Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano fenofibrat

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ HẢI PHƢỢNG
MÃ SINH VIÊN: 1201471

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
TIỂU PHÂN NANO FENOFIBRAT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ HẢI PHƢỢNG
MÃ SINH VIÊN: 1201471

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
TIỂU PHÂN NANO FENOFIBRAT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Trần Ngọc Bảo
Nơi thực hiện:
1. Viện Công nghệ Dƣợc phẩm Quốc Gia
2. Bộ môn Công nghiệp Dƣợc

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
đến ThS. Trần Ngọc Bảo - người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình,
truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng như động viên em trong suốt thời gian
thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến – người thầy đã
định hướng và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành khóa luận.
Em xin trân trọng cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị nghiên cứu
viên, kĩ thuật viên, các bạn sinh viên đang nghiên cứu khoa học và thực hiện khóa
luận tốt nghiệp tại Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, Bộ môn Công Nghiệp
Dược, Bộ môn Bào Chế, Bộ môn Vật Lý – Hóa Lý đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận
lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Nhân dịp này, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Nhà trường và
phòng Đào tạo cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy
dỗ, giúp đỡ tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè thân thiết đã luôn động viên,
khích lệ và nhắc nhở, là nguồn động lực lớn giúp em vượt qua mọi khó khăn.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa
luận này còn nhiều thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn
bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Thị Hải Phượng


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƢƠNG

TỔNG

1.1. Tổn qu n về

U N.....................................................................................2
no

r t ...................................................................................2

1.1.1. Công thức cấu tạo .......................................................................................2
1.1.2. T nh chất lý hóa ..........................................................................................2
1.1.3. Độ n định ..................................................................................................2
1.1.4. Đ c điểm dược động học ............................................................................3
1.1.5. Chỉ định, chống chỉ định ............................................................................3
1.1.6. Liều lượng và cách dùng ............................................................................3
1.2. Vài nét về công nghệ n no tron Dƣợc phẩm ................................................4
1.2.1. Khái niệm ...................................................................................................4
1.2.2. Phân loại nano polyme mang thuốc ...........................................................4
1.2.3. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme ................................5
1.2.4. Tính chất và một số chỉ tiêu đánh giá hệ tiểu phân nano ...........................6
1.2.5. Nhược điểm về độ n định của tiểu phân nano polyme dạng hỗn dịch .....8
1.3. Một số phƣơn pháp rắn hóa hệ tiểu phân nano ...........................................8
1.3.1. Đông khô ....................................................................................................8
1.3.2. Phun sấy......................................................................................................9

1.3.3. Tạo hạt tầng sôi ..........................................................................................9
1.3.4. Phun hỗn dịch nano lên hạt ......................................................................10
1.3.5. Tạo pellet sử dụng thiết bị đùn – tạo cầu..................................................11
1.3.6. Nạp nano thuốc vào nhựa trao đ i ion......................................................12
1.4. Một số n h n ứu về t n

ộ hòa tan của fenofibrat .................................12

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................15
2.1. Đố tƣợn .........................................................................................................15


2.1.1. Nguyên vật liệu.........................................................................................15
2.1.2. Thiết bị......................................................................................................15
2.2. Nộ

un n h n ứu .......................................................................................16

2.3. Phƣơn pháp n h n ứu ...............................................................................16
2.3.1. Phương pháp bào chế tiểu phân nano fenofibrat ......................................16
2.3.2. Phương pháp rắn hóa nano fenofibrat ......................................................17
2.3.3. Các phương pháp đánh giá .......................................................................20
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................24
3.1. Kết quả khảo sát phƣơn pháp ịnh lƣợng fenofibrat ...............................24
3.1.1. Phương pháp đo quang ph hấp thụ tử ngoại ...........................................24
3.1.2. Phương pháp HPLC ..................................................................................24
3.2. Xây dựng công thức bào chế và khảo sát một số ảnh hƣởng tớ

ặc tính

của tiểu phân nano fenofibrat ................................................................................25
3.2.1. Lựa chọn phương pháp bào chế ...............................................................25
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng một số yếu tố công thức ..........................................26
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố quy trình .....................................30
3.3. Kết quả nghiên cứu bào chế rắn hóa từ hỗn dịch nano fenofibrat ............32
3.3.1. Kết quả nghiên cứu phương pháp tạo hạt tầng sôi ...................................32
3.3.2. Kết quả nghiên cứu tạo hạt ướt – tạo hạt tầng sôi ....................................36
3.3.3. Sơ bộ đánh giá KTTP của hệ nano sau khi phân tán lại hạt tầng sôi .......38
3.3.4. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của hạt tầng sôi ...............................38
3.4. Kết quả tạo hạt m n

ƣợc chất bằng nhự tr o ổi ion ...........................39

3.4.1. Bước đầu chọn nhựa phù hợp ...................................................................39
3.4.2. Ảnh hưởng của thời gian khuấy đến khả năng nạp thuốc ........................39
3.4.3. Đánh giá khả năng giải phóng của nhựa mang thuốc...............................39
3.5. Quang phổ hồng ngoại....................................................................................40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................42


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CT

Công thức

DC

Dược chất

DD (dd)

Dung dịch

DĐVN IV

Dược điển Việt Nam IV

D/N

Dầu/nước

EA

Ethyl acetat

EE

Hiệu quả tạo nang (Encapsulation efficiency)

EPO

Eudragit EPO

FA

Acid fenofibric

FB

Fenofibrat

FT–IR

Quang ph hồng ngoại

GLP – PLGA/CS

Hệ tiểu phân nano glipizid – poly (lactic-coglycolic) acid/chitosan

HPLC

High performance liquid chromatography (Sắc ký
lỏng hiệu năng cao)

HD

Hỗn dịch

KTTP

K ch thước tiểu phân

LC

Khả năng nạp thuốc của hệ (Loading capacity)

