Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐINH THỊ NGA

TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ
TIÊU CHẢY VÀ ĐỘC TỐ NÔN CỦA CHỦNG BACILLUS
CEREUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2015
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐINH THỊ NGA

TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ
TIÊU CHẢY VÀ ĐỘC TỐ NÔN CỦA CHỦNG BACILLUS
CEREUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM
Chuyên ngành: Vi sinh vật
Mã số: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: T.S Phùng Tôn Quyền
.

Hà Nội - 2015
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn thạc sĩ
tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu, nhân dịp này tôi xin được bày
tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những sự giúp đỡ này.
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới TS Phùng Tôn Quyền là
người thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn,
truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành
bản luận án này.
Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật,
Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi
vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn
bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học
tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày

tháng 12 năm 2015
Học viên

Đinh Thị Nga

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả
cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn
là trung thực.
Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015
Tác giả

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Danh mục hình
Danh mục bảng
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm .. 3
1.1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm (Food poisoning) ................................ 3
1.1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm ................................................. 3
1.2. Tổng quan về Bacillus cereus .................................................................... 5
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu Bacillus cereus ..................................................... 5
1.2.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................... 7
1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy ................................................................................ 7

1.2.4. Đặc điểm sinh trưởng .......................................................................... 8
1.2.5. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá................................................................. 10
1.2.6. Đặc điểm huyết thanh học ................................................................. 11
1.2.7. Đặc điểm phân loại ............................................................................ 12
1.3. Các nhân tố gây độc của Bacillus cereus ................................................. 12
1.3.1. Các loại độc tố ruột (enterotoxin) ...................................................... 12
1.3.2. Độc tố gây nôn (cereulide) ................................................................ 16
1.3.3. Những bệnh gây ra bởi Bacillus cereus, không liên quan tới ngộ độc
thực phẩm..................................................................................................... 18
1.4. Ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus ................................................... 19
1.4.1. Nguồn gốc lây nhiễm B. cereus ......................................................... 19
1.4.2. Cơ chế gây ngộ độc thực phẩm của Bacillus cereus ......................... 20
1.4.3. Liều lượng gây ngộ độc ..................................................................... 21
1.4.4. Triệu chứng ........................................................................................ 22
1.5. Biện pháp phòng ngừa sự lây nhiễm và phát triển của Bacillus cereus
trong thực phẩm .............................................................................................. 23
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




1.5.1. Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ cao ............................................... 23
1.5.2. Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ thấp .............................................. 24
1.5.3. Sử dụng chất bảo quản ....................................................................... 25
1.5.4. Thực hiện điều kiện vệ sinh tốt GHP (good hygienic practices) và
thực hành sản xuất tốt GMP (good manufacturing practices) [45] ............. 25
1.6. Một số phương pháp nghiên cứu để nhận biết Bacillus cereus ............... 26
1.6.1. Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. ............ 26
1.6.2. Phương pháp dựa trên đặc điểm huyết thanh học.............................. 28
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 31

2.1. Vật liệu. .................................................................................................... 31
2.1.1. Sinh phẩm. ......................................................................................... 31
2.1.2. Hóa chất và thiết bị. ........................................................................... 31
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 34
2.2.1. Phương pháp phân lập ....................................................................... 34
2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn. .......................... 34
2.2.3. Phương pháp tách DNA tổng số ........................................................ 34
2.2.4. Phương pháp tinh sạch plasmid của E. coli. ...................................... 35
2.2.5. Phương pháp PCR khuếch đại gen. ................................................... 36
2.2.6.Phương pháp điện di trên gel agarose................................................. 36
2.2.7. Phương pháp tách dòng gen nhe, hblA, bcet. .................................... 36
2.2.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotit của đoạn gen đã tách dòng. ... 37
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 39
3.1. Phân lâ ̣p Bacillus cereus trên môi trường MYP ...................................... 39
3.2. Phát hiện gen mã hóa độc tố của Bacillus cereus bằ ng phản ứng PCR... 39
3.3. Tách dòng và đọc trình tự gen bceT, nhe và hblA. .................................. 41
3.3.1. Tách dòng gen bceT, nhe và hblA. .................................................... 41
3.3.2. Đo ̣c trin
̀ h tự gen má hóa các đô ̣c tố ................................................... 44
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 47
KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 49
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ
1

Bp

Base pair

2

Bc

Bacillus cereus

3

CFU

Colony Forming Unit

4

dH2O

Deion water

5

DNA

Deoxyribonucleotide acid

6

dNTP

deoxyribo Nucleotide 5’- Triphosphate

7

ĐC

Đối chứng

8

E. coli

Escherichia coli

9

EDTA

Ethylene diamine tetra- acetic acid

10

EtBr

Ethidium Bromide

11

kDa

Kilo Dalton

12

OD

Optical density - mật độ quang học

13

PCR

Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi

14

SDS

Sodium dodecyl sulphate

15

Sol

Solution

16

TE

Tris EDTA

17

X-gal

5- bromo- 4 Cloro- 3 indolyl β- d galactoside

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Danh mục hình
Hình 1.1: Tế bào (A) và bào tử (B) của B. cereus ........................................... 7
Hình 1.2: Khuẩn lạc B. cereus trên môi trường thạch huyết ............................ 8
Hình 1.3 : Kháng nguyên tiêm mao của B. cereus.......................................... 11
Hình 1.4. Cấu trúc hoá học của cereulide [24] ............................................... 17
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc .Bcereus trên môi trường MYP sau
12 giờ nuôi...... 39
Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại các gen độc tố của gen
bceT (0,7 bp), nhe (1.4 kb) và hblA (319 bp) ............................... 40
Hình 3.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi Khuẩn E.coli DH5α ................... 41
Hình 3.4. Điê ̣n di sản phẩ m cắ t DNA plasmid các dòng khuẩ n la ̣c trắ ng
trên gel 1% agarose ....................................................................... 42
Hình 3.5 . Điê ̣n di sản phẩ m PCR của các dòng khuẩ n la ̣c trắ ng trên
gel 1% agarose ..................................................................... 43

