sinh cây. Hạt non thu ở các giai đoạn khác nhau 10, 15, 18, 21 và 24 ngày tuổi
sau khi thụ phấn và được khử trùng bề mặt. Phôi non được cấy vào môi trường
tạo mô sẹo bao gồm môi trường cơ bản N6 bổ sung 2,4-D 0 - 2 mg/l; L-proline
2,87 g/l; casein hydrosate 0,1 g/l, glycine 2 g/l, sucrose 30 g/l và gelrite 3 g/l. Mô

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


10

sẹo được hình thành ở nồng độ 2,4-D 2 mg/l từ 80 đến 90 % đối với phôi non
của con lai và từ 50 đến 80 % từ phôi non của dòng bố mẹ. Khả năng phôi hóa
được tiến hành ở 6 dòng thuần và 4 dòng lai. Tuy nhiên cây chỉ tái sinh được ở 4
dòng thuần và 3 dòng lai [5].
Năm 2011, Gorji và đồng tác giả đã nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo và
tái sinh cây của 6 dòng ngô thuần là B73, Oh28, Va35, Gss0966, Vog134 và
Hi34. Kết quả cho thấy trong môi trường N6 cho tần số tạo mô sẹo cao nhất khi
bổ sung Dicamba 2 mg/l, trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D ở nồng độ 1
mg/l thì cho tần số tạo mô sẹo cao nhất. Mặt khác, môi trường N6 có bổ sung
Dicamba thúc đẩy quá trình tạo mô sẹo cao hơn so với môi trường N6 bổ sung
2,4-D cả về tỉ lệ cũng như chất lượng của mô sẹo. Trong 6 dòng ngô được thử

nghiệm thì dòng Va35, Gss0966, Vag134 và Hi34 có mô sẹo tốt nhất. Bên cạnh
đó, dòng Va35 có tỷ lệ hình thành chồi từ các mô cấy cao hơn là dòng Vog134.
Kết quả nghiên cứu còn cho thấy tỉ lệ hình thành rễ cao nhất trên khi đưa chồi
vào môi trường MS có bổ sung NAA 2 mg/l. Mô cấy của hai dòng Va35 và
Vog134 trên môi trường MS có bổ sung BAP 1 mg/l và IAA 0,5 mg/l thúc đẩy
tần số hình thành chồi cao, tỉ lệ tái sinh cây đạt từ 53 đến 67% [16].
Ở Việt Nam, cây ngô cũng được nghiên cứu nuôi cấy nhằm phục vụ cho
việc chuyển gen. Năm 2005, Phạm Thị Lý Thu đã nghiên cứu xây dựng hệ thống
tái sinh từ phôi non ngô. Kết quả nghiên cứu cho thấy tần số tạo mô sẹo của 2
dòng ngô HR8 và HR9 đạt 75,2 % và 74,1 %, tỷ lệ tái sinh cây đạt 24,9 % và
21,4 % [1]. Năm 2009, Nguyễn Văn Đồng và cs đã tiến hành nghiên cứu khả
năng tái sinh từ phôi non của 45 dòng ngô Việt Nam thuộc 3 nhóm ngô tẻ, ngô
nếp và ngô ngọt, sử dụng dòng đối chứng là dòng ngô mô hình HR8 có khả năng
tái sinh cao. Kết quả nghiên cứu thu được 4 dòng ngô tẻ VH1, VH11, VH19,
VH29; 3 dòng ngô nếp VHN9, VHN10, VHN16 và 2 dòng ngô ngọt VHD2,
VHD5 có khả năng tái sinh cao đồng thời mang một số đặc tính nông học tốt
được sử dụng làm nguồn vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen [1].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


11

1.2.2. Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng và thành phần môi trƣờng
đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở ngô
1.2.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng
Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô cây ngũ cốc
đã được Bhaskaran và smith (1990) tổng kết. Nhìn chung, chất điều hòa sinh
trưởng nhóm auxin, điển hình là 2,4-D với nồng độ khoảng 1 – 3 mg/l là cần
thiết cho sự hình thành mô sẹo phôi hóa từ phôi hợp tử. 2,4-D là yếu tố quan
trọng trong sự khởi đầu và phát triển của mô sẹo và mô sẹo có khả năng tạo phôi

