Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời sildenafil, tadalafil và vardenafil trong thực phẩm chức năng bằng LC MS MS

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

LƢU HỒNG QUÝ
Mã sinh viên: 1201507

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI
SILDENAFIL, TADALAFIL VÀ
VARDENAFIL TRONG THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG BẰNG LC-MS/MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

LƢU HỒNG QUÝ
Mã sinh viên: 1201507

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI
SILDENAFIL, TADALAFIL VÀ
VARDENAFIL TRONG THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG BẰNG LC-MS/MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Nguyễn Lâm Hồng
2. ThS. Lê Hồng Dũng

Nơi thực hiện:
Viện Dinh dưỡng

HÀ NỘI – 2017


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực hiện, khóa luận “Xây dựng phƣơng pháp phân tích
đồng thời Sildenafil, Tadalafil và Vardenafil trong thực phẩm chức năng bằng LCMS/MS” đã đƣợc hoàn thành. Để có đƣợc kết quả này, ngoài nỗ lực của bản thân,
em đã nhận đƣợc rất nhiều sự động viên, giúp đỡ từ phía nhà trƣờng, bộ môn, nơi
em thực hiện đề tài- viện dinh dƣỡng và gia đình, bạn bè.
Trƣớc tiên, em xin bày tỏ sự kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn
Lâm Hồng, cô đã tận tình định hƣớng, chỉ bảo, đóng góp ý kiến và động viên em
trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Lê Hồng Dũng , ngƣời đã trực
tiếp hƣớng dẫn, hỗ trợ và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình nghiên cứu, thực
hiện khóa luận. Bên cạnh đó em cũng xin gửi lời cám ơn đến các anh chị ở khoa
Hóa thực phẩm đã giúp đỡ và tạo điều kiện rất nhiều cho em thực hiện khóa luận
này.
Trong quá trình thực hiện, tuy đã nỗ lực và cố gắng hết mình nhƣng sẽ không
tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận đƣợc những ý kiến chỉ bảo, góp ý từ
các thầy cô để khóa luận của em tiếp tục đƣợc hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, ngày 11 tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Lƣu Hồng Quý

i

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
MỤC LỤC .................................................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..............................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................................. viii
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu ..............................................................3
1.1.1. Chất ức chế PDE-5 ...................................................................................3
1.1.2. Sildenafil...................................................................................................4
1.1.3. Tadalafil ....................................................................................................5
1.1.4. Vardenafil .................................................................................................7
1.1.5. Các chất ức chế PDE-5 khác ....................................................................8
1.1.6. Một số phƣơng pháp phân tích sildenafil, tadalafil và vardenafil hiện
nay ...............................................................................................................................8
1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ .............................................................12
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........................................................12
1.2.2. Khối phổ (Mass spectrometry) ...............................................................13
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................17
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ..................................................................................17
2.2. Nguyên vật liệu ............................................................................................17
2.2.1.Chất chuẩn ...............................................................................................17

ii


2.2.2. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn ................................................................17

2.2.3. Chuẩn bị các dung dịch mẫu placebo .....................................................17
2.2.4. Dung môi, hóa chất ................................................................................18
2.2.5. Thiết bị, dụng cụ .....................................................................................18
2.2.6. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................19
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................19
2.3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích sildenafil, tadalafil và vardenafil bằng
LC-MS/MS ................................................................................................................19
2.3.1.1. Khảo sát điều kiện khối phổ ................................................................19
2.3.1.2. Khảo sát điều kiện LC .........................................................................19
2.3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu .................................................................20
2.3.3. Thẩm định quy trình ...............................................................................20
2.3.4. Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng để kiểm tra mẫu thực phẩm chức
năng đang lƣu hành trên thị trƣờng ...........................................................................22
2.4. Xử lý kết quả ...............................................................................................22
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................23
3.1. Xây dựng quy trình phân tích ......................................................................23
3.1.1. Tối ƣu các điều kiện khối phổ ................................................................23
3.1.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký. .....................................................................26
3.1.2.1. Cột sắc ký. ...........................................................................................26
3.1.2.2. Khảo sát chƣơng trình pha động. ........................................................26
3.1.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu. ...............................................................29
3.1.3.1. Khảo sát dung môi chiết. ....................................................................29
3.1.3.2. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết. .............................................................30
iii


3.1.3.3. Khảo sát số lần chiết. ...........................................................................31
3.1.3.4. Khảo sát thời gian siêu âm. .................................................................32
3.1.4. Quy trình phân tích đồng thời sildenafil, tadalafil và vardenafil trong
thực phẩm chức năng ................................................................................................33