Hình 3.6. So sánh trình tự amino acid của protrein BCET vói trình tự
BAA041341 trên ngân hàng gen quốc tế ...................................... 44
Hình 3.7. So sánh trình tự amino acid của protrein NHE vói trình tự
DQ153257.1 trên ngân hàng gen quốc tế .................................... 45
Hình 3.8. So sánh trình tự amino acid của protrein HBL vói trình tự
EEK50059.1 trên ngân hàng gen quốc tế ..................................... 46

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Danh mục bảng
Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus .... 10
Bảng 1.2. Đặc điểm một số độc tố ruột của Bacillus cereus ......................... 13
Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu. ........................... 32

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




MỞ ĐẦU
Bacillus cereus thuô ̣c nhóm 1 chi Bacillus là vi khuẩn hình que , Gram
dương và sinh bảo tử . B. cereus thường xuấ t hiê ̣n trong đấ t , trong sữa nguyên
liê ̣u, trong các sản phẩ m từ sữa và trong các loa ̣i ngũ cố c

. B. cereus có khả

năng liên quan đế n các bê ̣nh về đường ruô ̣t như gây nôn và tiêu chảy nhờ khả

năng sản sinh 4 loại enterotoxin trong đó có 2 tổ hơ ̣p hemolysin BL (HBL),
nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic protein là enterotoxin T
(BCET) và cytotoxin K (Beecher, Wong, 1994). Ngoài ra , B. cereus còn có
khả năng sản sinh một loại độc tố chịu nhiệt n on-riposome peptide synthetase
(NRPS-cereulide) (Agata et al., 1995).
Ở nước ta hiện nay theo báo cáo từ bộ y tế, chỉ có khoảng 38 trung tâm y
tế có khả năng kiểm nghiệm được loài vi khuẩn này, khoảng 60% các tình
thành có năng lực kiểm nghiệm. Tuy nhiên hiện nay phương pháp xét nghiệm
vẫn dựa trên phương pháp đếm tổng số khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh
dưỡng kết hợp với các xét nghiệm hóa sinh khác. Phương pháp này có nhược
điểm là thời gian lâu, có thể mất nhiều ngày hoặc vài tuần và độ chính xác
không cao.Trong những năm gần đây, các phương pháp xét nghiệm vi sinh
vật dựa trên nguyên tắc di truyền phân tử và miễn dịch học đã được thiết lập
như: lai phân tử, PCR (Polymerase Chain Reaction), Elisa cho kết quả rất khả
quan với độ chính xác cao, thời gian rút ngắn có thể xuồng vài giờ, không đòi
hỏi nhiều máy móc thiết bị do đó khả năng cơ động là rất cao. Những phương
pháp trên đã mở ra cho ngành vi hóa sinh học nói riêng và cả ngành công
nghệ thực phẩm hiện đại.
xuất phát từ tính cấp thiết chúng tôi tiến hành đề tài: “Tách dòng và giải
trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus
cereus phân lập tại Việt Nam”. Với mục đích tạo nguồn gen cho sản xuất
nguyên liệu chế tạo kit phát hiện các độc tố của vi khuẩn B. cereus sau này.
1


*/ Mục tiêu của nhiệm vụ:
- Tách dòng và đọc trình tự gen mã hóa độc tố gây nôn và tiêu chảy nhờ
khả năng sản sinh

4 loại enterotoxin trong đó có

(HBL), nonhemolytic enterotoxin

2 tổ hơ ̣p hemolysin BL

(NHE) và 2 enterotoxic protein là

enterotoxin T (BCET) và cytotoxin K từ vi khuẩn B. cereus.
*/ Nhiệm vu của đề tài:
- Phân lập vi khuẩn B.cereus tư các mẫu phẩm thu thập tại một số quán
an vỉa hè tại hà nội,
- Sàng lọc hệ gen mã hóa độc tố gây nôn và tiêu chảy , trong đó có 2 tổ
hơ ̣p hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic
protein là enterotoxin T (BCET) và cytotoxin K
- Tách dòng và đọc trình tự các gen HBL, NHE, BCET và cytotoxin K từ
một số chủng vi khuẩn B. cereus.