từ phôi ngô non [50].
Garcial và cs (1991) đã nuôi cấy phôi non giống ngô Ever Green trong
môi trường có bổ sung 2,4 D ở các nồng độ khác nhau và thấy rằng nồng độ
2,4D 0,1 mg/l cho tần số tạo mô sẹo cao nhất [15]. Nghiên cứu tạo mô sẹo và tái
sinh cây từ phôi non dòng ngô lai F1 (M947 x M948) và (M950 x M951) của
Das và cs (2001) cho thấy môi trường MS có bổ sung 2,4 D 2 mg/l là hiệu quả
nhất [11].
Shohael và cs (2003) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D đến sự
tạo mô sẹo của 3 dòng ngô CML-161; CML-323; CML-327 và đưa ra kết luận ở
nồng độ 1,0 mg/l cho tỉ lệ mô sẹo cao nhất [29].
Việc sử dụng chất điều hòa sinh trưởng nhóm cytokinin kết hợp với auxin
trong quá trình hình thành phôi soma từ các mẫu mô sẹo của các cây ngũ cốc
cũng đã được nghiên cứu. Theo Cho và cs (1998), bổ sung BAP 0,1 mg/l kết hợp
với 2,4 D 2 mg/l vào môi trường nuôi cấy là rất cần thiết đối với sự hình thành
và duy trì mô sẹo phôi hóa [10].
Số mô sẹo tạo thành đạt giá trị cao nhất khi nuôi cấy phôi non trong môi
trường có bổ sung 2,4D nồng độ 0,1 mg/l kết hợp với kinetin 0,05 mg/l [14].
Trong nghiên cứu của Huang và Wie (2004) cũng cho thấy việc bổ sung 2 mg/l
2,4 D kết hợp với BAP 0,2 mg/l vào môi trường nuôi cấy đã làm tăng đáng kể
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


12

hiệu quả tạo mô sẹo phôi hóa từ phôi hóa từ phôi non của 2 dòng ngô nội phối
C8605 và 9046 [18].
1.2.2.2. Ảnh hưởng của nitrat bạc
Vain và cs (1989) là người đầu tiên nghiên cứu sau về ảnh hưởng của
nồng độ AgNO3 đến khả năng tạo mô sẹo dạng II. Tác giả nhận thấy tỷ lệ mô sẹo
dạng II được tăng lên khi phôi non được nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung

AgNO3 (0, 5, 10 và 20 mg/l) và AgNO3 không ảnh hưởng đến sự phát triển của
mô sẹo [34]. Nitrat bạc được sử dụng như một chất ức chế hoạt tính của ethylen
nội sinh. Ethylen được hình thành trong quá trình nuôi cấy in vitro và ảnh hưởng
tới sự phân chia và biệt hóa của tế bào. Do vậy, việc bổ sung nitrat bạc vào môi
trường nuôi cấy đã có tác dụng kích thích sự tạo thành mô sẹo và tái sinh cây
[30].
1.2.2.3. Ảnh hưởng của proline
Vai trò của L-proline trong việc duy trì mô sẹo xốp và mô sẹo có khả
năng tạo phôi ở ngô đã được Armstrong và Green nghiên cứu ở dòng ngô A188.
Tác giả đã tạo mô sẹo và duy trì hơn một năm mà mô sẹo vẫn xốp và không mất
khả năng phôi hóa. Tỷ lệ tạo mô xốp và mô sẹo phôi hóa tăng tỷ lệ với bổ sung
L-proline đến 25 mM vào môi trường N6 [4]. Binott và cs (2005) đã nhận định
rằng nồng độ 1,87 g/l (khoảng 10 mM) L-proline cho kết quả tạo mô sẹo tốt nhất
[5].
1.2.2.4. Vai trò của đường
Với vai trò là nguồn năng lượng cho sinh trưởng dị dưỡng của tế bào thực
vật, đường sucrose thường được sử dụng trong các nghiên cứu nuôi cấy mô. Tuy
nhiên, với một số loài, glucose tỏ ra thích hợp hơn [7].
Garcial và Molina (1988) đã nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng
sucrose khác nhau đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi ngô non có kích thước thay

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


13

đổi từ 1,2 đến 4 mm. Nồng độ sucrose 5% là nồng độ thích hợp nhất có ảnh
hưởng rõ rệt đến quá trình nuôi cấy phôi có kích thước nhỏ [14]. Các nghiên cứu
khác cho thấy, nồng độ sucrose thấp dưới 2% kích thích sự hình thành mô sẹo
dạng II, nồng độ sucrose 6% kích thích sự hình thành mô sẹo dạng I [4]. Ngoài