3.2. Thẩm định phƣơng pháp ..............................................................................36
3.2.1. Độ ổn định của hệ thống LC-MS/MS ....................................................36
3.2.2. Tính chọn lọc ..........................................................................................36
3.2.3. Khoảng tuyến tính ..................................................................................39
3.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng. ............................................42
3.2.5. Độ lặp lại của phƣơng pháp ....................................................................44
3.2.6. Độ thu hồi. ..............................................................................................46
3.3.Ứng đụng phƣơng pháp phân tích đã xây dựng một số mẫu thực tế trên thị
trƣờng ........................................................................................................................50
BÀN LUẬN ..............................................................................................................56
KẾT LUẬN .............................................................................................................567
ĐỀ XUẤT .................................................................................................................60
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

iv


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Association of Official

Hiệp hội các nhà hóa phân tích

Analytical communities

chính thức

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

CAD

Collision Gas Pressure

Áp suất khí bắn phá

CE

Collision Energy

Năng lƣợng bắn phá

CUR

Curtain Gas

Khí màn

CV

Coefficient of Variation

Hệ số biến thiên

CXP

Collision cell Exit Potential

Thế đầu ra

DP

Declustering Potential

Thế đầu vào

ESI

Electrospray ionization

Ion hóa phun điện tử

GS1

Ion Source Gas 1

Áp suất khí 2 bên đầu phun

GS2

Ion Source Gas 2

Áp suất của luồng khí nóng (GS2)

HPLC

High performance

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

AOAC

Liquidchromatography
IS

Ionspray Voltage

Thế ion hóa

LC-MS/MS

Liquid chromatography

Sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ

tandem mass spectrometry
LOD

Limit of detection

Giới hạn định tính

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lƣợng

MeOH

Methanol

MS

Mass Spectrometry

Khối phổ

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hƣởng từ hạt nhân

PDE-5

Phosphodiesterase - 5

RSD%

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

Sil

Sildenafil

Tad

Tadalafil

v


TEM

Ion source Temperature

Nhiệt độ mao quản

UV

Ultraviolet

Tử ngoại

Var

Vardenafil

vi


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Một số phương pháp phân tích đồng thời các chất ức chế PDE-5 .......11
Bảng 3.1 Điều kiện hoạt động của nguồn ion hóa ESI .........................................23
Bảng 3.2 Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh của mỗi chất ................25
Bảng 3.3 Chương trình Gardient theo pha động 3 ...............................................28
Bảng 3.4 Nồng độ các chất tìm thấy với dung môi chiết khác nhau (ng/ml) .......30
Bảng 3.5 Nồng độ các chất tìm thấy với các tỷ lệ dung môi chiết khác nhau
(ng/ml) .......................................................................................................................31
Bảng 3.6 Nồng độ các chất tìm thấy với số lần chiết xuất khác nhau (ng/ml) .....32
Bảng 3.7 Nồng độ các chất tìm thấy với các mức thời gian siêu âm (ng/ml).......33
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống ..............................................36
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của sildenafil, tadalafil và
vardenafil ..................................................................................................................40
Bảng 3.10 Giá trị S/N của các pic nạp chuẩn và kết quả LOQ, LOD ..................42
Bảng 3.11 Kết quả xác định độ lặp lại đối với sildenafil, tadalafil , vardenafil ..44
Bảng 3.12 Kết quả xác định độ thu hồi với mức nạp chuẩn nồng độ thấp...........46
Bảng 3.13 Kết quả xác định độ thu hồi với mức nạp chuẩn nồng độ trung bình .47
Bảng 3.14 Kết quả xác định độ thu hồi với mức nạp chuẩn nồng độ cao ............49
Bảng 3.15 Kết quả phân tích một số mẫu thực tế trên thị trường ........................53

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Sơ đồ minh họa cơ chế hoạt động của các chất ức chế
phosphodiesterase-5 (PDE-5) .....................................................................................3
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của sildenafil ...............................................................4
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của tadalafil ................................................................6
Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của vardenafil .............................................................7
Hình 1.5 Sơ đồ khối của máy LC-MS/MS .............................................................14
Hình 1.6 Bộ nguồn ion hóa ESI ............................................................................15
Hình 1.7 Bộ phân tích tứ cực chập ba ..................................................................15
Hình 3.1 Phổ khảo sát các ion con của sildenafil, tadalafil và vardenafil ..........24
Hình 3.2 Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp với pha động 1 ..............................................27
Hình 3.3 Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp với pha động 2 ..............................................27
Hình 3.4 Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp với pha động 3 ..............................................27
Hình 3.5 Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 100 ppb .........................................................37
Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu Placebo (không pha loãng) ...........................................38
Hình 3.7 Sắc ký đồ của mẫu placebo nạp chuẩn hỗn hợp nồng độ 40ppb...........38
Hình 3.8 Sắc ký đồ mảnh con của mỗi chất ..........................................................39
Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng
độ của các chất vardenafil, sildenafil và tadalafil ....................................................41
Hình 3.10 Giá trị S/N của vardenafil, sildenafil và tadalafil trong mẫu nạp chuẩn
...................................................................................................................................43
Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu X5 .................................................................................51
Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu X12 ...............................................................................51
Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu X18 ...............................................................................52
viii


Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu X7 .................................................................................52

Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu X10 và chuẩn hỗn hợp 500ppb với các mảnh con của
sildenafil ....................................................................................................................55

ix


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu bảo vệ và nâng cao sức khỏe lại càng
đƣợc quan tâm. Chính những nhu cầu này và xu hƣớng “trở lại với tự nhiên” đã tạo
điều kiện cho thị trƣờng thực phẩm chức năng ngày càng phát triển, đặc biệt là thực
phẩm chức năng có nguồn gốc từ thảo dƣợc. Cùng với sự quản lý chƣa chặt chẽ, vì
lợi nhuận, nhiều nhà sản xuất đã trộn trái phép thuốc tân dƣợc vào sản phẩm thực
phẩm chức năng để tạo ra tác dụng nhanh với ngƣời sử dụng,.
Năm 2013, Cục An toàn thực phẩm (ATTP) Bộ Y tế có Quyết định số
160⁄QĐ-ATTP thu hồi hiệu lực giấy chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm số
16047⁄2010⁄YT⁄CNTC ngày 15.12.2010 cấp cho sản phẩm “Thực phẩm bảo vệ sức
khỏe Khải Việt Hƣơng cảng Canh Công Phu”. Nguyên nhân là vì sản phẩm này có
chứa hoạt chất sildenafil hàm lƣợng 4 mg/g, dù đƣợc quảng cáo trên mạng là “100%
từ thảo dƣợc…”. Năm 2014, Cục An toàn thực phẩm cũng có quyết định thu hồi và
tiêu hủy toàn bộ sản phẩm thực phẩm chức năng Kim thận bảo 1 New của Công ty
TNHH Thƣơng mại Dƣợc phẩm Nam Á do có chứa chất tadalafil (36 mg/viên) và
sildenafil (123 mg/viên). Gần đây, sản phẩm “Avena plus” của công ty TNHH
MTV đầu tƣ và thƣơng mại xuất nhập khẩu Việt Nam Canoves đã bị Viện kiểm
nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia phát hiện có chứa sildenafil và cục An
toàn thực phẩm đã ra quyết định tạm dừng lƣu thông, thu hồi lô sản phẩm trên.
Việc các nhà sản xuất thực phẩm chức năng đƣa thêm các tân dƣợc, đặc biệt
là các chất cấm vào sản phẩm trong khi vẫn quảng cáo và đăng ký là sản phẩm có
nguồn gốc thiên nhiên là một sự gian dối, không những làm mất niềm tin ở khách
hàng mà còn có thể ảnh hƣởng trực tiếp đến sức khỏe ngƣời sử dụng. Vì vậy việc
kiểm soát các chất cấm trong thực phẩm chức năng nói chung và trong các sản

phẩm liên quan đến hỗ trợ sinh lý nam giới nhƣ sildenafil, tadalafil và vardenafil là
rất cần thiết để đảm bảo sức khỏe ngƣời dùng.

1


Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời Sildenafil, Tadalafil và
Vardenafil trong thực phẩm chức năng bằng LC-MS/MS” với 2 mục tiêu chính:
1. Xây dựng quy trình chiết xuất, điều kiện sắc ký, điều kiện MS phù hợp để
xác định đồng thời 3 chất sildenafil, tadalafil, vardenafil và thẩm định phương pháp
đã xây dựng.
2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để kiểm tra 1 số mẫu thực phẩm chức
năng có tác dụng bổ thận, tráng dương, tăng cường sinh lý nam giới đang lưu hành
trên thị trường.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
1.1.1.