2


TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm
1.1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm (Food poisoning)
Ngộ độc thực phẩm là thuật ngữ dùng để chỉ một hội chứng cấp tính,
xảy ra đột ngột, do ăn phải thức ăn có chất độc, biểu hiện bằng những triệu
trứng nôn mửa, tiêu chảy và những triệu chứng khác tuỳ theo đặc điểm của
từng loại ngộ độc (tê liệt thần kinh, co giật, rối loạn hô hấp, tuần hoàn, vận
động…) [3].
1.1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm
Hiện nay tại Việt Nam cũng như trên thế giới, ngộ độc thực phẩm xảy

ra thường xuyên với nhiều nguyên nhân khác nhau. Nguyên nhân gây ngộ độc
thực phẩm thường được chia thành tác nhân lây nhiễm và tác nhân độc tố. Tác
nhân lây nhiễm bao gồm các loại vi khuẩn, virut, ký sinh trùng… Còn tác
nhân độc tố bao gồm các độc tố có sẵn trong thực phẩm, các loại hoá chất tồn
dư trong thực phẩm như kim loại nặng, thuốc trừ sâu, các chất phụ gia hoá
học…[60].
Trong các vụ ngộ độc thực phẩm hiện nay, nguyên nhân do vi sinh vật
đặc biệt là vi khuẩn chiếm tỉ lệ cao. Có rất nhiều loại vi khuẩn có khả năng
gây ngộ độc thực phẩm tuy nhiên khoảng 90% ca ngộ độc thực phẩm hiện nay
là do Staphylococus aureus, Salmonella, Clostridium perfingens, Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli và Bacillus cereus…
[59]. Do đó việc tìm hiểu các đặc tính của chúng là vô cùng cần thiết để có
thể đưa ra biện pháp kiểm soát hiệu quả. Dưới đây là đặc tính của một số
chủng vi khuẩn có nguy cơ ngộ độc cao:
Staphylococus aureus
S. aureus thường gặp ở các món ăn như salat cà chua, bánh sandwich
và các sản phẩm đóng hộp. Khi S. aureus nhiễm vào thực phẩm, chúng sẽ sản
sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với triệu chứng nôn, choáng váng và đau
quặn bụng [59,60].
3


Salmonellae sp.
Salmonellae thường tồn tại trong các thực phẩm có hàm lượng protein
cao như thịt, cá, trứng…Salmonellae có thể sinh trưởng trong thực phẩm,
nhưng không sinh độc tố, khi chúng vào trong ruột hoặc vào máu chúng mới
sinh độc tố. Bệnh ngộ độc do Salmonellae có triệu chứng điển hình như buồn
nôn, nôn, tiêu chảy và đau đầu [59,60].
Clostridium perfrigens
C. perfrigens thường xuất hiện trong đất, nước do đó chúng rất dễ

nhiễm vào thức ăn. Khi xâm nhập vào cơ thể người và động vật, chúng
thường cư trú trong ruột non. Nếu thực phẩm chứa một lượng lớn vi khuẩn
này được tiêu hoá thì khi C. perfrigens vào tới ruột non, chúng sẽ sản sinh độc
tố gây ngộ độc thực phẩm với triệu chứng đau bụng dữ dội, tiêu chảy ra nước
[59,60].
Vibrio cholerae
V. cholerae thường có mặt trong những thực phẩm chưa được nấu chín
kỹ đặc biệt là các loại thuỷ, hải sản sống. Ngộ độc do V. cholerae có các triệu
chứng điển hình như nôn, tiêu chảy dữ dội và liên tục nhưng không đau bụng.
Bệnh nhân nếu không điều trị kịp thời sẽ bị mất nước nghiêm trọng, trụy tim
dẫn đến tử vong [59,60].
Escherichia coli
E. coli là vi khuẩn sống chủ yếu trong ruột của người và động vật.
Nhiễm trực khuẩn đường ruột này với số lượng lớn sẽ bị ngộ độc. Triệu
chứng bệnh chủ yếu là đau bụng dữ dội, tiêu chảy, có thể nôn mửa [59,60].
Ngoài ra còn rất nhiều loại vi khuẩn khác có khả năng gây ngộ độc đã
được nghiên cứu. Trên đây chỉ là một vài ví dụ điển hình nhưng nhìn chung vi
khuẩn có khả năng gây ngộ độc thực phẩm ở 2 dạng: Ngộ độc do ăn phải thức
ăn có độc tố của vi khuẩn mà không cần có mặt tế bào của chúng
(Staphylococus aureus) và ngộ độc do ăn phải thức ăn nhiễm một số lượng
4


lớn tế bào hoặc bào tử vi khuẩn để khi vào tới ruột non chúng phát triển sinh
độc tố gây ngộ độc ( Salmonella). Nhưng trong số đó, vi khuẩn Bacillus
cereus lại có khả năng gây ngộ độc thực phẩm ở cả hai dạng trên với hai thể
bệnh điển hình là nôn và tiêu chảy.
1.2. Tổng quan về Bacillus cereus
B. cereus thuộc nhóm 1 chi Bacillus. Các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus có
mặt ở khắp mọi nơi trong môi trường sống, chúng mang đặc điểm chung là vi