ra, có thể tạo mô sẹo dạng 2 từ mô sẹo dạng I bằng cách giảm hàm lượng đường
trong môi trường nuôi cấy [35].
Bronsema và cs (1997) đã sử dụng đường sorbitol thay thế đường sucrose
trong môi trường nuôi cấy phôi non dòng ngô A188 và thấy rằng sorbitol có tác
dụng kích thích khả năng tạo mô sẹo phôi hóa từ phôi non của dòng ngô này [6].
Nhằm cải thiện tần số tạo mô sẹo dạng II từ phôi non nuôi cấy của dòng ngô
chọn lọc Stine 963, Wilson và Held (2002) đã sử dụng kết hợp đường sucrose 20
(g/l) và 13 loại đường khác nhau với hàm lượng 10 mg/l trong môi trường tạo
mô sẹo. Kết quả thu được cho thấy, môi trường có bổ sung g/l đường sucrose và
10 g/l glucose cho hiệu quả tạo mô sẹo dạng II cao nhất (75%), tiếp đến là sự
phối hợp của sucrose với các loại đường maltose, lactose, sorbitol và mannitol
(50-60%) [40]. Frame và cs (2002) đã áp dụng công thức môi trường này trong
phòng thí nghiệm chuyển gen nhờ Agrobacterium vào phôi non dòng ngô A188
và cũng đã nhận được kết quả tương tự đối với sự hình thành mô sẹo dạng II từ
các phôi non sau khi biến nạp [12].
1.3. CHUYỂN GEN Ở NGÔ THÔNG QUA AGROBACTERIUM
1.3.1. Chuyển gen thông qua Agrobacterium
Vào những năm đầu thế kỷ XIX, nhận thấy ở một số cây hai lá mầm xuất
hiện những nốt sần hay khối u và đã phân lập được một loài vi khuẩn và đặt tên
cho chúng là Agrobacterium tumefaciens (sau đó người ta tìm thấy một loại
Agrobacterium gây bệnh rễ tơ ở thực vật, đó là A. rhizogenes, chúng làm mất
khả năng điều khiển sự phát triển của rễ dẫn đến sự tăng sinh khối và phân
nhánh cao tạo ra rất nhiều rễ tơ (còn
̣ gọi là bệnh rễ tóc) gọi là A. rhizogenes. Qua

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


14

nhiều công trình nghiên cứu, các nhà khoa học đă xác định, ở những tế bào của
cây bị tổn thương, A. tumefaciens có khả năng xâm nhiễm và kích thích tạo khối
u tại vị trí đó. Các khối u là nơi cư trú và cung cấp các chất cần thiết cho quá
tŕnh sinh trưởng và phát triển của A. tumefaciens trong tế bào thực vật.
Khi phân tích khối u, người ta thấy trong nó có các chất lạ chưa hề có
trong đó như các axit amin lạ như octopin, nopalin. Khối u không ngừng phát
triển kể cả khi diệt hết vi khuẩn. Như vậy, chứng tỏ vi khuẩn đã chuyển vào
trong cây một tác nhân gây khối u và sản sinh ra vật chất lạ, tác nhân có bản
chất là vật chất di truyền. Khi nghiên cứu vi khuẩn này, người ta thấy trong vi
khuẩn có chứa một plasmid có kích thước lớn mà nếu xử lí vết thương cho cây
bằng vi khuẩn không chứa plasmid thì không gây khối u, còn nếu chữa vết
thương bằng vi khuẩn có chứa plasmid thì gây ra khối u. Như vậy có thể nói
plasmid chính là tác nhân gây khối u và sản sinh ra vật chất lạ do vi khuẩn chuyển
vào, plasmid này được gọi tên là Ti-plasmid. Sự hình thành khối u xảy ra ở nhiệt
độ từ 280C - 300C, trùng với nhiệt độ chuyển plasmid trong quá trình tiếp hợp của
vi khuẩn. Khả năng tạo khối u bị mất đi khi vi khuẩn sinh trưởng ở 360C. Người ta
cũng phát hiện thấy khả năng gây độc của vi khuẩn mất đi cùng với sự biến mất
của một plasmid cỡ lớn, plasmid gây tạo khối u hay Ti-plasmid [39].
Năm 1980, lần đầu tiên DNA ngoại lai (transposon Tn7) được chuyển vào
thực vật nhờ A. tumefaciens, tuy nhiên T-DNA vẫn chưa được thay đổi. Năm
1983, nhiều nhóm nghiên cứu đã biến đổi T-DNA và đưa DNA ngoại lai vào, tạo
ra tính kháng một số chất kháng sinh. Ngoài ra, các gen tạo khối u được cắt ra.
DNA ngoại lai cùng với phần còn lại được chuyển vào thực vật và được biến
nạp. Thành công này nhờ nghiên cứu chính xác con đường lây nhiễm của A.
tumefaciens trước đó và khả năng của hệ thống chọn lọc đối với thực vật.
Phương pháp chuyển gen vào thực vật thông qua Agrobacterium ban
đầu không được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm. Tuy nhiên, đã có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

