Nuôi cấy huyền phù tế bào

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chủ đề:

NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO
GVHD
: PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh
SV thực hiện : Nhóm 7
1. Nguyễn Thị Duyên
2. Nguyễn Thị Anh Đào
3. Phạm Thị Huệ
4. Lê Ngọc Mai
5. Phùng Tiến Quang
6. Phạm Thị Thảo
7. Đào Trần Trung
8. An Thị Yến

570960
560785
560808
560827
560853
560866
550413
560895


A.ĐẶT VẤN ĐỀ


1

.

Giới thiệu chung
2

Kĩ thuật sử dụng trong nuôi cấy huyền phù tế bào

3

4

5

6

ƯD của NC huyền phù TB trong nhân giống vô tính

ƯD của NC huyền phù TB trong sản suất sinh khối
tế bào và các hợp chất có giá trị cao

Nuôi cấy Nhân sâm Panax ginseng bằng Bioreacter

KẾT LUẬN


I. GIỚI THIỆU CHUNG
Khái niệm, Đặc trưng

 Nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures) là phương thức

nuôi tế bào đơn (single cell) hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở
trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng
 Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng
Sinh trưởng, phân chia và có thể hình thành những cụm tế bào kết
tập. Dung dịch nuôi cấy tế bào chuyển thành huyền phù tế bào


• Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo khá lớn.
• Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp tế bào
đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế
bào chết.Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc
tính của các khối tế bào xốp và có thể được đều chỉnh bởi
thành phần môi trường.
• Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được cấy truyền
vào giai đoạn đầu của pha ổn định và ở thời điểm khi sự kết
tập của tế bào là lớn


.


MÔI TRƯỜNG NUÔI
CẤY

tb huyền phù có bản chất là tb callus
mt nuôi cấy calus có thể sử dụng để
khởi đầu việc nuôi cấy huyền phù tế bào
cải tiến hàm lượng và tỉ lệ auxin/cytokinin
cho phù hợp để có được các tế bào phân tán
tốt trong môi trường lỏng lắc.

Các chỉ tiêu sinh trưởng

• Số lượng tế bào:
Trước khi đếm, xử lý những cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng
700C trong 5 – 10 phút, sau đó làm nguội và lắc mạnh trong vài
phút.
Pha loãng dịch, nhuộm và đếm trên buồng đếm hồng cầu.
Kết quả: số lượng tế bào/ml dung dịch nuôi cấy.
• Thể tích tế bào:
Lấy ngẫu nhiên một thể tích dịch nuôi cấy, đem ly tâm ở tốc độ 2000
vòng/phút trong thời gian 5 phút.
Thu tế bào và đem xác định thể tích.
Kết quả: Số ml tế bào/thể tích môi trường nuôi cấy.


•Khối lượng tươi:
Thu thập tế bào trong một thể tích dịch xác định.
Rửa bằng nước cất vô trùng
Làm khô trong chân không.
Cân để xác định khối lượng.
•Khối lượng khô:
Lấy một thể tích mẫu xác định.
Loại bỏ phần nổi, rửa phần tế bào trên giấy lọc Whatman.
Sấy khô trong 12h ở 800C đến khối lượng không đổi.


•Xác định chỉ số nguyên phân (chỉ số phân bào):
Huyền phù tế bào được cố định trong hỗn hợp Aceto-orcein :

Acid Acetic (3:1) sau đó chuyển sang lam kính. Nhỏ 1 giọt
Aceto-orcein lên mẫu, hơ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội
trong 5 phút. Đậy mẫu bằng Lamel, làm khô mẫu, quan sát
dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 100. Xác định các kỳ
trong khoảng 1000 tế bào.
Tổng số tế bào phân bào x 100
Chỉ số phân bào(%) =
Tổng số tế bào kiểm tra


•Khả năng sống của tế bào:
nhuộm bằng flurescein diacetate (0,01%) và quan sát
màu xanh dưới sự chiếu sáng tử ngoại (ultraviolet).


II. KĨ THUẬT SỬ DỤNG TRONG NUÔI
CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO
Nuôi cấy dịch
thể động

Nuôi cấy
chìm liên
tục

Nuôi cấy
chìm tuần
hoàn

Nuôi cấy bằng
Bioreactor

Bioreacter
không có
cánh
khuấy

Hệ thống
nuôi cấy
ngập chìm
tạm thời
(TIS)


NUÔI CẤY DỊCH THỂ ĐỘNG
Nuôi cấy chìm liên tục

•

Ngâm hẳn tế bào vào dd môi

Nuôi cấy chìm tuần hoàn

• Nhúng chìm vào môi trường

trường

dịch thể, xen kẽ với những

•

Khí đưa vào vô trùng

khoảng thời gian được đưa ra

•

250 vòng/phút

ngoài môi trường.

•

10 – 15 ngày

• Khối tế bào ở đầu này được
đưa vào môi trường. Khối tế
bào ở đầu kia tiếp xúc với
không khí


 BIOREACTER

cấy
KHÔNGNuôi
CÓ CÁNH
KHUẤY:

bằng Bioreactor

THIẾT KẾ VỚI MỘT

BỘ PHẬN SỦI BỌT
KHÍ Ở PHÍA DƯỚI
ĐÁY BÌNH
KHUẤY
TRỘN MÔI
TRƯỜNG VÀ CUNG
CẤP OXY


Ưu
điểm
 Khả năng nhân sinh khối rất
nhanh, chồi phát triển tương
đối đồng đều
 phù hợp cho những quá trình
nhân sinh khối tế bào và rễ
do khả năng chịu được sự
ngập chìm trong môi trường

Nhược
điểm
 Hiện tượng thủy tinh thể do
ngập chìm hoàn toàn và liên
tục
 Khó áp dụng một cách đồng
loạt cho nhiều giống khác
nhau
 Nuôi cấy trong môi trường
lỏng dễ bị nhiễm vi sinh vật
như nấm, vi khuẩn, côn

trùng...


 HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM
THỜI (TIS).
• Pha 1: mô không ngập
trong môi trường
• Pha 2: hiện tượng ngập
được hoạt hóa, các van
mở ra cho khí đi qua các
màng lọc đẩy môi trường
lỏng lên ngập mô cấy
• Pha 3: sự trao đổi khí
trong hệ thống RITA
• Pha 4: chu kỳ kết thúc,
các van đóng lại và môi
trường lỏng rút xuống
ngăn bên dưới.

Hệ thống RITA


ẢNH HƯỞNG CỦA HỆ THỐNG NGẬP
CHÌM TẠM THỜI LÊN CHẤT LƯỢNG
NUÔI CẤY
• Lá nhỏ hơn lá trong môi trường nuôi cấy lỏng
• Các cụm chồi phát triển thường có hình cầu
• Chồi có xu hướng phát triển tỏa tròn xung quanh tâm

một số chồi con có kích thước không lớn. Chồi cây có thân

dài hơn và ra nhiều lá hơn so với nuôi cấy trên môi trường
thạch
Những ảnh hưởng có lợi từ hệ thống ngập chìm tạm
thời lên sự phát triển chồi có thể là kết quả của việc sử dụng
những bình chứa dung tích lớn


Ưu
điểm
•
•
•
•
•
•

•
Ứng dụng trên nhiều đối tượng
cây trồng, không bị biến dị với tần
số cao
•
sinh trưởng và hệ số nhân cao
Cây tái sinh và phôi soma thu
được có chất lượng tốt
Hạn chế hiện tượng thủy tinh thể •
Tiết kiệm công lao động và không
gian nuôi cấy, giảm chi phí sản
suất
Giảm hoạt tính của các chất độc

Nhược
điểm
Chưa khảo sát được mật độ nuôi
cấy
rất đắt, chưa được tự chế tạo
trong nước
Các thông số kĩ thuật cần được
khảo sát kỹ lưỡng và tối ưu hóa
đối với từng giai đoạn nuôi cấy
của từng loại cây


III. ỨNG DỤNG CỦA NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
TẾ BÀO TRONG NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH.
Các bước cơ bản
 Nuôi cấy callus: tiến hành cấy chuyển nhiều lần trong môi
trường thạch mềm
 Nuôi cấy dịch huyền phù:
• Callus được cấy chuyển sang môi trường lỏng chuyển động
• Các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động
xoáy của môi trường
các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các
mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết


Sự phát sinh soma
 sử dụng môi trường kích thích có chứa
auxin, nước dừa, dùng nhiều xytokinin,
myo-inosiol giảm lượng nitrogen
 phôi soma có kích thước tương đối nhỏ và

đồng đều kích cỡ nên chúng không phải
cắt thành những mảnh nhỏ và tách rời
khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh


.

Sự nhân chồi
Hệ thống ngập chìm có tác dụng thúc đẩy
việc nhân chồi:
 chồi sinh trưởng tốt hơn, chất lượng tốt hơn và
dài hơn so với chồi trên môi trường rắn
 chồi có thể tăng trưởng liên tục

cho

phép thu hoạch chồi sau mỗi tháng mà không
cần cấy chuyền
 Sau khi thu hoạch, cây con được chuyển ra
nuôi ở môi trường tự nhiên bình thường như


IV. ỨNG DỤNG TRONG SẢN SUẤT SINH KHỐI TẾ
BÀO THỰC VẬT VÀ CÁC HỢP CHẤT CÓ GIÁ TRỊ
CAO
NHÂN SINH

NHÂN SINH

KHỐI CALLUS

KHỐI RỄ

 Hiệu suất
mang
lại
rất cao
 Một số sản
phẩm:

• Alkaloid:morphina
• Các hợp chất kháng
ung thư: taxol,
saponin...

Tốc độ tăng trưởng
rất cao
Nđ:

• Nguồn cung cấp Oxy ko
đến đc với sinh khối ở giữa
Bioreactor
mô bị lão hóa
• Khả năng nuôi cấy rễ
thành công phụ thuộc vào
việc thiết kế hệ thống
Bioreactor phù hợp


1 SỐ HỢP CHẤP THỨ CẤP

Diosgenin: chống viêm;
chữa sốt, thấp khớp, đau
lưng...
Cây củ nâu

Codein : giảm đau và
giảm ho
Cây Anh túc


.

Taxol
hóa trị liệu ung thư
Cây thông đỏ

Saponin và sapogenin:
chữa rối loạn tiêu hóa,
chống suy nhược cơ thể,
tăng cường sinh lực
Cây nhân sâm


V. ỨNG DỤNG TRONG NUÔI CẤY THÔNG
ĐỎ ĐÊ THU NHẬN TAXOL.

•Nguồn dược liệu rất quý trong y
học:
•Năm 1994 công bố: “từ cây

thông đỏ có thể tìm thấy các
hoạt chất để chữa trị bệnh ung
thư cụ thể là Taxol chiết suất từ
vỏ các loài: T. brevifolia, T.
cuspidata, T.yunnanensis, T.
baccata và T. wallichiana,…
•Chữa ung thư buồng trứng và
ung thư vú, chống các khối u ác
tính, ung thư phổi và một số

Thông Đỏ