khuẩn Gram dương, tế bào có dạng hình que, hô hấp hiếu khí hay hiếu khí
không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử [43]. Hiện nay, có khoảng trên
100 loài thuộc chi này đã được miêu tả, một số loài có ứng dụng trong công
nghiệp (sản xuất emzym) hoặc trong nông nghiệp (sản xuất thuốc trừ sâu sinh
học), một số loài lại gây bệnh cho người và động vật. Các loài gây bệnh quan
trọng thường nằm trong nhóm Bacillus cereus (nhóm 1 chi Bacillus) gồm
Bacillus cereus, Bacillus myco¿des, Bacillus thuringiensis, Bacillus
anthracis, Bacillus megaterium và mới đây có thêm hai loài là Bacillus
weihenstephanensis và Bacillus pseudomyco¿des được phát hiện [38]. Các
loài trong nhóm này có độ tương đồng về trình tự 16S, 23S rất cao và chúng
có % (G + C) tương đồng khoảng 31%-41%. Đây chính là những đặc điểm
quan trọng để phân loại chúng thuộc nhóm Bacillus cereus [43].
Trong các loài thuộc nhóm B. cereus có liên quan tới an toàn thực phẩm và
sức khoẻ con người thì B. thuringiensis được biết đến như là một loài vi khuẩn có
khả năng hình thành protein tinh thể độc có khả năng sử dụng làm thuốc trừ sâu
sinh học, B. anthracis là tác nhân gây bệnh than. Ngoài ra, B. cereus, B.
thuringiensis, B. weihenstephanensis thường được tìm thấy trong các sản phẩm
lương thực, thực phẩm bị hỏng [14]. Trong số đó, B. cereus là nguyên nhân chủ
yếu và quan trọng nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm.
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu Bacillus cereus
B. cereus được Frankland phân lập đầu tiên vào năm 1887 từ không khí tại
một chuồng bò [64]. Năm 1906 ở Châu Âu, 300 người bệnh được đưa vào
5


bệnh viện với những triệu chứng của bệnh đường ruột do ăn phải món thịt
băm bị nhiễm số lượng lớn một loại vi khuẩn hiếu khí, sinh bào tử, hình que
được gọi tên là Bacillus peptonificans. Sau này nó được đổi tên là Bacillus
cereus [61,64].
Từ năm 1926 đến năm 1929: Theo thông báo có hai vụ ngộ độc liên quan

tới một loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus hiếu khí có trong nước sốt vani và
món thịt đông.Từ năm 1936 đến năm 1943: Trong 367 vụ ngộ độc ở thành
phố Stockholm thì có 117 vụ nguyên nhân là do Bacillus spp. Tuy nhiên do
chưa có những hiểu biết rõ ràng về B. cereus nên chưa thể khẳng định rõ vai
trò của chúng trong các vụ ngộ độc trên [61].
Năm 1950, Steinar Hauge nhà khoa học người Na Uy với những thí
nghiệm đặc biệt đã khẳng định B. cereus là nguyên nhân gây ngộ độc thực
phẩm và là tác nhân gây bệnh cho con người. Để cung cấp bằng chứng khẳng
định B. cereus là nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm, Hauge đã chứng
minh bằng cách uống môi trường nuôi cấy B. cereus. Ông đã nuôi chúng tới
mật độ 4.106 tế bào /g và uống 200ml. Sau 13 giờ, ông cảm thấy đau bụng dữ
dội và bị tiêu chảy ra nước. Đó là những thí nghiệm đầu tiên về loại B. cereus
gây tiêu chảy.
Năm 1954, một số cuộc thí nghiệm với những người tình nguyện ở Mỹ đã thất
bại trong việc xác nhận lại những thí nghiệm của Hauge. Đến năm 1969, những
vụ ngộ độc thực phẩm do B. cereus đầu tiên đã được công bố ở Mỹ [64].
Năm 1971, 20 năm sau khi B. cereus được công nhận là tác nhân gây ra
thể bệnh tiêu chảy, các nhà khoa học đã phát hiện thêm một loại ngộ độc khác
gây ra bởi B. cereus được gọi là typ gây nôn. Loại B. cereus gây nôn được
phát hiện sau 6 vụ ngộ độc xảy ra ở Anh với các triệu chứng buồn nôn và nôn
mửa sau khi ăn món cơm rang của một nhà hàng Trung Quốc [61,64]. Từ đó
đến nay rất nhiều viện nghiên cứu của các nước trên thế giới đã và đang tiến
hành nghiên cứu về B. cereus cũng như các độc tố của chúng nhằm tìm ra các
6


phương pháp phát hiện nhanh chính xác vi khuẩn này trong các loại thực
phẩm, góp phần giảm thiểu các vụ ngộ độc thực phẩm do nó gây ra.
Ở Việt Nam hiện nay, chưa có những nghiên cứu cụ thể, chi tiết về B.
cereus mặc dù một số loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus khác đã được

nghiên cứu kỹ như B. thuringiensis, B. antharcis…
1.2.2. Đặc điểm hình thái
B. cereus thuộc chi Bacillus, là trực khuẩn Gram dương, hô hấp hiếu khí
hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử [43].
Về mặt tế bào, ngoài những đặc điểm chung của chi Bacillus thì Bacillus
cereus còn có những đặc điểm riêng sau: Kích thước tế bào B. cereus dài 3-5
ỡm, rộng 1-1,2ỡm, tế bào hình que thẳng, hai đầu có thể tròn hoặc vuông.
Phần lớn tế bào B. cereus thường có khả năng di động nhờ lông roi tuy nhiên
cũng có một số chủng không có khả năng di động. B. cereus có khả năng hình
thành nội bào tử. Nội bào tử của B. cereus nằm ở trung tâm tế bào, kích thước
của bào tử khoảng 1-1,5ỡm, bào tử nang không phồng. Bào tử có dạng hình
elip một số có dạng hình tròn hay hình khối (Hình 1.1) [61,64].