15

nhiều cố gắng trong việc cải tiến khả năng tái sinh đối với các cây một lá
mầm, những mô sẹo lây nhiễm với Agrobacterium được sinh ra từ mô rễ [8]
và phôi chưa trưởng thành đã được sử dụng [9]. Chuyển gen vào cây một lá
mầm thông qua A. tumefaciens là bước đột phá của công nghệ gen. Đây là kỹ
thuật chuyển gen được ưa chuộng nhất vì có nhiều ưu điểm so với chuyển gen
bằng phương pháp bắn gen như cho nhiều sự kiện chuyển gen ổn định, ít bản
sao, thể hiện đúng, tăng tần số đồng biểu hiện và ít có sự tái sắp xếp gen chuyển
nạp. Đến nay, các quy trình chuyển gen hiệu quả đã được xây dựng cho các cây
một lá mầm như lúa), lúa mì, lúa miến... Chuyển gen vào phôi non ngô dòng
A188 thông qua A.tumefaciens được tiến hành bởi Ishida [19]. Năm 2002, Frame
và cs đã chuyển gen vào phôi non dòng ngô Hi II [12].
1.3.2. Nghiên cứu chuyển gen vào phôi ngô
Kể từ khi đưa ra thi ̣trường sản phẩm ngô chuyển gen Bt đầu tiên vào giữa
năm 1990, ngô đã trở thành một trong những cây mục tiêu quan trọng nhất cho
sự đổi mới công nghệ sinh học. Thế hệ của cây chuyển gen là bước tiến rất quan
trọng trong việc phát triển các sản phẩm có đặc điểm sinh học mới. Công nghệ
chuyển gen vào ngô đã đạt được nhiều tiến bộ to lớn khi báo cáo đầu tiên về sử
dụng thành công các phương pháp dung hợp tế bào trần và tiêu tốn nhiều thời
gian đã làm cho việc chuyển gen vào ngô đơn giản và đáng tin cậy hơn [28].
Hiệu quả của hệ thống chuyển gen thông qua Agrobacterium đã được thể hiện
khi tạo ra các dòng thuần A188 [18].
Phương pháp đầu tiên sử dụng thành công để biến đổi các tế bào ngô hấp
thụ trực tiếp DNA là công nghệ tế bào trần, khi các gen chuyển tích hợp ổn định
đã được chứng minh qua mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào trần. Tuy nhiên, đến
năm 1988 cây ngô chuyển gen đầu tiên mới được công bố do chưa có hệ thống
tái sinh hiệu quả. Trong số nhiều nghiên cứu thử nghiệm các vật liệu chuyển gen
cho thấy phôi chưa trưởng thành đã được chứng minh là nguồn nguyên liệu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


16

chuyển gen hiệu quả. Tế bào trần được phân lập từ phôi ngô có nguồn gốc từ
giống lai cùng dòng A188 và một dòng tự nhiên ưu tú, được nuôi cấy trên giấy
lọc qua một lớp dinh dưỡng để tái sinh. Tế bào trần bắt nguồn từ A188 đã được
chuyển thành công plasmid chứa gen maker nptII và gen kháng kanamycin [28].
Không lâu sau khi các công bố chuyển gen thành công bằng kỹ thuật sử
dụng tế bào trần, kỹ thuật súng bắn gen đã được chứng minh hiệu quả thành
công cao hơn để biến nạp vào phôi hay mô sẹo, các maker chọn lọc có thể là
BAR, ALS hoặc HPT [13]. So với các sự kiện biến đổi gen đầu tiên, sử dụng kỹ
thuật bắn gen thu được mô sẹo đã cải thiện khả năng sinh sản. Sử dụng súng bắn
gen đã cải thiện được thời gian sản xuất cây trồng biến đổi gen vì thời gian nuôi
mô sẹo được rút ngắn rất nhiều.
Vào giữa năm 1980, Agrobacterium được chứng minh rằng có thể làm
trung gian chuyển DNA vào tế bào ngô. Một vài năm sau đó, Gould chuyển gen
thành công vào ngô. Tuy nhiên phương pháp này không được phát triển rộng rãi
cho đến khi Ishida mô tả việc sử dụng phôi chưa trưởng thành như là mục tiêu
chuyển gen với một chủng Agrobacterium chứa một vector nhị thể với các gen
vir từ pTiBo542. Từ đó phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium đã
được áp dụng rộng rãi bởi nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới để sản xuất ngô
chuyển gen, nghiên cứu các đặc điểm và phát triển thương mại [28].
Các marker chọn lọc thuốc diệt cỏ thường được ưa thích trong việc tạo
các dòng ngô chuyển gen. Các dòng ngô chuyển gen dễ dàng được theo dõi khi
chọn lọc bằng thuốc diệt cỏ. Hệ thống maker chọn lọc một số loại thuốc diệt cỏ
đã được phát triển trong ngô bao gồm BAR / PAT, ALS, EPSPS, PPO và AAD1. Từ cuối thập niên 1990 một số hệ thống marker chọn lọc đã được phát triển để
làm giảm bớt mối lo ngại xung quanh việc sử dụng các gen kháng kháng sinh

hoặc thuốc diệt cỏ, mặc dù không có bằng chứng về chuyển theo chiều ngang
của các gen từ cây chuyển gen đối với các loài thực vật khác. Các hệ thống đánh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