MeOH

Methanol

NaLS

Natri lauryl sulfat

NT

Nhũ tương

PDI

Chỉ số đa phân tán (Polydiversity index)

PP

Phương pháp

PVA

Polyvinyl alcohol

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Độ lệch chuẩn

TB

Trung bình


TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

USP

Dược điển Mỹ


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại nano polyme mang thuốc ...........................................................4
Bảng 2.1. Nguyên liệu được sử dụng trong quá trình thực nghiệm .........................15
Bảng 2.2. Công thức bào chế tiểu phân nano FB .....................................................16
Bảng 2.3. Thành phần bột kép ..................................................................................18
Bảng 3.1. Kết quả đo KTTP, PDI, thế zeta của 2 phương pháp (n = 3) ...................26
Bảng 3.2. Kết quả đo KTTP, PDI, thế zeta của CT N1-N5......................................27
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá một số đ c tính tiểu phân nano của CT M1-M9 ..........28
Bảng 3.4. Kết quả đo KTTP và PDI của các công thức N6-N12 (n = 3) .................31
Bảng 3.5. Kết quả thử độ hòa tan khảo sát ảnh hưởng của dịch phun (n = 3) .........34
Bảng 3.6. Kết quả thử độ hòa tan khảo sát ảnh hưởng của NaLS ............................35
Bảng 3.7. Kết quả thử độ hòa tan của C6, C7, C8, C9 .............................................36
Bảng 3.8. Kết quả đánh giá t nh chất hạt của ống ly tâm công thức C8 ..................38
Bảng 3.9. Mối quan hệ giữa thời gian phản ứng với khả năng nạp thuốc ................39
Bảng 3.10. Kết quả thử hòa tan của nhựa Anhui và nguyên liệu .............................40

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của fenofibrat .................................................................2
Hình 1.2. Hình ảnh siêu vi cầu và siêu vi nang . ........................................................4
Hình 1.3. Hệ màng bao của một số nano polyme mang thuốc. ..................................4
Hình 1.4. Hệ liên kết nano polyme hình thành qua cầu liên kết hóa học. ..................4
Hình 1.5. Thiết bị tầng sôi thường dùng .................................................................10
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ...................................................17
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình tạo hạt kép.......................................................................18
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ FB ...........24
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ FB ........25
Hình 3.3. Mối quan hệ giữa tỷ lệ dược chất : polyme với KTTP, PDI và thế zeta ..27
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thể tích pha pha loãng ở 3 tỷ lệ FB : EPO ......................29
Hình 3.5. Ảnh hưởng của thời gian khuếch tán và bốc hơi dung môi .....................30
Hình 3.6. Phần trăm giải phóng FB từ hạt có công thức C1, C3, C4, C5 ................35
Hình 3.7. Phần trăm FB giải phóng từ hạt có công thức C6, C7, C8, C9 ................37
Hình 3.8. Ph hồng ngoại của nguyên liệu FB, EPO, tiểu phân nano đông khô, hỗn
hợp vật lý, hạt công thức C8 .....................................................................................40


ĐẶT VẤN ĐỀ
Những năm gần đây, công nghệ nano đã thu hút được sự quan tâm của cộng
đồng khoa học và công nghệ trên phạm vi toàn cầu. Với k ch thước siêu nhỏ, nano
tạo ra nhiều tính chất mới so với nguyên liệu ban đầu và được ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực của đời sống. Trong dược phẩm, công nghệ nano được đón nhận như một
công cụ cơ bản để nghiên cứu và phát triển các hệ đưa thuốc mới, nhằm cải thiện
sinh khả dụng, đưa thuốc tới đ ch tác dụng, làm tăng hiệu quả điều trị của thuốc
[13].
Fenofibrat là một trong những thuốc hạ lipid máu được sử dụng ph biến tại

nhiều quốc gia. So với các dẫn chất cùng nhóm, hoạt chất này có nhiều ưu điểm như
tác dụng dược lý cao, ít tác dụng phụ và có khả năng phối hợp với các thuốc hạ lipid
máu khác [18]. Tuy nhiên, sinh khả dụng của FB thường thấp và không n định do
độ hòa tan kém. Nắm bắt được hạn chế đó, nghiên cứu bào chế tiểu phân nano
polyme FB với mục đ ch ch nh cải thiện độ hòa tan làm tăng sinh khả dụng được đề
tài ứng dụng.
Hệ nano sau khi bào chế thường g p nhiều nhược điểm về độ n định do khả
năng hút ẩm lớn, độ trơn chảy kém, dễ kết tụ hay nhiễm vi sinh vật, đ c biệt ở dạng
lỏng. Chính vì thế, việc rắn hóa hệ tiểu phân nano là bước quan trọng để cải thiện
độ n định, cũng như kết hợp được những ưu điểm của tiểu phân nano (tăng khả
năng hòa tan và sinh khả dụng [13]) với dạng bào chế rắn (tính n định cao, tăng
khả năng tuân thủ điều trị của bệnh nhân... [7]). Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài
“Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano fenofibrat” với những mục tiêu sau:
1. Xây dựng được công thức, quy trình bào chế tiểu phân nano fenofibrat và
đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano.
2. Bước đầu nghiên cứu bào chế rắn hóa hệ tiểu phân nano fenofibrat.

1


CHƢƠNG
1.1.
1.1.1.

Tổn qu n về

no

TỔNG

U N

r t

ng thức c u t o

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của fenofibrat
-

Công thức phân tử: C20H21ClO4.

-

Khối lượng phân tử: 360,8.

-

Tên khoa học:
1-methylethyl 2-[4-(4-clorobenzoyl) phenoxy]-2-methylpropanoat [4], [60].

1.1.2.

nh ch t

h a

-

Cảm quan: Bột kết tinh trắng ho c gần như trắng [4].