A

B

Hình 1.1: Tế bào (A) và bào tử (B) của B. cereus
1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy
B. cereus có thể sinh trưởng, phát triển ở dải nhiệt độ, pH rất rộng. Chúng
có thể phát triển ở nhiệt độ 4-5ºC trong khi đó một số chủng lại có thể phát
triển ở nhiệt độ 55ºC. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của B. cereus là 3037ºC. Độ pH biến thiên từ 4,3-9,3; pH tối ưu là 7-7,2. Độ hoạt động của nước
> 0,92. B. cereus có thể phát triển trên môi trường có nồng độ NaCl từ 77,5%, một số chủng còn có thể chịu được nồng độ 10% [23,37,61,64]. B.
7


cereus phát triển tốt nhất trong điều kiện hiếu khí nhưng vẫn có thể phát triển
trong điều kiện kỵ khí. Tuy nhiên, quá trình sản sinh độc tố đặc biệt là độc tố
gây nôn sẽ không xảy ra ở nhiệt độ <10ºC và >40ºC cũng như trong điều kiện
kỵ khí [28,33,36].

Khi nuôi cấy B. cereus trên môi trường phân lập MYP (manitol-yolkpolimyxin) trong điều kiện tối thích tº=37ºC, pH= 7-7,2 sau 1 ngày, khuẩn lạc
B. cereus có màu hồng eosin (do không có quá trình lên men manitol), xung
quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa màu hồng (do có khả năng sinh enzym
lecithinase) [22,23,37,63].
Trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn cơ bản MPA (meat- pepton-agar),
khuẩn lạc B. cereus có đường kính khoảng 0,4-0,5cm, màu sắc khuẩn lạc từ
trắng sữa đến trắng đục, khuẩn lạc tròn có tâm lồi, bề mặt sần sùi, không dính
ướt và có vành ở mép [14,43].

Hình 1.2: Khuẩn lạc B. cereus trên môi trƣờng thạch huyết

Trên môi trường thạch máu cừu, B. cereus có khả năng sinh haemolysin
làm tiêu huyết (Hình 1.2). Đây là một đặc điểm được sử dụng để phân biệt B.
cereus và B. anthracis do B. anthracis không có khả năng sinh haemolysin.
Haemolysin là một trong những độc tố quan trọng trong quá trình gây bệnh
của B. cereus [23,37].
1.2.4. Đặc điểm sinh trưởng
Đặc điểm quan trọng của chi Bacillus nói chung và B. cereus nói riêng
đó là khả năng hình thành bào tử. Nhờ có đặc điểm này mà B. cereus có thể
8


tồn tại phổ biến trong môi trường kể cả trong môi trường khắc nghiệt nhất. Vì
vậy, khả năng lây nhiễm B. cereus vào thực phẩm trở nên dễ dàng và nguy
hiểm hơn.
Khi tế bào sinh dưỡng của B. cereus gặp phải điều kiện bất lợi như
nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, pH cực đoan, tia tử ngoại hay môi trường
thiếu chất dinh dưỡng, khô hạn… B. cereus sẽ sinh nội bào tử. Nội bào tử
nằm trong tế bào mẹ, khi tế bào mẹ phân giải nội bào tử trở thành tự do. Bào
tử rất bền vững chúng có thể tồn tại và phát triển độc lập trong khoảng thời

gian dài. Khi gặp điều kiện môi trường thuận lợi về chất dinh dưỡng, nhiệt độ,
pH tối ưu …, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Tế
bào sinh dưỡng này sẽ tiếp tục sinh trưởng phát triển và tiến hành các hoạt
động trao đổi chất. Khi dinh dưỡng cạn kiệt, môi trường bất lợi nội bào tử lại
được hình thành [2].
Bào tử của B. cereus có khả năng chịu nhiệt hơn hẳn tế bào sinh dưỡng
của chúng [62,64]. Ở thể sinh dưỡng B. cereus, dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ
cao thì bào tử của nó lại có khả năng kháng lại nhiệt độ cao. Trong sữa, bào tử
B. cereus có thể chịu đựng được nhiệt độ 100ºC trong 2-3 phút trong khi đó
các quá trình thanh trùng sữa thường chỉ xảy ra tại nhiệt độ 70-80ºC trong vài
phút; trong thực phẩm có nồng độ axít thấp (pH>4,5) B. cereus có thể chịu
được khoảng 5 phút [61]. Đặc biệt, trong thực phẩm có hàm lượng lipit cao
như trong dầu đậu nành thì bào tử B. cereus có thể chịu được nhiệt độ 121ºC
trong 30 phút [62]. Vì vậy, trong quá trình chế biến thực phẩm khó có thể loại
bỏ hết bào tử B. cereus. Ngoài ra, bào tử B. cereus còn chịu được tia bức xạ
cao hơn tế bào sinh dưỡng. Nếu ta có thể tiêu diệt được 90% tế bào sinh
dưỡng B. cereus ở 0,17- 0,65 kGy thì để tiêu diệt được 90% bào tử B. cereus
thì cường độ bức xạ phải là 1,25- 4 kGy. Đặc biệt, bào tử B. cereus kỵ nước
hơn bào tử của các loài Bacillus spp. Do vậy, chúng có thể bám chặt vào bề
mặt của những dụng cụ, máy móc dùng cho quá trình chế biến thực phẩm
9


[12]. Điều này chứng tỏ bào tử B. cereus không chỉ nhiễm từ thực phẩm mà
còn từ những dụng cụ chế biến hay đựng thực phẩm và bất cứ lúc nào chúng
cũng có thể gây nguy hiểm cho an toàn sức khoẻ con người.
1.2.5. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá
B. cereus có rất nhiều đặc điểm sinh lý, sinh hoá giống với một số loài
thuộc nhóm Bacillus cereus. Bảng 1 sau đây tóm tắt một số đặc điểm chính để
phân biệt một số loài thuộc nhóm 1 chi Bacillus này:

Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus
B.