17

dấu mới được dựa trên đường hoặc chuyển hóa axit amin. Đây là một bước tiến
bộ đáng kể để phát triển hệ thống chọn lọc dòng ngô chuyển gen [28].
Chuyển gen vào phôi non ngô dòng A188 thông qua A. tumefaciens được
tiến hành bởi Ishida [19]. Năm 2002, Frame và cs đã chuyển gen vào phôi non
dòng ngô Hi II [12]. Ishida và cs đã đưa ra một quy trin
̀ h hoàn chỉnh có thời gian
là 3 tháng bắt đầu từ lúc gây nhiễm và đồng nuôi cấy vào phôi non của ngô [20].
Theo phương pháp này, 50% phôi non dòng A188 và 15% phôi non dòng A634,
H99 và W117 đã được chuyển gen thành công. Nửa số cây tái sinh từ phôi non
này cho hy vọng sẽ tạo ra thế hệ thứ 2 và thứ 3. Hơn 90% số cây chuyển gen có
kiểu hình cũng như tính trạng nông học bình thường. Cùng với mục đích chuyển
gen tăng năng suất của cây ngô, các nhà khoa học Trung Quốc đã dùng kỹ thuật
gen tác động vào ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) nhằm tăng quá
trình tổng hợp từ glucose thành tinh bột. Wang và cs (2007) đã chuyển vector
CAMBIA3301 mang gen glgC vào phôi non của dòng Zong3, sau 3 thế hệ cho
thấy hàm lượng tinh bột trong hạt đã tăng từ 13 đến 25% [44].
Vega và cs (2008) đã chuyển vector pCAMBIA3301 và pZY101 vào dòng
Hi-II vào phôi non, thời gian đồng nuôi cấy là 3 ngày ở nhiệt độ 200C trên môi
trường đồng nuôi cấy bổ sung 100 µM acetosyringone. Tần số trung bình chuyển
gen thành công là 12% và tỉ lệ cao nhất là 18% [45].
Năm 2009, Kim và cs đã sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua A.
tumefaciens vào phôi non để tạo cây ngô chuyển gen kháng chất điệt cỏ [46].

Takava và cs (2010) đã chuyển vector pCAMBIA3301 vào 4 dòng ngô thuần
S61, B73, Mo17, A188 và 2 dòng ngô lai HiIIB và HiIIC thông qua A.
tumefaciens LBA4404 [28]. Các tác giả đã lấy phôi có kích thước trung bình từ
1,5 đến 2 mm đồng nuôi cấy với A. tumefaciens LBA4404 trong 72 giờ (3 ngày)
và sử dụng MES, timentin và PPT để diệt và chọn lọc mẫu được gây nhiễm, tạo
mô sẹo và tái sinh cây. Hai dòng S61 và A188 cho kết quả tái sinh cao nhất.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


18

PCR để phát hiện gen gus và bar trong hệ gen của cây tái sinh. Tần số xuất hiện
hai gen này là 6.45% đối với dòng S61. Năm 2010, Anima và cs cũng chuyển
hai vector pXBb7-SI-UBIL và pBbm42GW7_GUS vào phôi non của 3 dòng ngô
TL26, CML216 và CML244 với môi trường đồng nuôi cấy có nồng độ cao hơn
các nghiên cứu khác (200 µM acetosyringone) và cũng tạo ra được cây chuyển
và và đời con lai của các dòng chuyển gen trên. Với việc chuyển gen vào phôi
non, Frame và cs (2011) đã xây dựng được một quy trình chuyển gen đối với 2
dòng ngô Hi-II và B104. Trong quy trình này, tác giả đã không sử dụng A.
tumefaciens được nuôi lỏng lần 2 với OD660= 0.6 - 0.8 mà tác giả sử dụng trực
tiếp khuẩn lạc được hòa tan trong môi trường tạo mô sẹo để dung dịch đạt tới
OD550= 0.3 – 0.4 [12].
Li và cs (2011) cũng chuyển gen Bt2 và Bt2 vào ngô để tăng trọng lượng
hạt cũng như hàm lượng tinh bột cho cây chuyển gen nhưng tác giả lại tiến hành
chuyển gen vào đỉnh sinh trưởng của hai dòng ngô Chang7-2 và Ye478 [47]. Kết
quả nghiên cứu đã thu được những hạt ngô chuyển gen có khối lượng tăng 15%
so với hạt ban đầu và hàm lượng tinh bột là 74%, trong khi giống ban đầu có
hàm lượng tinh bột là 65%. Năm 2012, Wang và cs đã phát triển một công nghệ
rất hiệu quả và giản đơn về chuyển nạp gen trong cây bắp (maizegenetic

transformation) [48]. Sử dụng sinh mô từ chồi của hai dòng bắp cận giao bao
gồm dòng mẹ Tian Tawu và 7922. Gen mã hóa phytoene synthase (psy) được
chuyển vào cây bắp thông qua Agrobacterium. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu
quả chuyển nạp được tạo điều kiện tối ưu trong nghiên cứu này. Kết quả cho
thấy điều kiện chuyển nạp tối ưu chính là thời gian nhiễm (infection time) trong
chân không, 20 phút, và thời gian đồng nuôi cấy trong 3 ngày. Phân tích RTPCR và HPLC cho thấy gen psy được hợp nhất vào genome cây bắp. Hàm lượng
carotenoid tổng số trong cây bắp chuyển gen tăng 25% so với giống nguyên
thủy. Phương pháp này làm giảm tiến trình cồng kềnh trong nuôi cấy mô truyền
thống và chứng tỏ đây là phương pháp chuyển nạp gen đơn giản. Kim và cs
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