-

T nh chất lý học: thực tế không tan trong nước (< 0,5mg/l), tan tốt trong
methylen clorid, khó tan trong ethanol 96% [4]. Fenofibrat thân dầu, trung
t nh, hệ số phân bố D/N log P = 5,24 [37].

-

Định t nh:
Phương pháp quang ph hồng ngoại: Ph hồng ngoại của chế phẩm phải
phù hợp với ph hồng ngoại của fenofibrat chuẩn [4].
+ Phương pháp đo điểm chảy: từ 79oC đến 82oC [4].

-

Định lượng:
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [4].
Phương pháp đo mật độ quang hấp thụ [60].

1.1.3.

ộ n đ nh

Bền vững ở nhiệt độ thường [37], [60].

2


1.1.4.

ặc điểm dược động h c

FB được hấp thu ngay ở đường tiêu hóa cùng với thức ăn. Hấp thu thuốc bị giảm
nhiều nếu uống sau khi nhịn ăn qua đêm. Thuốc nhanh chóng thủy phân thành acid
fenofibric có hoạt tính; chất này gắn nhiều vào albumin huyết tương và có thể đẩy
các thuốc kháng vitamin K ra khỏi vị trí gắn. Nồng độ đỉnh trong huyết tương xuất
hiện khoảng 5 giờ sau khi uống thuốc. Ở người có chức năng thận bình thường, nửa
đời trong huyết tương vào khoảng 20 giờ nhưng thời gian này tăng lên rất nhiều ở
người mắc bệnh thận và FA t ch lũy đáng kể ở người bệnh suy thận uống fenofibrat
hằng ngày. FA đào thải chủ yếu theo nước tiểu (70% trong vòng 24 giờ, 88% trong
vòng 6 ngày), chủ yếu dưới dạng liên hợp glucuronic, ngoài ra còn có FA dưới dạng
khử và chất liên hợp glucuronic của nó [2].
1.1.5.

h đ nh, chống ch đ nh

 Chỉ định:
FB được sử dụng trong điều trị rối loạn lipoprotein huyết các typ IIa, IIb, III,
IV và V, phối hợp với chế độ ăn [2].
 Chống chỉ định:
Suy thận n ng. Rối loạn chức năng gan n ng. Trẻ dưới 10 tu i [2].
1.1.6. Liều ượng và cách dùng
Điều trị FB nhất thiết phải phối hợp với chế độ ăn hạn chế lipid. Cần uống thuốc
cùng với bữa ăn.
-

Người lớn: 300 mg/ngày (1 viên 300 mg, uống vào một bữa ăn ch nh ho c uống
3 lần, mỗi lần 1 viên 100 mg cùng với các bữa ăn).

-

Trẻ > 10 tu i: cần nghiên cứu kỹ để xác định căn nguyên ch nh xác của tăng
lipid máu ở trẻ. Có thể điều trị thử kết hợp với một chế độ ăn được kiểm soát
ch t chẽ trong vòng 3 tháng. Liều tối đa khuyên dùng là 5 mg/kg/ngày. Trong
một số trường hợp đ c biệt (tăng lipid máu rất cao kèm theo dấu hiệu lâm sàng
của vữa xơ động mạch, có đám đọng xanthom…) thì có thể dùng liều cao hơn
nhưng phải do thầy thuốc chuyên khoa chỉ định [2].

3


1.2.

Vài nét về công nghệ n no tron Dƣợc phẩm

1.2.1. Khái niệm
Công nghệ nano là công nghệ nghiên cứu phát triển và sử dụng các vật liệu siêu
nhỏ có kích cỡ nanomet để phục vụ cho lợi ích cuộc sống con người [13].
Công nghệ nano trong dược phẩm (Pharmaceutical Nanotechnology) hình thành
trên cơ sở áp dụng thành tựu của công nghệ nano nói chung vào lĩnh vực nghiên
cứu chế tạo các tiểu phân nano dược phẩm, các hệ mang thuốc nano ho c các thiết
bị nano dùng chẩn đoán và điều trị bệnh [25], [31].
1.2.2. Phân o i nano po yme mang thuốc
Theo cơ chế mang dược chất có thể chia làm ba nhóm [13].
Bảng 1.1. Phân loại nano polyme mang thuốc
Nhóm một

Nhóm hai

Nhóm ba

Hệ cốt, tiểu phân nano Hệ màng bao, polyme bao Hệ liên kết, polyme gắn
dược chất phân tán trong bên ngoài tiểu phân nano trực tiếp với phân tử dược
giá mang polyme: Siêu vi dược

chất:

Liposome, chất qua các cầu liên kết

cầu (nanospheres), siêu vi micelles, denderime, ống hóa học.
nang (nanocapsules), tiểu carbon...
phân lipid rắn.

Hình 1.2. Hình ảnh siêu vi

Hình 1.4. Hệ liên kết nano

cầu và siêu vi nang [19].

polyme hình thành qua
cầu liên kết hóa học [27].
Hình 1.3. Hệ màng bao
của một số nano polyme
mang thuốc [54].

4


1.2.3. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano po yme
Dựa theo quy trình bào chế, có thể chia các phương pháp bào chế nano polyme

làm 2 loại: 1 giai đoạn và 2 giai đoạn.
-

Phương pháp 1 giai đoạn: dựa trên sự kết tủa của polyme từ một dung dịch,
ho c sự kết tập tự phát của các đại phân tử để hình thành các nanogel ho c
các phức hợp của các chất đa điện phân (polyelectrolyte).

-

Phương pháp 2 giai đoạn: giai đoạn đầu chung cho các phương pháp là bào
chế một nhũ tương và giai đoạn 2 là giai đoạn hình thành nên tiểu phân nano.
Giai đoạn 2 có thể được thực hiện dựa trên phản ứng polyme hoá các
monome ho c các quá trình kết tủa, gel hoá của các polyme [61].