B.

B.

B.

B.

cereus

thuringiensis

myco¿des

anthracis

megaterium

Nhuộm Gram

+

+

+

+

+

Phản ứng catalase

+

+

+

+

+

Khả năng chuyển

+/-

+/-

-

-

+/-

+

+/-

+

+

-

Kháng lysozyme

+

+

+

+

-

Phản ứng với

+

+

+

+

-

+

+

+

+

-

Phản ứng VP

+

+

+

+

-

Sinh axít từ

-

-

-

-

+

Sinh hemolysin

+

+

+

-

-

Sinh tinh thể độc

-

+

-

-

-

Đặc điểm

động
Phản ứng khử
nitrate

lòng đỏ trứng
Lên men glucose
kỵ khí

manitol

Chú thích:

+: phản ứng dương tính
ư: phản ứng âm tính
+/-: 50-50% phản ứng dương tính
10


Bảng 1 cho thấy 4 loài B. cereus, B. thuringiensis, B. myco¿des, B.
anthracis có những đặc điểm sinh lý, sinh hoá rất giống nhau chỉ có B.
megaterium là có nhiều đặc điểm khác hơn cả. Tuy nhiên, trong 4 loài đó thì
mỗi loài vẫn có những đặc điểm riêng: B. myco¿des có khả năng hình thành
khuẩn lạc hình rễ cây trên môi trường dinh dưỡng cơ bản, trong khi đó B.
anthracis lại không có khả năng chuyển động và không sinh haemolysin. Trên
môi trường thạch huyết B. anthracis vẫn có khả năng hình thành khuẩn lạc có
kích thước 0,3-0,5cm nhưng không phân giải huyết, B. thuringiensis có khả
năng sinh protein tinh thể độc. Trong khi đó, B. cereus lại có khả năng chuyển
động và phân giải huyết rất mạnh, không hình thành khuẩn lạc dạng rễ cây và
không có khả năng sinh protein tinh thể độc [37].

1.2.6. Đặc điểm huyết thanh học
Hiện nay theo một số nghiên cứu, B. cereus có 13 kháng nguyên bề mặt
(kháng nguyên O) và giống như B. thuringiensis, B. cereus cũng có kháng
nguyên tiêm mao (kháng nguyên H) và 42 loại kháng nguyên H đã được sử
dụng cho phân loại B. cereus. 23 trong 42 typ huyết thanh H có liên quan tới
các thể bệnh gây ra bởi B. cereus. Các nghiên cứu đã cho thấy các typ huyết
thanh 1,2,6,8,10,12 và 19 thường liên quan tới các vụ ngộ độc thể bệnh tiêu
chảy còn các nhóm huyết thanh 1,5,8,12,19 của B. cereus lại liên quan tới
những vụ ngộ độc thể nôn. Trong đó, typ huyết thanh H1 thường chiếm ưu
thế và gây ra cả hai loại thể bệnh [23,61].

Hình 1.3 : Kháng nguyên tiêm mao của B. cereus
11


1.2.7. Đặc điểm phân loại
Do B. cereus là loại vi khuẩn có dải nhiệt độ phát triển khá rộng nên
dựa vào nhiệt độ có thể phân chia các chủng B. cereus như sau:
• Các chủng ưa nhiệt (Mesophilic) là những chủng B. cereus có khả
năng sinh trưởng ở dải nhiệt độ 10ºC- 42ºC một số có thể phát triển ở 50ºC55ºC, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 30ºC- 37ºC.
• Các chủng ưa lạnh (Psychrophilic hay Psychorotrophic) là những
chủng B. cereus có khả năng sinh trưởng ở dưới 10ºC một số chủng có thể
phát triển ở 4ºC, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 30ºC- 37ºC. Các chủng này
không sinh trưởng ở nhiệt độ >42ºC [38].
1.3. Các nhân tố gây độc của Bacillus cereus
B. cereus được biết đến là tác nhân gây ra những bệnh về đường tiêu
hoá cũng như một số bệnh không liên quan đến đường tiêu hoá. Chúng có khả
năng gây ngộ độc thực phẩm với hai thể bệnh điển hình là tiêu chảy và nôn.
Có rất nhiều loại độc tố tham gia vào quá trình gây ra hai thể bệnh này. Thể
bệnh nôn gây ra bởi một loại độc tố có khả năng kháng nhiệt cao được gọi là

cereulide hay emetic toxin có mặt trong thực phẩm trước khi con người tiêu
hoá. Trong khi đó, thể bệnh tiêu chảy lại là kết quả của rất nhiều loại độc tố
ruột (enterotoxin) khác nhau gây nên. Chúng là các sản phẩm trao đổi chất
của tế bào B. cereus sinh ra ở ruột non trong quá trình phát triển [23,38].
1.3.1. Các loại độc tố ruột (enterotoxin)
1.3.1.1. Đặc điểm cấu trúc và cơ chế hoạt động
a. Đặc điểm cấu trúc
Ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy là một loại thể bệnh phổ biến. Hiện
nay, có bốn loại độc tố ruột được biết đến là enterotoxin-T, cytotoxin K,
haemolysin BL (HBL) và non-haemolytic enterotoxin (NHE) [7,39]. Trong
đó, ba loại được chứng minh là có liên quan tới các vụ ngộ độc gây thể bệnh
tiêu chảy là HBL, NHE và cytotoxin K còn enterotoxin-T được coi như là một
enterotoxin vì nó có cấu trúc gần giống với enterotoxin của vi khuẩn [7].
12