19

(2012) cũng đã chuyển gen ApxIIA mã hóa ApxII toxin vào phôi non dòng ngô
HiII với mục đích tạo vaccine ở thực vật [46].
Ở Việt Nam hiện nay đã sử dụng rộng rãi phương pháp biến nạp gen vào
Agrobacterium để chuyển vào cây trồng rất nhiều và đem lại các thành tựu đáng
kể như: đã chuyển được gen cryIA kháng sâu xanh Heliothis armigera vào cây
hông và cây cải ngọt thông qua A. tumefaciens EHA 105 (Lê Tấn Đức và cs,
2007) [51], đã chuyển được gen kháng thuốc diệt cỏ và kháng côn trùng chích
hút vào cây thuốc lá nhờ A. tumefaciens LBA 4404 (Phạm Thị Hạnh và cs, 2007)
[52], thử nghệm thành công quy trình biến nạp gen bằng phương pháp sử dụng
chủng A. tumefaciens C58pGV2260 (Trần Lê Lưu Ly và cs, 2008)… và nhiều
nghiên cứu có giá trị khác.
Các nghiên cứu về chuyển gen ngô nhờ Agrobacterium đã được thực hiện
chủ yếu với mục đích kháng sâu bệnh và thuốc trừ cỏ. Theo báo cáo khoa học
của Viện Di truyền nông nghiệp đã tạo được 6 dòng ngô GA35 mang gen nptII
bằng phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium (Lê Huy Hàm, 2006)
[53]. Chưa có kết quả nghiên cứu nào về việc sử dụng kỹ thuật gen làm tăng

năng suất ngô thông qua tăng chất lượng cũng như trữ lượng tinh bột. Phạm Thị
Lý Thu (2007) đã nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và xác định
phương pháp chuyển gen thích hợp ở ngô ở hai dòng ngô HR8 và HR9, tác giả
nhận định rằng chuyển gen bằng súng bắn gen có hiệu quả cao nhất đối với hai
dòng ngô nghiên cứu [1].
Đinh Văn Trình và cs sử dụng A. tumefaciens EHA105 chứa vector
pBiG.ubi mang gen chịu hạn – ZmDREB2A và gen kháng hygromycin hpt [2].
Nhóm tác giả sử dụng râu ngô đã được cách ly tiếp xúc với dịch huyền phù vi
khuẩn trước khi thụ phấn của cùng dòng. 135 bắp (13145 hạt thế hệ đầu tiên T0)
đã thu được trong vụ đông xuân năm 2006 – 2007. Cây con chuyển gen giai
đoạn 2 - 3 lá được sàng lọc bằng điều kiện khô hạn. Phép thử tính kháng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


20

hygromycin và phân tích PCR trên 59 cây T 0 sau xử lý hạn cho thấy hiệu quả
chuyển gen ở thế hệ T0 đạt 0,023%.
1.3.3. Chuyển gen gus ở ngô
1.3.3.1. Gen gus và nghiên cứu chuyển gen gus
Gen β-glucuronidase (gus) được phân lập từ chủng E. Coli RA201. Gen
gus là gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β-glucuronidase
là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải
có màu xanh lam đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronidase thường dùng nhất
trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus là X-gluc (5-bromo-4-chloro3-indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-gluc không màu dưới tác động của
enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh lam. Nhờ khả năng này mà
các nhà khoa học đã thiết kế gen gus vào các vector chuyển gen để làm chỉ thị dễ
nhận biết ở mô, tế bào thực vật mang gen chuyển [13].
Có nhiều vector chuyển gen vào thực vật được thiết kế có mang gen gus

như pB1121, pCAM301,… nhưng nhược điểm của các vector này là không được
thiết kế đoạn intron ở đầu 5’ trước gen gus. Vì vậy khi nhuộm X-gluc gen gus
biểu hiện trong cả tế bào vi khuẩn và trong cả tế bào thực vật, điều này gây khó
khăn cho việc nhận biết chính xác sự có mặt của gen gus trong mô tế bào thực
vật. Để khắc phục nhược điểm này, vector pPTN289 đã được thiết kế thêm đoạn
intron ở đầu 5’ trước gen gus. Vì thế, khi phân tích gen gus, màu xanh chàm chỉ
biểu hiện trong mô tế bào thực vật mà không biểu hiện trong vi khuẩn khi có mặt
của cơ chất X-gluc [14].
1.3.3.2. Phương pháp phân tích cây chuyển gen mang gen chỉ thị gus
Hiện nay trên thế giới và trong nước sử dụng khá nhiều biện pháp để kiểm
tra sự có mặt của gen mục tiêu trong cây trồng chuyển gen. Các phương pháp
đánh giá thường gặp là: PCR, nhuộm gus, lai Northern, lai Southern, lai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