Các polyme được sử dụng có thể là polyme tự nhiên, các polyme t ng hợp, có
sẵn ho c tạo thành từ các monome. Tuy nhiên, do các polyme tạo thành từ phản ứng
polyme hoá thường ít phân huỷ sinh học, các monome tồn dư và chất diện hoạt
được dùng với lượng lớn có thể gây độc và đòi hỏi quá trình tinh chế phức tạp [61].
Do đó, hiện nay các nghiên cứu sử dụng chủ yếu phương pháp đi từ các polyme có
sẵn (các eudragit, các polyme phân huỷ sinh học như PLGA, PLA, PCL….) [39].
Một số phương pháp thường được sử dụng trong bào chế tiểu phân nano polyme
từ các polyme t ng hợp có sẵn như [40], [41], [61]:
-

Nhũ hoá bốc hơi dung môi.

-

Tự nhũ hoá do khuếch tán dung môi.

-

Thay thế dung môi.

-

Nhũ hoá khuếch tán dung môi.

-

Hoá muối.

Nguyên tắc tiến hành và cơ chế hình thành tiểu phân nano của mỗi phương pháp
đều có những đ c điểm riêng. Việc hiểu rõ nguyên lý, các yếu tố ảnh hưởng lên các
đ c tính của tiểu phân và ưu nhược điểm của từng phương pháp đóng vai trò quan
trọng trong việc lựa chọn phương pháp cũng như các nguyên liệu ban đầu để bào
chế tiểu phân nano polyme [40].
1.2.3.1.

h

g h

hũ hóa bốc h i du g môi

5


Nguyên tắc: Dung dịch polyme và dược chất trong dung môi không tan trong
nước (hay dùng methylen clorid, dichloromethan…) được nhũ hoá vào pha ngoại

chứa chất n định dưới tác động của lực cơ học. Dung môi hữu cơ được bốc hơi
khỏi hệ nhờ nhiệt ho c khuấy trộn liên tục, tiểu phân nano hình thành do sự thay đ i
dung môi [61].
Trong phương pháp nhũ hoá bốc hơi dung môi, mỗi tiểu phân được hình thành
từ một giọt pha dầu và k ch thước tiểu phân phụ thuộc vào k ch thước giọt pha dầu
[46].
Ưu điểm: Áp dụng được với cả dược chất thân nước và thân dầu [61].
Nhược điểm: Khó nâng quy mô do cần nhiều năng lượng trong quá trình đồng
nhất. Giọt pha dầu dễ bị kết tụ lại trong quá trình bốc hơi dung môi làm tăng KTTP
[47], [61].
1.2.3.2.

h

g h

hũ hóa khuếch tán dung môi

Dung dịch dược chất trong dung môi hữu cơ tan một phần trong nước (hay dùng
ethyl acetat, alcol benzylic…) được nhũ hoá vào 1 dung dịch chứa chất n định đã
được bão hoà trước đó bằng dung môi hữu cơ. Nhũ tương được phối hợp với 1 thể
t ch nước lớn hơn và được khuấy trộn nhẹ nhàng, dung môi khuếch tán từ giọt pha
dầu vào môi trường, hình thành các tiểu phân nano polyme [39], [40], [41], [47].
Các nghiên cứu cho thấy quá trình hình thành tiểu phân nano từ giọt pha dầu
không thể giải th ch được bằng 1 cơ chế đơn thuần mà là sự kết hợp của nhiều cơ
chế khác nhau liên quan đến rất nhiều yếu tố trong quá trình bào chế. Một giọt pha
dầu có thể tạo ra một ho c vài tiểu phân nano [39], [40].
Ưu điểm: Dễ kiểm soát về m t k ch thước, dễ nâng quy mô, độ l p lại giữa các
lô mẻ cao [61].
Nhược điểm: Dược chất bị thất thoát ra ngoài môi trường. Lượng nước lớn, gây

khó khăn trong quá trình thu hồi sản phẩm [61].
1.2.4.

nh ch t và một số ch tiêu đánh giá hệ tiểu phân nano

Hệ tiểu phân nano là hệ siêu vi tiểu phân, mắt thường không nhìn thấy được.
Trong khi đó, các tính chất và đ c điểm của tiểu phân lại gắn ch t chẽ với sự phân

6


bố và tác dụng trong cơ thể. Vì vậy, kiểm soát và đánh giá được tính chất của hệ
tiểu phân trong quá trình bào chế, sử dụng hệ tiểu phân nano là hết sức quan trọng
[13].
1.2.4.1. Hình thái bên ngoài
Đây là thông số quan trọng ảnh hưởng đến đ c tính và tác dụng của hệ như hình
dáng, hình thái bề m t, phân bố không gian. Hình thái bên ngoài của tiểu phân nano
được quan sát bằng các kính hiển vi điện tử và quang ph hiện đại như:
Kính hiển vi điện tử quét (SEM: Scanning electron microscopy) là một phương
pháp để quan sát trực tiếp các tiểu phân nano, chụp được ảnh tiểu phân có kích
thước 10 nm, phóng đại từ 10 – 300.000 lần, cung cấp thông tin về sắp xếp cấu trúc,
phân bố không gian, hình ảnh bề m t tiểu phân [13], [31].
Hiển vi điện tử truyền qua (TEM: Transmission electron microscopy) cho hình
ảnh rõ hơn so với SEM về hình thái, cấu trúc tinh thể, số lượng và hướng của tiểu
phân, có thể xác định được vị trí tiểu phân trong tế bào [13].
Ph cộng hưởng từ hạt nhân có thể ghi hình ảnh ba chiều của tiểu phân, có thể
chụp tiểu phân 1 nm [13].
1.2.4.2. Phân bố kích th ớc tiểu phân
Yêu cầu hệ có phân bố kích thước tiểu phân càng hẹp càng tốt. Trên thực tế, đây
là tiêu chí rất khó đạt được, nhất là sự đồng nhất về phân bố k ch thước giữa các lô

mẻ.
K ch thước tiểu phân có thể đo trực tiếp bằng một số thiết bị chụp hình ảnh nêu
trên. Xác định KTTP trung bình và chỉ số đa phân tán PDI (polydiversity index):
PDI từ 0,1 đến 0,25 được coi là phân bố hẹp, trên 0,5 là phân bố rộng [13].
1.2.4.3. Độ tích điện/thế zeta
Mục đ ch đo thế zeta để xác định sự t ch điện bề m t tiểu phân nhằm tối ưu hóa
thông số công thức và dự đoán độ n định của hệ [13].
Đối với những hệ tiểu phân nano có thế zeta từ -10 đến +10 mV được xem là
trung tính. Với những hệ tiểu phân nano có thế zeta lớn hơn 30 mV hay nhỏ hơn 30 mV thì được xem như các cation mạnh và anion mạnh tương ứng. Do hầu hết

7


các màng tế bào có điện tích âm nên thế zeta có thể ảnh hưởng tới xu hướng thấm
của tiểu phân nano qua màng. Với thế zeta dương thì khả năng biểu thị độc tính
nhiều hơn do có thể gây vỡ thành tế bào [22].
1.2.4.4. X c định tính chất hệ tiểu phân nano
Quang ph hồng ngoại cung cấp thông tin về cấu trúc nguyên tử ở trạng thái rắn
khi nghiên cứu sự chuyển động của các phân tử. Bằng cách so sánh ph hồng ngoại
của dược chất tinh khiết, tá dược và hệ tiểu phân nano dạng đông khô, có thể xác
định được sự tương tác giữa dược chất và tá dược trong hệ tiểu phân nano [5].
1.2.5. Nhược điểm về độ n đ nh của tiểu phân nano po yme d ng hỗn d ch
Việc bảo quản tiểu phân nano dưới dạng hỗn dịch g p nhiều nhược điểm về độ
n định [61]:
-

Thể t ch nước lớn, hàm lượng dược chất trong 1 đơn vị thể tích thấp.

-

Dễ nhiễm vi sinh vật.

-

Polyme có thể bị thuỷ phân trong quá trình bảo quản.

-

Dược chất bị mất dần hoạt tính.

-

Các tiểu phân nano có thể bị kết tụ, sa lắng.

-

Khó khăn trong quá trình phân liều.

Những nhược điểm trên giúp khẳng định được vai trò quan trọng của việc rắn
hóa hệ tiểu phân nano: kết hợp được những ưu điểm của hỗn dịch nano (hệ nano
dạng lỏng – tăng khả năng hòa tan và sinh khả dụng [13]) với dạng bào chế rắn
(thuận tiện trong kiểm soát quá trình, tính n định cao và tăng khả năng tuân thủ
điều trị của bệnh nhân [7]).
1.3.
1.3.1.

Một số phƣơn pháp rắn hóa hệ tiểu phân nano
ng kh

Đông khô là quá trình làm khô chế phẩm trong các điều kiện đ c biệt, trong đó

chế phẩm được đông lạnh sau đó loại dung môi bằng cách thăng hoa trực tiếp (giai
đoạn làm khô sơ cấp) và giải hấp phụ (giai đoạn làm khô thứ cấp) để ngăn ch n các
phản ứng hoá học và sự phát triển của vi sinh vật từ đó tăng độ n định của chế
phẩm.

8


Đông khô là phương pháp thường được sử dụng để loại nước và tăng độ n định
cho hệ nano. Ngoài ra, bột đông khô còn được sử dụng để xác định hiệu suất quá
trình và chuẩn bị mẫu dùng trong các phương pháp phân t ch như DSC, FT–IR,
nhiễu xạ tia X hay quan sát hình thái (chụp SEM). Tuy vậy, bản thân quá trình đông
khô cũng sinh ra các điều kiện khắc nghiệt có thể gây mất n định và thay đ i các
đ c tính hệ nano. Do vậy, thành công của quá trình đông khô phụ thuộc rất nhiều
vào thành phần công thức và các thông số kỹ thuật trong quá trình đông khô [16].
Tại đại học Dược Hà Nội, phương pháp đông khô đã được sử dụng trong nhiều
nghiên cứu về hệ tiểu phân nano, có thể kể đến như hệ nano GLP – PLGA/CS [11]
hay hệ nano piroxicam [9]. Hỗn dịch sau khi phân tán lại vẫn có KTTP nhỏ và đồng
nhất [11].
1.3.2. Phun s y
Nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc sử dụng phương pháp phun sấy để
tăng độ n định của tiểu phân nano. So với đông khô, phun sấy có một số ưu điểm
như thao tác nhanh, chi ph tương đối thấp, phù hợp với quy mô công nghiệp, bột
phun sấy có thể dùng dưới dạng hỗn dịch ho c đưa vào viên nén, viên nang. Bên
cạnh đó, hiện nay một số phương pháp phun sấy cải tiến đã xuất hiện, góp phần cải
thiện những hạn chế của phun sấy như cần gia nhiệt, có thể tác động lên tính toàn
vẹn của tiểu phân nano và dược chất [61].
Nghiên cứu của Dengning Xia và cộng sự (2016) nhận định phun sấy là một
phương pháp khả thi để củng cố độ n định của hệ nano lipid FB cho dạng bột. Các
tiểu phân nano lipid có thể giữ được dược chất và thời gian giải phóng thuốc kéo dài

sau khi phun sấy [64]. Theo khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học của Nguyễn Cảnh
Hưng: bột phun sấy nano azithromycin được phân tán trở lại vào nước bằng máy lắc
xoáy tạo hỗn dịch đục nhẹ và đo KTTP bằng công cụ ph tương quan photon cho
kết quả: KTTP trung bình của hệ tăng lên (từ hơn 200nm đến hơn 400nm) chứng tỏ
đã có sự kết tụ của các tiểu phân nano [12].
1.3.3.

o h t tầng s i

9


Các thiết bị tạo hạt kiểu tầng sôi được phát triển và ứng dụng trong công nghiệp
dược từ những năm 1960. Phương pháp này có nhiều ưu điểm như hạn chế bụi, tạo
hạt nhanh, hao phí và chi phí lao động thấp, thuận lợi để tự động hóa quá trình [3].
Trong quá trình tạo hạt tầng sôi, sự kết tập tiểu phân chất rắn và quá trình sấy
khô hạt được tiến hành đồng thời trên cùng một thiết bị. Khối bột tạo hạt được đảo
trộn bởi khí nóng. Dịch tạo hạt được phun vào khối bột, làm ẩm và tạo cầu nối lỏng
giữa các tiểu phân chất rắn. Dưới tác dụng của kh nóng, dung môi bay hơi, tá dược
dính tạo thành cầu nối rắn liên kết các tiểu phân chất rắn lại với nhau, tạo thành hạt
[52].
1.3.4. Phun hỗn d ch nano ên h t
 C chế bao tầng sôi:
Trong quá trình bao tầng sôi, kh nóng được th i từ dưới lên qua một tấm phân
phối kh đ t ở đáy, các nhân bao được luồng kh này đảo trộn và th i từ dưới lên đi
qua vùng phun dịch, dung dịch ho c hỗn dịch bao được phân tán thành các giọt chất
lỏng rất nhỏ bằng súng phun và bám vào nhân bao. Các giọt phun sẽ thấm ướt và
lan rộng ra trên bề m t nhân
bao, hợp nhất thành lớp
màng lỏng. Nhân bao tiếp

tục bị đẩy lên phía trên và
rơi xuống trong buồng khí
nóng, dung môi bay hơi
nhanh, các tiểu phân chất
bao hợp nhất lại thành lớp
màng liên tục phủ trên bề
m t nhân bao [3].
Hình 1.5. Thiết bị tầ g sôi th ờng dùng [8]
 Một số nghiên cứu dù g h

g h

bao tầng sôi:

Tác giả Zhiqiang Tian và cộng sự (2013) đã nghiên cứu phun hệ nano lipid FB
lên pellet nhân sử dụng máy bao tầng sôi. Kết quả cho thấy phương pháp này phù

10


hợp để rắn hóa hệ nano lipid: hạt thu được có đ c tính vật lý tốt, không tồn tại FB
dạng tinh thể trong pellet (theo kết quả phân tích nhiệt vi sai và nhiễu xạ tia X).
Pellet tạo thành có KTTP nano lipid trung bình là 227,5 nm, lớn hơn 94,1 nm so với
tiểu phân nano lipid ban đầu. Tuy nhiên, kết quả thử giải phóng nano lipid ban đầu
và pellet cho kết quả tương đương [55].
Tác giả Yang Lei và cộng sự (2011) đã tiến hành nghiên cứu phun hệ tự nhũ hóa
lỏng lên pellet nhân và kết luận phương pháp này tiềm năng để rắn hóa hệ tự nhũ
hóa [36].
1.3.5.

o pe et sử dụng thiết b đùn – t o cầu

Hỗn dịch nano lỏng được phối hợp với tá dược rắn (có thể thêm tá dược dính
thích hợp) thu được khối ẩm. Khối ẩm được đem đùn tạo sợi và vo tạo cầu thu được
pellet [58], [63].
Dạng bào chế pellet có nhiều ưu điểm như: phân tán rộng trong đường tiêu hóa,
giảm kích ứng, thời gian lưu ở dạ dày hằng định. Đ c điểm này giúp tối đa hóa sự
hấp thu thuốc, đồng thời giảm sự biến đ i bất thường của nồng độ đỉnh của thuốc
trong huyết tương. Kết quả làm giảm tác dụng phụ tiềm ẩn mà không giảm sinh khả
dụng của thuốc. Thêm vào đó, phương pháp đùn tạo cầu dễ dàng sản xuất với quy
mô lớn mang lại hiệu quả cao [15].
Tác giả Shashank Tummala và cộng sự (2015) đã nghiên cứu thành công pellet
bằng phương pháp đùn – tạo cầu từ nano 5-FU bao chitosan (bào chế bằng phương
pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi). Pellet tạo thành bền và giải phóng kéo dài 24 giờ.
Điều này dẫn đến giảm độc tính cho các tế bào khỏe vì phần lớn thuốc được định vị
trong vùng đại tràng, nên có thể giảm liều dùng cho bệnh nhân [58]. Tại Đại học
Dược Hà Nội, tác giả Ngô Thị Hằng cũng nghiên cứu bào chế thành công pellet
chứa hệ tự nhũ hóa artesunat bằng phương pháp đùn tạo cầu và đánh giá được một
số đ c tính của pellet bào chế được: hình thức cầu, đều, bề m t nhẵn; hiệu suất tạo
pellet cao trên 85%; hàm lượng dược chất và k ch thước tiểu phân gần như không
thay đ i nhiều và độ hòa tan sau 20 phút đạt gần 95% [10].

11


1.3.6. N p nano thuốc vào nhựa trao đ i ion
Nhựa trao đ i ion là các polyme liên kết chéo, không tan trong nước, mang
nhiều nhóm chức tạo muối tại các vị trí liên tiếp trên chuỗi polyme [50], [51]. Nhựa
trao đ i ion được chia thành 2 loại cơ bản: nhựa trao đ i cation và anion [49], [50],
[51].

Ở mức độ phân tử, trong cấu trúc nhựa trao đ i ion có các nhóm liên kết phân bố
dọc theo các chuỗi polyme tại các vị tr xác định. Do đó, cơ chế hấp phụ cũng giữ
một vai trò nhất định trong việc hình thành phức hợp nhựa trao đ i ion – dược chất.
Có 2 kỹ thuật cơ bản để để nạp thuốc vào nhựa:
-

Kỹ thuật mẻ: nhựa sau khi xử lý được khuấy trộn với hỗn dịch nano trong
những điều kiện cụ thể đến khi quá trình trao đ i đạt trạng thái cân bằng [49],
[51].

-

Kỹ thuật cột: không thường được ứng dụng trong bào chế, thường được sử
dụng trong tinh chế, phân tích kiểm nghiệm.

Tác giả Fatima S.D., Komal S1 và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu bào chế viên
nhai che vị đắng của Clarithromycin từ phức hợp nhựa – dược chất. Kết quả thử hòa
tan cho thấy sau 6 giờ dược chất được giải phóng tối đa và gần như không gây đắng
(do phức hợp tạo thành ức chế sự giải phóng thuốc trong nước bọt) [23].
1.4.

Một số n h n ứu về t n

ộ hòa tan của fenofibrat

Fenofibrat là hoạt chất thuộc nhóm acid fibric, ra đời vào năm 1975 và được đưa
vào sử dụng từ những năm 90 thế kỷ XX. FB có nhiều ưu điểm hơn hẳn các dẫn
chất khác trong nhóm về tần suất và cường độ gây ra tác dụng phụ, đ c biệt là
không gây tương tác dược động học với các dẫn chất thuộc nhóm statin [20], [24].
Điều đó rất thuận lợi khi sử dụng kết hợp 2 loại thuốc điều trị rối loạn tăng mỡ máu

theo cơ chế riêng biệt làm tăng hiệu quả điều trị mà lại rất an toàn cho người sử
dụng [18], [59]. Ngoài tác dụng làm giảm triglycerid, LDL – C (cholesterol xấu),
cholesterol toàn phần (TC) và apolipoprotein B, FB còn tăng đáng kể HDL – C
(cholesterol tốt) và apolipoprotein A [42], [56]. Vì các ưu điểm vượt trội đó, hiện

12


nay FB được dùng rất ph biến và là một trong những thuốc hạ mỡ máu được kê
đơn nhiều nhất.
Tuy nhiên, FB có độ tan thấp, tốc độ hòa tan chậm, sự hấp thu phụ thuộc vào các
thể, chế độ ăn và tình trạng tháo rỗng dạ dày. Nồng độ tối đa của FA trong máu có
thể dao động từ 0,5 đến 10 g/ml. Sự dao động lớn của nồng độ thuốc trong máu
không những làm sinh khả dụng không n định, hiệu quả điều trị không n định mà
còn gây tăng tần suất xuất hiện và cường độ các tác dụng phụ của thuốc [9]. Do vậy,
tăng sinh khả dụng bằng cách tăng độ hòa tan của FB là đề tài được nhiều nhà khoa
học quan tâm.
Để cải thiện khả năng hòa tan và nâng cao sinh khả dụng của FB, đã có các
nghiên cứu bào chế theo phương pháp khác nhau nhằm tạo ra dạng bột siêu mịn FB.
Tác giả Vogt M. và cộng sự (2008) đã thực hiện nghiên cứu biện pháp làm tăng độ
tan của FB bằng phương pháp tạo vi hạt, nghiền có phối hợp chất diện hoạt và phun
sấy. Bằng phương pháp phân t ch nhiệt vi sai và nhiễu xạ tia X xác định được có sự
chuyển từ dạng kết tinh sang dạng vô định hình của FB khi áp dụng phương pháp
phun sấy [62].
Để giảm liều dùng của FB và loại bỏ sự phụ thuộc vào tình trạng tháo rỗng dạ
dày (không phụ thuộc sự có m t của thức ăn) các nghiên cứu bào chế FB dưới dạng
nano đã được công bố. Một số dạng thuốc mới bào chế trên cơ sở các tiểu phân
nano của FB xuất hiện như: TriCor® của hãng Abbott được FDA chứng nhận vào
11/2004 với phương pháp chế tạo xay nghiền, dạng bào chế là viên nén hàm lượng
48 mg và 145 mg. Các chế phẩm này có SKD không phụ thuộc vào thức ăn [1].

Bằng kỹ thuật tạo hệ phân phối các dược chất không tan dạng vi cầu, viên nén
fenofibrat 160 mg có sinh khả dụng không phụ thuộc vào tình trạng tháo rỗng của
dạ dày. Các tác giả Guivarc’ch PH., Vachon MG. và Najib J. đã nghiên cứu ảnh
hưởng của thức ăn đến sinh khả dụng của viên bào chế từ vi cầu fenofibrat, kết quả
cho thấy hai nhóm dùng thuốc khi đói và no có các thông số dược động học tương
đương nhau [30], [42]. Tác giả Hanafy và cộng sự (2007) nghiên cứu dạng hỗn dịch
nano DissoCubes với cỡ hạt khoảng 338 nm và dạng nano lipid rắn cỡ hạt < 58 nm

13


là tương đương sinh khả dụng. Cả hai dạng này đều có sinh khả dụng cao hơn dạng
hỗn dịch vi hạt có k ch thước hạt < 5 mm [33]. Theo tác giả Yaping Chen và cộng
sự, kết quả mẫu liposome sử dụng lecithin cho sinh khả dụng lớn gấp 4 lần so với
viên nang bào chế từ bột siêu mịn FB [21]. Tác giả Gogotsi và cộng sự đã nghiên
cứu phương pháp nghiền bi tạo nano FB với muối ăn mịn k ch thước 300 m đã tạo
được siêu vi hạt FB k ch thước giảm xuống dưới 100 nm [38]. Tác giả Tran Tuan
Hiep đã nghiên cứu bào chế được nano lipid fenofibrat làm tăng khả năng thẩm thấu
của thuốc qua hàng rào tiêu hóa. Và đã chọn được công thức tối ưu hóa để đạt kích
thước hạt nhỏ (~ 150 nm), PDI nhỏ (< 0,4), giải phóng tốt (khoảng 60% thuốc đã
được giải phóng khỏi công thức trong 4 giờ đầu tiên, tiếp theo là sự giải phóng
tương đối chậm đến 24 giờ), độ n định vật lý tốt, hiệu suất nạp thuốc cao. Hơn nữa
còn chứng minh được có sự tăng cường rõ rệt tỷ lệ và mức độ sinh khả dụng thuốc
[57].
Tác giả Võ Quốc Ánh, Hoàng Kiều Vân (2010) đã nghiên cứu thành công viên
nén FB 160 mg từ hỗn dịch đ c vi hạt fenofibrat có độ hòa tan trong môi trường
SLS 1% sau 20 phút đạt khoảng 98%, tương đương viên Lypanthyl supra 160 mg;
cao hơn dạng bột siêu mịn fenofibrat (đạt khoảng 33%) và dạng bột nguyên liệu
fenofibrat (đạt khoảng 8%) [1], [14].
Hiện nay, tại Việt Nam đã có những nghiên cứu làm tăng độ hòa tan và sinh khả

dụng của FB sử dụng công nghệ nano. Tuy nhiên, chưa thấy nghiên cứu nào rắn hóa
hệ tiểu phân nano sử dụng phương pháp tạo hạt tầng sôi. Do vậy, sau khi xây dựng
được công thức, quy trình bào chế hệ tiểu phân nano FB và đánh giá một số đ c tính
của hệ, khóa luận này bước đầu nghiên cứu bào chế rắn hóa hệ tiểu phân nano FB
theo phương pháp đã đề cập.

14


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đố tƣợn

2.1.

2.1.1. Nguyên v t iệu
Bảng 2.1. Nguyên liệu đ ợc sử dụng trong quá trình thực nghiệm
STT

Tên nguyên liệu

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

1.

Fenofibrat

Trung Quốc

DĐVN IV

2.

Aerosil

Bỉ

USP 36 – NF 31

3.

Avicel PH 102

Đức

USP 36 – NF 31

4.

Eudragit EPO

Đức

USP 36 – NF 31

5.

Natri lauryl sulfat

Trung Quốc

USP 36 – NF 31

6.

Natri starch glycolat

Trung Quốc

USP 36 – NF 31

7.

Polyvinyl alcol (205)

Singapore

USP 36 – NF 31

8.

Ethyl acetat

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

9.

Methanol

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

10.

Acid phosphoric

Đức

Tinh khiết phân tích

11.

Kali dihydro phosphat

Đức

Tinh khiết phân tích

12.

Acid phosphoric

Đức

Tinh khiết phân tích

13.

Nhựa Anhui HPD 826

Trung Quốc

TCCS

2.1.2.

hiết b

-

Máy đo thế Zeta và xác định phân bố KTTP Zetasizer NanoZS90 (Anh).

-

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1260 (Mỹ).

-

Máy siêu âm cầm tay Vibra Cell, Sonics & Materials, INC (Mỹ).

-

Ống ly tâm chứa màng siêu lọc 10000Da, Millipore, Billerica, MA (Mỹ).

-

Tủ lạnh sâu Unicryo (Mỹ).

-

Máy tầng sôi Mini – Glatt (Đức).

-

Máy đông khô Alpha 1-2 LDplus, Martin Christ G. GmnH (Đức).

-

Máy quang ph hồng ngoại FT-IR 6700 JASCO (Nhật Bản).

-

Máy quang ph UV-VIS Optima SP-3000 nano (Nhật Bản).

-

Máy thử độ hòa tan PHARMATEST (Đức).
15


-

Máy lắc Vortex Mixter VM300 (Đức).

-

Máy lọc nước PURELAB classic UV, ELGA (Anh).

-

Máy đo pH SATORIUS TE 412 (Đức).

-

Máy đo độ trơn chảy ERWEKA GWF (Đức).

-

Máy đo tỷ trọng biểu kiến ERWEKA SMV (Đức).

2.2.
-

Nộ

un n h n ứu

Xây dựng quy trình bào chế tiểu phân nano FB. Đánh giá được ảnh hưởng
của một số yếu tố tới đ c tính của tiểu phân nano.

-

Bước đầu bào chế rắn hóa hệ tiểu phân nano FB theo 3 phương pháp:
(i)

Tạo hạt tầng sôi.

(ii)

Tạo hạt kép: tạo hạt ướt – tạo hạt tầng sôi.

(iii)

Tạo hạt mang dược chất bằng nhựa trao đ i ion.

Đánh giá một số đ c tính của hạt: định lượng, khả năng giải phóng, KTTP
nano sau khi phân tán lại, tương tác giữa dược chất và các tá dược.
2.3.

Phƣơn pháp n h n ứu

2.3.1. Phương pháp bào chế tiểu phân nano fenofibrat
Qua tham khảo đề tài “Nghiên cứu bào chế nano azithromycin bằng phương
pháp nhũ hóa khuếch tán dung môi” của dược sĩ Nguyễn Cảnh Hưng [12], xây dựng
phương pháp bào chế tiểu phân nano FB như sau:
2.3.1.1. Cô g thức
Bảng 2.2. Công thức bào chế tiểu phân nano FB
Thành phần

Số lƣợng

Eudragit EPO + FB

1,5 g

Ethyl acetat

10 ml

Dung dịch PVA 0,5% (bão hoà với 5 ml ethyl acetat)

50 ml

Dung dịch PVA 0,1% (pha pha loãng)

Thay đ i

2.3.1.2. Quy trình bào chế:
-

Chuẩn bị pha dầu: hoà tan FB và polyme Eudragit EPO vào ethyl acetat.

-

Chuẩn bị pha nước: dd polyvinyl alcol (PVA) nồng độ 0,5%. Trong đó:
16