Bảng 1.2. Đặc điểm một số độc tố ruột của Bacillus cereus [17,34, 39]
Tên độc tố

Khối lƣợng

Đặc điểm

phân tử

Khả năng gây
ngộ độc thực
phẩm

Haemolysin BL

Protein

B

37,5 kDa

(HBL)

3 thành L1
phần
L2

38,5 kDa

Non-haemolytic

Protein

A

45 kDa

enterotoxin

3 thành B

39 kDa

(NHE)

phần

105 kDa

Cytotoxin K

Protein đơn

35 kDa

Có

Enterotoxin- T

Protein đơn

41 kDa

Không

Có

43 kDa

C

Có

Trong 3 loại độc tố nêu ở trên thì HBL và NHE là hai độc tố ruột quan

trọng có mặt trong hầu hết các vụ ngộ độc gây tiêu chảy do B. cereus. Hiện
nay, đã có nhiều nghiên cứu tập trung vào hai loại độc tố này [57].
HBL là một loại độc tố dung huyết có bản chất là một protein 3 thành
phần B, L1, L2. Trong đó, B là nhân tố liên kết (Binding) còn L1 và L2 là 2
nhân tố phân giải (Lytic) [19]. Độc tố HBL này đã được tinh chế và xác định
đặc điểm. Bằng các thí nghiệm in vitro, các nhà khoa học đã chỉ ra độc tố này
có hoạt tính hoại tử, tăng tính thấm thành mạch máu cũng như khả năng gây
tích tụ dịch trong ruột già [39]. Trong protein nhiều thành phần này, mỗi
protein thành phần đều được mã hoá bởi một gen. Tiểu phần B được mã hoá
bởi gen hblA còn gen hblC và hblD lần lượt mã hoá cho tiểu phần L1, L2. Các
gen này cùng nằm trên một operon. Hoạt tính của độc tố này mạnh nhất khi
có đầy đủ cả 3 protein thành phần [57]. Tuy nhiên, thành phần protein HBL
của B. cereus không phải lúc nào cũng có đầy đủ cả 3 protein thành phần.
Trong 3 protein thành phần trên thì thành phần L2 có vai trò làm tăng hoạt
13


tính cho B và L1 nên không phải tất cả HBL của các chủng B. cereus đều sản
xuất L2 [61].
NHE cũng là một protein 3 thành phần: A, B, C. Trong đó NHEC là
protein liên kết còn NHEA, NHEB là protein phân giải. Giống như HBL, hoạt
tính của NHE mạnh nhất khi có đầy đủ cả 3 protein này. Các gen nheA, nheB,
nheC lần lượt mã hoá cho 3 protein NHEA, NHEB, NHEC, 3 gen này cũng
cùng nằm trên một operon [39,57]. Ngoài sự tương đồng về đặc điểm cấu tạo,
2 loại độc tố HBL và NHE còn có một đặc điểm chung là sự dịch mã operon
tổng hợp HBL, NHE đều được gen plcR điều hoà dương. Gen plcR là gen
điều hoà sự tổng hợp phospholipase C. Nếu chủng B. cereus có gen plcR điều
hòa âm thì chủng đó không có khả năng sản xuất HBL hay NHE còn nếu plcR
điều hoà dương thì chúng có khả năng sinh HBL và NHE. Lúc đó chúng có
khả năng gây ngộ độc thực phẩm dạng tiêu chảy [6].

Enterotoxin- T được biết đến từ năm 1995. Độc tố này đã được nhân
dòng và tiến hành một loạt các thí nghiệm invitro. Nó là một protein đơn
mang một số tính chất của một enterotoxin như khả năng gây độc tế bào, khả
năng tăng tính thấm thành mạch máu, khả năng gây tích tụ dịch, gây chết
chuột nhưng nó không có khả năng phân giải huyết. Nhưng hiện nay vẫn chưa
tìm thấy sự có mặt của loại độc tố này trong các vụ ngộ độc thực phẩm liên
quan tới B. cereus. Protein độc tố này được mã hoá bởi gen bce-T [8].
Cytotoxin K là loại enterotoxin được biết đến muộn nhất nhưng nó lại
có khả năng gây tử vong cao. Năm 2000, các nhà nghiên cứu đã phát hiện sự
có mặt của độc tố này sau một vụ ngộ độc xảy ra tại một gia đình người Pháp,
tổng cộng có 44 người bị ngộ độc trong đó 6 người bị tiêu chảy ra máu dẫn
tới tử vong. Cytotoxin K là một protein đơn có hoạt tính dung huyết và gây
hoại tử. Nó bộc lộ tính độc rất cao trên tế bào biểu mô của người. Gen mã hoá
cho độc tố này là cytK [57].
Ngoài B. cereus thì B. thuringiensis và B. weihenstephanensis đều có
khả năng tạo ra ít nhất một trong các độc tố gây tiêu chảy ở trên đặc biệt là B.
14