21

Western… Mỗi phương pháp đánh giá có một ưu, nhược điểm riêng và phạm vi
áp dụng khác nhau.
Phương pháp PCR do Kary Mullis và cs phát minh công bố vào tháng 10
năm 1985 được cho là bước tiến bộ vượt bậc của công nghệ gen. Nguyên lý PCR
dựa vào sự biến tính, hồi tính và nguyên lý tổng hợp của DNA. Phương pháp này
thường được áp dụng rộng rãi trong công nghệ gen do thời gian thực hiện nhanh,
độ chính xác cao, thực hiện đơn giản, ít tốn kém.
Nhuộm gus là phương pháp phát hiện gen dựa vào chỉ thị sàng lọc βglucoronidaza. Nguyên lý của phương pháp này là: β-glucoronidaza phản ứng
với X-gluc ở 370C tạo ra các dẫn xuất indoxyl, các dẫn xuất này tác dụng với O 2
tạo ra sản phẩm nhuộm màu chàm.
Southern blot là phương pháp lai DNA được Southern đề xuấ t năm 1975,
sử dụng mẫu DNA dò đánh dấu phóng xạ hoă ̣c đánh dấu bằng biotin, huỳnh

quang hoặc đánh dấu enzyme alkaline phosphate để hạn chế mức độ ô nhiễm
môi trường. Phương pháp này có ưu điểm là phát hiện được sự hiện diện, kích
thước, số lượng bản sao, tính đồng dạng DNA trong một phức hợp. Northern
blot là phương pháp lai RNA với mẫu dò . Phương pháp lai Northern cho phép
xác định được sự có mặt, kích thước, trọng lượng phân tử, khối lượng của
mRNA trong các mẫu khác nhau. Western blot là phương pháp lai protein, có độ
nhạy cao dựa trên đặc tính đặc hiệu của kháng thể để phát hiện protein đã được
điện di trên gel. Phương pháp này giúp xác định sự có mặt, trọng lượng phân tử,
định lượng protein tái tổ hợp có mặt trong các mẫu khác nhau.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


22

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.1.1. Vật liệu
Sử dụng phôi non của giố ng ngô LVN 99 do Trung tâm giống cây trồng
Sơn La cung cấp làm vâ ̣t liê ̣u nhâ ̣n gen .
Chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58/pGV2260 mang vector pCB-gusplus
chứa gen chỉ thi ̣ gus do Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam cung cấp.

Hình 2.1. Sơ đồ vector pCB-gusplus
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
Hóa chất: Các hóa chất sử dụng đều đảm bảo độ tinh khiết cho nghiên cứu, nhập
từ các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck… Các hóa chất chính bao gồm: thành

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


23

phần của môi trường cơ bản N6, các chất kháng sinh như kanamycin, cefotaxin,
rifamicin, BAP, NAA, 2,4-D, AgNO3, L-proline, casein hydrolysate, sucrose,
glucose, acetosyringone. Các môi trường nuôi cấy mô được sử dụng theo Frame
và cs (2002) bao gồm: Môi trường lây nhiễm và đồng nuôi cấy (A1), môi trường
chọn lọc lần 1 (A2), môi trường chọn lọc lần 2 (A3), môi trường phục hồi (A4),
môi trường tái sinh chồ i (A5) và môi trường tạo rễ (A6).
Bảng 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy
Môi trƣờng

Thành phần môi trƣờng
N6; 2,4-D 2 mg/l, AgNO3 10 mg/l, L-proline 2,3 g/l, casein

A1

hydrolysate 100 mg/l, sucrose 20 g/l, glucose 10 g/l,
acetosyringone.
N6; 2,4-D 2 mg/l, AgNO3 10 mg/l, L-proline 2,3 g/l, casein

A2

hydrolysate 100 mg/l, sucrose 20 g/l, glucose 10 g/l, cefortaxin
500 mg/l, kanamycin.
N6, 2,4-D 0 – 3 mg/l, AgNO3 0 – 20 mg/l, L-proline 0 - 2,3 g/l,

A3

casein hydrolysate 100 mg/l, sucrose 20 g/l, glucose 10 g/l,
cefortaxin 150 mg/l, kanamycin.

A4

N6, 2,4-D 2 mg/l, AgNO3 15 mg/l, L-proline 1,15 g/l, casein
hydrolysate 100 mg/l, sucrose 20 g/l, glucose 10 g/l.