Chất ức chế PDE-5

PDE-5 là men phân bố nhiều ở mô thể hang dƣơng vật, cơ trơn mạch máu, tiểu
cầu; có tác dụng làm giãn cơ trơn dƣơng vật, giãn mạch, ức chế tiểu cầu. Các chất
ức chế PDE-5 đƣợc khuyến cáo điều trị đầu tay cho rối loạn cƣơng dƣơng. Tuy
nhiên, không nên sử dụng các chất này ở nam giới suy tim nặng, đau thắt ngực
không ổn định, có tiền sử đột quỵ, nhồi máu cơ tim hoặc những ngƣời có huyết thấp

(<90/50mmHg), suy gan nặng.
Cơ chế hoạt động của nhóm thuốc ức chế PDE-5:

Kích thích tình dục
GTP
Nitric oxide

Guanylyl cyclase
Protein
cGMP
PDE-5

Chất ức chế PDE-5

Protein

5‟-GMP

kinase G
Protein P
Giảm Ca2+
Giãn mạch
máu thể hang

Cƣơng dƣơng
Hình 1.1. Sơ đồ minh họa cơ chế hoạt động của các chất ức chế
phosphodiesterase-5 (PDE-5)
Sau giai đoạn kích thích tình dục, làm tăng sản sinh nitric oxide (NO) từ tế bào
thần kinh hoặc tế bào nội mô mạch máu. Điều này làm tăng quá trình chuyển hóa
guanosine triphosphate (GTP) thành cyclic guanosine monophosphate (cGMP), làm

3


giãn các mạch máu ở thể hang, tạo điều kiện cho quá trình cƣơng cứng. PDE-5 là
một enzyme phân hủy cGMP, vì vậy các chất ức chế PDE-5 sẽ ngăn cản quá trình
thủy phân cGMP, làm tăng tác dụng giãn mạch của NO, làm tăng cƣờng khả năng
cƣơng dƣơng cho các bệnh nhân bị rối loạn cƣơng dƣơng.
Sildenafil, tadalafil và vardenafil là 3 hoạt chất có khả năng ức chế PDE-5 nên
đƣợc sử dụng để điều trị rối loạn cƣơng dƣơng. Ngoài ra, sildenafil và tadalafil còn
đƣợc sử dụng để cải thiện khả năng vận động ở ngƣời trƣởng thành khi có triệu
chứng tăng huyết áp động mạch phổi (pulmonary arterial hypertension – PAH: áp
lực máu cao trong mạch máu đến phổi là gây ra khó thở, chóng mặt, mệt mỏi).
Sildenafil và tadalafil điều trị chứng PAH bằng cách giãn mạch phổi và giúp máu
lƣu thông dễ dàng hơn.
Dù ba chất này có cùng cơ chế hoạt động, nhƣng do sự khác biệt về cấu trúc phân
tử (sildenafil và vardenafil có cấu hóa học tƣơng đối giống nhau nhƣng tadalafil lại
rất khác) dẫn đến sự khác nhau về dƣợc động học và hiệu quả lâm sàng. Tadalafil
có thời gian tác dụng kéo dài hơn, ít tác dụng phụ hơn và quá trình hấp thu không bị
ảnh hƣởng bởi thức ăn.
Ba chất này thuộc chung nhóm chất gọi là nhóm chất ức chế phosphodiesterase
(PDE), có nhiều tác dụng phụ và là những thuốc phải kê đơn và khi sử dụng phải
đƣợc sự giám sát chặt chẽ của bác sĩ điều trị.
1.1.2

Sildenafil

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của sildenafil
Công thức: C22H30N6O4S [17], [23]
Phân tử lƣợng: 474,6 g/mol

4


Tên khoa học: 1-[4-ethoxy-3-(6,7 dihydro-1-methyl-7-oxo-3-propyl-1Hpyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl) phenylsulfonyl]-4-methylpiperazine
pKa = 5,99
a. Tính chất
Bột kết tinh trắng đến trắng xám nhạt, không mùi, vị đắng, không tan trong nƣớc
và ethanol, tồn tại dƣới dạng muối với acid citric.
b. Một số biệt dược
Viagra 25mg, 50mg, 100mg. Revatio 20mg.
c. Chỉ định
Rối loạn cƣơng dƣơng và tăng huyết áp động mạch phổi.
d. Liều dùng
Ngƣời lớn
-

Rối loạn chức năng cƣơng dƣơng: đƣờng uống 50 mg/ngày x uống trƣớc 1

giờ (dao động từ 30 phút đến 4 giờ) khi có nhu cầu tình dục. Liều dao động từ 25100 mg/ngày x 1 lần.
-

Tăng huyết áp động mạch phổi: đƣờng uống 20mg x 3 lần/ngày.

e. Tác dụng phụ
Tác dụng phụ thƣờng gặp là nhức đầu, đỏ bừng mặt, rối loạn tiêu hóa, đau cơ và
rối loạn thị giác tăng lên khi sử dụng liều >100 mg/ngày.
f.

Tương tác thuốc

-

Sử dụng sildenafil và chất ức chế PDE-5 khác đồng thời với các nitrat hữu cơ

và nitrit (nitroglycerin) sẽ làm tăng tác dụng giãn mạch gây hạ huyết áp.
-

Thức ăn: mức độ và tốc độ hấp thu sildenafil bị giảm khi sử dùng đồng thời

với thức ăn giàu chất béo.
-

Tác dụng của sildenafil tăng lên khi sử dụng đồng thời với thuốc ức chế

CYP3A4 nhƣ thuốc chống nấm, kháng sinh marcrolid.
1.1.3

Tadalafil

Công thức: C22H19N3O4 [17], [23]
Phân tử lƣợng: 389,404 g/mol

5


Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của tadalafil
Tên khoa học: (6R-12αR)-6-(1,3-benzodioxol-5-yl)-2,3,6,7,12,12α-hexahydro-2methyl-pyrazino [1‟,2‟:1,6] pyridol[3,4-b]indole-1,4-dione
pKa = 0,85
a. Tính chất
Bột kết tinh trắng, hầu nhƣ không tan trong nƣớc, tan không đáng kể trong

methanol, acetone và ethanol.
b. Một số biệt dược
Cialis 20mg, Cialis 10mg, Cialis 5mg, Adcirca…
c. Chỉ định
-

Rối loạn cƣơng dƣơng.

-

Tăng huyết áp động mạch phổi.

d. Liều dùng
-

Rối loạn cƣơng dƣơng: đƣờng uống 10 mg trƣớc khi có nhu cầu tình dục

khoảng 30 phút. Liều có thể dao động từ 5-20 mg/ngày.
-

Tăng huyết áp động mạch phổi: đƣờng uống 40mg/lần/ngày, không ảnh

hƣởng bởi thức ăn.
e. Tác dụng phụ
Các tác dụng phụ thƣờng gặp là: Nhức đầu, khó tiêu, đau lƣng, đau cơ.
f.

Tương tác thuốc

- Giống với các PDE-5 khác, khi sử dụng đồng thời tadalafil với các nitrat, nitrit

sẽ làm tăng tác dụng giãn mạch của các thuốc này, gây hạ huyết áp quá mức.
6


- Tadalafil chuyển hóa qua CYP3A4, vì vậy khi sử dụng đồng thời với các thuốc
cảm ứng enzym CYP3A4 nhƣ Phenobarbital, rifampicin…sẽ làm giảm tác dụng của
tadalafil. Sử dụng đồng thời với các chất ức chế CYP3A4 nhƣ ketoconazol,
erythromycin…sẽ làm tăng tác dụng của tadalafil.
- Với thức ăn: quá trình hấp thu của tadalafil không bị ảnh hƣởng bởi thức ăn.
1.1.4

Vardenafil

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của vardenafil
Công thức: C23H32N6O4S [17], [23]
Phân tử lƣợng: 488,604 g/mol
Tên khoa học: 4-[2-ethoxyl-5-(4-ethylpiperazin-1-yl)sulfonyl-phenyl]-9-methyl7-propyl-3,5,6,8-tetrazabicyclo[4,3,0]nona-3,7,9-trien-2-one
pKa1 = 4,72; pKa2 = 6,21
a. Tính chất
Bột kết tinh màu trắng đến trắng nhạt, không mùi, vị đắng, tan trong nƣớc và
ethanol, tồn tại dƣới dạng muối hydroclorid.
b. Một số biệt dược
Levitra 5mg, 10mg, 20mg
c. Chỉ định
Điều trị rối loạn cƣơng dƣơng ở nam giới trƣởng thành.
d. Liều dùng
Đƣờng uống 10 mg trƣớc khi có nhu cầu quan hệ tình dục từ 25 – 60 phút. Liều
có thể dao động từ 5- 20 mg tùy thuộc vào hiệu quả lâm sàng.
e. Tác dụng phụ

7


Nhức đầu, đỏ bừng mặt, xung huyết mũi, khó tiêu, thay đổi thị giác, nhìn mờ.
Trong một số trƣờng hợp, gây cứng cơ và cƣơng kéo dài hoặc cƣơng đau.
f.

Tương tác thuốc

- Giống với sildenafil, vardenafil khi dung chung với các thuốc giãn mạch nitrat,
nitrit sẽ làm tăng khả năng gian mạch của các thuốc này, gây hạ huyết áp quá mức.
- Vardenafil chuyển hóa qua CYP3A4 và CYP2C9, vì vậy nếu dung chung với
các thuốc ức chế hoặc kích thích CYP3A4 hoặc CYP2C9 sẽ làm thay đổi tác dụng
của vardenafil nhƣ ketoconazol, erythromycin, chất ức chế protease, ritonavir,
cimetidin…
- Với thức ăn: Tốc độ và mức độ hấp thu vardenafil giảm khi sử dụng cùng với
bữa ăn có nhiều chất béo.
1.1.5
Các chất ức chế PDE-5 khác
Hiện nay chỉ có 3 dƣợc chất tổng hợp thuộc nhóm chất ức chế PDE-5 đƣợc công
nhận làm thuốc điều trị rối loạn cƣơng dƣơng là sildenafil, tadalafil và vardenafil.
Ngoài ra các chất tƣơng tự chúng nhƣ: homosildenafil, hydroxyhomosildenafil,
acetildenafil, nor-acetildenafil, hydroxyacetildenafil, piperadino acetildenafil,
aminotadalafil, dimethylsildenafil, … chƣa đƣợc công nhận làm thuốc.
1.1.6
Một số phƣơng pháp phân tích sildenafil, tadalafil và vardenafil
hiện nay
a. Trên thế giới
Cùng với sự phát triển của thị trƣờng thực phẩm chức năng, những sản phẩm có
nguồn gốc từ thiên nhiên đƣợc giới thiệu với tác dụng tăng cƣờng sinh lý nam giới

cũng tăng trƣởng mạnh mẽ cả về số lƣợng mặt hàng và giá trị, tuy nhiên kèm theo
đó cũng là sự gia tăng của những báo cáo phát hiện việc trộn trái phép các chất ức
chế PDE-5. Ở Hàn Quốc [15], một nghiên cứu tiến hành trong 4 năm (2009-2012)
trên 164 mẫu thực phẩm chức năng đƣợc quảng cáo tăng cƣờng sinh lý nam giới
cho thấy 77 mẫu phát hiện có chứa chất ức chế PDE-5 gồm có 55 mẫu phát hiện
tadalafil, 36 mẫu phát hiện sildenafil, 17 mẫu phát hiện đồng phân của tadalafil
(aminotadalafil, chloropretadalafil, octylnortadalafil), 17 mẫu phát hiện đồng phân
sildenafil (dimethylsildenafil, dimethylthiosildenafil, hydroxyhomosildenafil, …),

8


một số mẫu phát hiện vardenafil cùng đồng phân (hydroxyvardenafil) và Icariin.
Một số mẫu phát hiện với hàm lƣợng rất cao sildenafil và tadalafil, do đó nếu sử
dụng những sản phẩm này thì ngƣời tiêu dùng sẽ gặp phải nguy cơ tác dụng không
mong muốn.
Vì vậy trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu nhằm phát hiện các chất sildenafil,
vardenafl, tadalafil và các chất có cấu trúc tƣơng tự. Phƣơng pháp phổ biến nhất để
phân tích sildenafil, tadalafil, vardenafil và các hợp chất ức chế PDE tƣơng tự là sắc
ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV/PDA [11],[14],[18],[19],[20],[21],[25],
[27] hoặc sử dụng detector khối phổ MS [12],[13],[22]. Một số ít nghiên cứu khác
sử dụng các phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ [10] để xác định các chất này. Đối
với các chất đồng phân hoặc chất mới, phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
(NMR) hoặc X-ray [9],[24] thƣờng đƣợc dùng để xác định cấu trúc trong các nền
mẫu dƣợc phẩm hay thực phẩm chức năng.
b. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, gần đây Cục An toàn thực phẩm đã kiểm tra, giám sát các sản phẩm
thực phẩm chức năng có tác dụng tăng cƣờng sinh lý nam giới xem có tình trạng
trộn trái phép các chất ức chế PDE-5 hay không. Phƣơng pháp đã đƣợc áp dụng là
sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS) nhằm mục đích xác định chính xác một

loạt các chất ức chế PDE-5.
Tham khảo các nghiên cứu đã công bố trên thế giới và căn cứ các điều kiện trang
thiết bị, đề tài này lựa chọn kỹ thuật sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS)
nhằm xây dựng một phƣơng pháp phân tích đồng thời các chất sildenafil, tadalafil
và vardenafil trong một số loại thực phẩm chức năng có tác dụng bổ thận, tráng
dƣơng, tăng cƣờng sinh lực ở nam giới, góp phần đảm bảo an toàn và bảo vệ sức
khỏe ngƣời tiêu dùng.

9


STT

Mẫu phân
tích

Kỹ thuật phân
tích

Bột
1

Viên nén
Viên nang

LC-ESI-MS/MS

Viên nén
Viên nang

Cân 0,5 g mẫu

Pha động:

Chiết bằng MeOH 70%,
siêu âm trong 30‟, sau đó
lọc qua màng lọc 0,2 µm

 Kênh A: acid formic 0,1%/H2O

UPLC-MS/MS

Cột C18 (2,1 mm × 100 mm, 1,7 μm)

Cân 0,5 g mẫu

Pha động:

Chiết bằng MeOH:H2O
(50:50), siêu âm trong
20‟, ly tâm 3000
vòng/phút trong 10 phút,
sau đó lọc qua màng lọc
0,2 µm

 Kênh A: amonium acetat 10mM/H2O
 Kênh B: ACN/MeOH (50:50)
Thể tích bơm 5 µL.
Cột C18 (2,1 mm × 100 mm, 2,6 μm)
Pha động:

Bột thực vật
Viên nén
Dung dịch
Gel

TLTK

[15]

Tốc độ 0,2 ml/phút.Thể tích bơm 2 µL.

Tốc độ 0,550 ml/phút.

3

Xử lý mẫu

Cột C18 (2,0 mm × 100 mm, 3 μm)

 Kênh B: acid formic 0,1%/ACN

Dung dịch

2

Điều kiện phân tích HPLC

LC-HRMS

 Kênh A: 10 mM NH4OFor(*) và 0,1%
FA(**) / H2O
 Kênh B:10 mM NH4OFor và 0,1% FA/
ACN:MeOH (50:50)
Tốc độ dòng 0,3 ml/phút.
Thể tích bơm 3 µL.
10

[16]

Cân 1,0 g mẫu
Chiết bằng ACN:H2O,
lắc, votex trong 15‟, ly
tâm > 3000 vòng/phút
trong 5 phút, pha loãng
đến nồng độ thích hợp,
sau đó lọc qua màng lọc
0,2 µm

[8]


Cột C18 (2,1 mm × 150 mm, 5 μm)
Pha động:

Bột
4

Viên nén

Cân khoảng 1 đơn vị mẫu

 Kênh A: acid formic 0,1%/H2O

LC-MS

 Kênh B: ACN

Dung dịch

Tốc độ dòng 0,4 ml/phút.

Chiết bằng ACN:H2O
(50:50), siêu âm 15‟, sau
đó lọc qua màng 0,2 µm

[13]

Thể tích bơm 1 µL.
Cột C18 (5 μm)
Pha động:
5

Dung dịch

HPLC-ESI-MS

 Kênh A: Amonium acetat 20mM và
acid formic 0,1%/H2O
 Kênh B: ACN

Mẫu lỏng lọc qua màng
0,45 µm. Pha loãng dịch
lọc với MeOH đến nồng
độ thích hợp.

Tốc độ dòng 0,2 ml/phút.
Thể tích bơm 5 µL.
Chú thích:
(*) NH4OFor: Amonium format
(**) FA: Acid formic
Bảng 1.1 Một số phương pháp phân tích đồng thời các chất ức chế PDE-5

11

[28]


1.2

TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết nối giữa sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và thiết bị khối phổ (MS).
Sau quá trình thử nghiệm lâu dài, đến đầu năm 1970 ngƣời ta mới kết nối thành
công LC với MS. Nguyên nhân của sự chậm trễ này là do khó khăn về kỹ thuật khi
đƣa dòng chất lỏng vào hệ thổng có độ chân không cao của máy khối phổ. Kể từ đó
đến nay sắc ký lỏng khối phổ không ngừng phát triển và chứng minh đƣợc tầm quan
trọng của mình trong phân tích.
Phân tích khối phổ có tính chọn lọc, độ nhạy, độ đặc hiệu cao. Giới hạn phát hiện

có thể đến 10-14 gam. Do vậy, phân tích khối phổ càng đƣợc áp dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực khoa học công nghệ nhƣ xác định các đồng vị, xác định công thức
cấu tạo, định tính, định lƣợng các chất có trong dịch sinh học và trong các sản phẩm
có nguồn gốc tự nhiên. Đặc biệt dùng để phân tích hàm lƣợng vết trong mẫu có
thành phần phức tạp.
1.2.1

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn, pha
động là chất lỏng. Các chất phân tích di chuyển qua cột, tốc độ di chuyển khác nhau
liên quan đến ái lực tƣơng đối của chất với pha tĩnh và pha động. Thành phần pha
động đƣa chất phân tích di chuyển qua cột cần đƣợc điều chỉnh để rửa giải các chất
phân tích với thời gian hợp lý [1].
-

Pha tĩnh trong HPLC:
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách hỗn hợp gồm nhiều

thành phần. Đó là chất rắn xốp, có kích thƣớc nhỏ, đƣờng kính 3 – 10 μm, có độ
phân cực khác nhau. Pha tĩnh đƣợc chế tạo từ các nhóm chức khác nhau ghép hóa
học trên giá mang, thƣờng là các hạt silica. Tùy theo bản chất pha tĩnh, ngƣời ta
phân ra hai loại:

12


 Sắc ký pha thuận: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực nhƣ triethylen
glycol, nƣớc; pha động là các dung môi hữu cơ ít phân cực nhƣ: n-hexan, toluen, iso
propyl ether. Trong sắc ký pha thuận chất ít phân cực nhất đƣợc rửa giải đầu tiên.

Khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lƣu giảm dần [1].
 Sắc ký pha đảo: pha tĩnh là các silica đã đƣợc alkyl hóa, ít phân cực.
Trong sắc ký pha đảo, các chất phân cực nhất đƣợc rửa giải đầu tiên, khi tăng độ
phân cực của pha động thời gian lƣu tăng lên [1].
-

Pha động trong HPLC
Pha động là dung môi rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc ký. Pha

động có thể là nƣớc, dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định.
Trong sắc ký pha thuận, pha động là các dung môi hữu cơ ít phân cực nhƣ: n-hexan,
benzen, chloroform, … Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ
phân cực nhƣ: nƣớc, methanol, acetonitril, … hay hỗn hợp của chúng [1].
-

Detector trong HPLC
Detector là bộ phận dùng để phát hiện các chất sau khi đƣợc tách riêng và

rửa giải ra khỏi cột sắc ký. Mỗi chất khi đi qua detector sẽ cho tín hiệu đáp ứng
khác biệt với nền pha động, qua đó cho phép đánh giá định tính, định lƣợng các
thành phần trong mẫu phân tích. Tùy thuộc vào tính chất lý, hóa của đối tƣợng chất
cần phân tích, detector sẽ đƣợc lựa chọn thích hợp để những chất này có đáp ứng
với detector. Các loại detector thƣờng đƣợc sử dụng trong HPLC: hấp thụ UV-Vis,
huỳnh quang, độ dẫn.
1.2.2

Khối phổ (Mass spectrometry)

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cở sở xác định khối lƣợng phân tử của các
hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion theo tỉ số giữa khối lƣợng và điện tích

(m/z) của chúng. Các ion đƣợc tạo thành trong buồng ion hóa, đƣợc gia tốc và tách
riêng nhờ bộ phân tích khối trƣớc khi đến detector . Tín hiệu tƣơng ứng với các ion
sẽ đƣợc thể hiện bằng một số vạch (pic) có cƣờng độ khác nhau tập hợp thành phổ
13


khối. Nó cung cấp thông tin định tính (khối lƣợng phân tử, nhân dạng các chất) xác
định cấu trúc và định lƣợng các chất [1].
Cấu tạo thiết bị khối phổ gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích,
detector.
Bộ phận MS

Bộ phận LC
Hệ thống cung
cấp dung môi

Bơm

Lò cột

Nguồn ion

Cột sắc ký

Phân tích
khối

Bộ phận

Detector

tiêm mẫu

Hệ chân không

Bơm chân

Xử lý và lƣu

không

giữ số liệu

Hình 1.5 Sơ đồ khối của máy LC-MS/MS
-

Nguồn ion
Trong máy khối phổ có nhiều cách để ion hóa nguyên tử, phân tử mẫu ở

trạng thái khí hoặc hơi. Một số kỹ thuật ion hóa đƣợc sử dụng trong sắc ký lỏng
khối phổ: ion hóa phun điện tử, ion hóa học, … Trong nghiên cứu này chúng tôi sử
dụng kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI).
 Kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI)
Các phân tử hóa chất và dung môi sau khi ra khỏi cột sắc ký đƣợc đƣa vào
một ống mao quản bằng kim loại cao thế (3 – 5 kV). Sau đó đƣợc phun mịn bằng
khí N2 thoát ra xung quanh ống mao quản. Dƣới tác động của điện thế cao, có sự tạo
thành các hạt nhuyễn mang điện tích thoát ra từ đầu ống mao quản. Các phân tử
dung môi bốc hơi, các hạt mang điện tích có thể nhỏ dần. Sau đó các ion dƣơng hay
âm tạo thành đƣợc đƣa vào bộ phận phân tách ion. Dung môi và khí trơ N2 đƣợc hút
14