thuringiensis. Một số chủng B. thuringiensis được thông báo có liên quan tới
một số vụ ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy [29,32,34].
b. Cơ chế hoạt động của độc tố ruột gây tiêu chảy
Hiện nay, cơ chế hoạt động của các độc tố ruột trên chưa được biết rõ
nhưng HBL và NHE đều là sản phẩm trao đổi chất trong quá trình phát triển
của tế bào B. cereus, được sinh ra ở pha phát triển luỹ thừa (pha log) và đạt
được lượng lớn nhất ở cuối pha này [17]. Qua các nghiên cứu invitro trên tế
bào CaCo-2 (tế bào biểu mô ruột non người), các nhà khoa học đã phỏng
đoán có 2 cơ chế hoạt động của HBL [12]. Thứ nhất, tiểu phần B liên kết vào
màng tế bào trước sau đó tiểu phần L đi vào bên trong làm thay đổi các chức
năng trao đổi chất của tế bào. Thứ hai, tiểu phần B liên kết vào màng tế bào

và gây ra vết thương trên bề mặt màng tế bào khi có sự liên kết của cả hai
thành phần B và L. Cơ chế hoạt động của NHE cũng tương tự như vậy
[17,39].
Enterotoxin- T đã được tách dòng và biểu hiện trong E. coli. Nhưng
độc tố này chưa được tìm thấy trong bất cứ một vụ ngộ độc nào. Vì vậy, nếu
nó có khả năng gây độc thì hiện nay chưa có thông tin liên quan tới cơ chế
hoạt động của enterotoxin này [8].
Do cytotoxin K chỉ mới được phát hiện vào năm 2000 nên những
nghiên cứu về cơ chế gây độc của nó còn rất hạn chế. Trong nghiên cứu
invitro, các tác giả đã chỉ ra độc tố này có khả năng hình thành lỗ rò trong
tầng kép photpholipid. Điều đó chứng tỏ cơ chế hoạt động của cytotoxin K là
khả năng hình thành lỗ rò trên tế bào biểu mô ruột người gây ra quá trình
thoát dịch và phá huỷ tế bào biểu mô ruột dẫn đến hoại tử [57].
Các độc tố ruột có đặc điểm chung là chúng dễ dàng bị phá huỷ ở nhiệt
độ cao, pH cực đoan và bị phân huỷ bởi các enzym tiêu hoá như trypsin,
pepsin… [64]. Vì vậy, nếu chúng được B. cereus sinh ra trong thực phẩm
trước khi được con người tiêu hoá thì khi vào tới dạ dày chúng sẽ bị phá huỷ,
15


mất khả năng gây độc. Chúng chỉ thực sự gây nguy hiểm khi được hình thành
ở ruột non của người trong quá trình trao đổi chất của B. cereus [57].
1.3.1.2. Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố ruột
Hiện nay, theo cơ chế gây bệnh thì thể bệnh tiêu chảy có thể được chia
ra làm 3 loại: kích thích bài tiết (sencreoty), loại xâm lấn vào màng nhầy của
đường ruột nhưng không gây hoại tử (invasive) và loại xâm nhập, gây hoại tử
(penetrating). Trong đó, loại tiêu chảy kích thích bài tiết là loại tiêu chảy ra
dịch lỏng do quá trình mất cân bằng nước và chất điện giải giữa 2 bên biểu
mô của tế bào ruột non. Nguyên nhân thường là do các enterotoxin gây ra.
Giống như V. cholerae, bệnh tiêu chảy do B. cereus thuộc loại tiêu chảy này.

Sau khi con người ăn phải thực phẩm có chứa bào tử B. cereus, bào tử B.
cereus vào tới ruột non gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ nảy mầm phát triển
thành tế bào sinh dưỡng. Do tế bào B. cereus có những sợi tiên mao nhỏ nên
chúng có khả năng bám chắc vào tế bào biểu mô ruột [12]. Tế bào B. cereus
tăng nhanh về số lượng, tại pha sinh trưởng trong quá trình trao đổi chất
chúng sản sinh ra các độc tố ruột. Các độc tố này được tạo ra trong tế bào vi
khuẩn và được tiết vào ruột non người. Độc tố này liên kết với thụ thể đặc
hiệu trên màng, truyền tín hiệu giữa màng và kích thích các thông tin nội bào,
cuối cùng chúng gây ra mất cân bằng sự chuyển dịch nước và các chất điện
giải. Cụ thể, khi enterotoxin được giải phóng chúng kích hoạt enzym
adenylate cyclase (chuyển ATP → cAMP) làm tăng cAMP nội bào. Quá trình
sản xuất quá mức cAMP kéo theo sự vận chuyển tích cực ion Cl - vào khoang
ruột non và ngăn cản quá trình hấp thụ ion Na+ gây ra mất cân bằng thẩm thấu
làm cho một lượng lớn nước của cơ thể bị rút ra chuyển vào ruột non gây ra
bệnh tiêu chảy [57].
1.3.2. Độc tố gây nôn (cereulide)
1.3.2.1. Cấu trúc và chức năng
Ngoài thể bệnh tiêu chảy, B. cereus còn gây ngộ độc thực phẩm ở thể
16