A5

N6, BAP 2 mg/l, sucrose 60 g/l, agar 7,5 g/l.

A6

½ N6, NAA 2 mg/l, sucrose 30 g/l, agar 7,5 g/l.

Ghi chú: N6: môi trường cơ bản (phụ lục)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


24

Thiết bị: Các máy móc thiết bị được sử dụng thuộc Phòng Công nghệ tế bào
thuộc khoa Sinh học, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Thái Nguyên, như cân
phân tích 10-4g (Mettler Toledo), máy li tâm lạnh (Đức), tủ cấy vô trùng, tủ sấy
(Carbolite, Anh), nồi khử trùng (Nhật Bản), máy lắc ổn nhiệt 37 oC, kính hiển
vi…

2.1.3. Điạ điể m nghiên cƣ́u
Các thí nghiệm nghiên cứu nuôi cấy

in vitro, chuyể n gen và phân tić h kế t quả

chuyể n gen gus đươ ̣c thực hiê ̣n ta ̣i Phòng thí nghiê ̣m Công nghệ tế bà o, Bô ̣ môn
Di truyề n & Sinh ho ̣c hiê ̣n đa ̣i , khoa Sinh học, trường Đại học Sư Phạm – Đại
học Thái Nguyên.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xây dựng quy trình chuyển gen vào giống ngô LVN99 thông qua A.
tumefaciens
2.2.1.1. Xác định mật độ tế bào A. tumefaciens
Nuôi chủng A. tumerfaciens C58 chứa gen gus trên môi trường LB đặc có
bổ sung kanamycin (50 mg/l) và rifamicin (50 mg/l) trong tủ ổn nhiệt 28oC,
trong 48 giờ. Chọn khuẩn lạc mọc trên môi trường LB đặc và nuôi cấy trong LB
lỏng với chế độ lắc 2.000 v/p ở 28oC trong 16 - 18 giờ. Lấy dung dịch nuôi lỏng
lần 1 này (1 ml dung dịch khuẩn) nuôi trong 10 ml LB lỏng có bổ sung kháng
sinh kanamycin và rifamycin trong 4 tiếng. Ly tâm dung dịch nuôi lỏng lần 2,
loại bỏ dịch nổi rồi hòa tan cặn trong môi trường MS (Murashige và Skoog,
1962) [7] lỏng và pha loãng dịch với các mật độ tế bào vi khuẩn OD660nm 0,4;
0,6; 0,8; 1.0.
Phôi ngô non được gây tổn thương, ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn
trong 30 phút, có bổ sung acetosyringone sau đó thấm khô, cấy trên môi trường
đồng nuôi cấy A1 và phôi được nuôi trong tối 3 ngày.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


25

Phân tích sự biểu hiện gen gus tạm thời của các mẫu chuyển gen sau khi
đồng nuôi cấy theo phương pháp của Jefferson và cs (1987) [20].
2.2.1.2. Xác định nồng độ acetosyringone
Các bước nghiên cứu tiến hành như mục 2.2.1.1 nhưng khác là dung dịch
huyền phù A. tumefaciens được bổ sung chất dẫn dụ vi khuẩn AS với ba nồng độ
100 M, 150 M, 200 M.
2.2.1.3. Xác định tuổi phôi để làm vật liệu nhận gen
Phôi ngô ở các ngày tuổi: 8 ngày, 10 ngày, 12 ngày, 14 ngày, 16 ngày
đươ ̣c sử dụng làm vâ ̣t liê ̣u nhâ ̣n gen . Các bước nghiên cứu tiến hành như mục
2.2.1.1. Sau đó tiến hành phân tích sự biểu hiện gen gus tạm thời của các mẫu
chuyển gen sau khi đồng nuôi cấy theo phương pháp của Jefferson và cs (1987)
[20].
2.2.1.4. Xác định thời gian nhiễm khuẩn A. tumefaciens
Các bước nghiên cứu tiến hành như mục 2.2.1.1 nhưng khác là thời gian
ngâm phôi ngô trong dung dịch huyền phù A. tumefaciens có bổ sung AS với các
khoảng thời gian 5, 10, 20, 30, 40 phút.
2.2.1.5. Xác định nồng độ kháng sinh kanamycin thích hợp để chọn lọc cây
chuyển gen
Tiến hành chuyển gen gus thông qua A. tumefaciens CV58 với mật độ vi
khuẩn, nồng độ AS, loại vật liệu, thời gian nhiễm khuẩn đã được tối ưu ở mục
2.2.1.1 – 2.2.1.4. Các phôi sau khi nuôi trên môi trường đồng nuôi cấy A1, các
phôi được nuôi trên môi trường chọn lọc A2, bổ sung kanamycin với nồng độ
khác nhau (0, 25, 50, 75, 100, 150, 200 mg/l), để xác định nồng độ cho ngưỡng
chọn lọc.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN