Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và tramadol trong một số chế phẩ rắn bằng điện di mao quản

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHƯƠNG THANH HOA
1201213

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
PARACETAMOL VÀ TRAMADOL
TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM RẮN
BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHƯƠNG THANH HOA
1201213

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
PARACETAMOL VÀ TRAMADOL
TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM RẮN
BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. Lê Đình Chi

Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

HÀ NỘI - 2017


Lời cảm ơn
Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành
nhất tới thầy Tiến sĩ Lê Đình Chi – người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, truyền
đạt những kinh nghiệm quý báu cũng như động viên, hỗ trợ tôi về mọi mặt từ những
bước đầu tiên cho đến khi hoàn thiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Thùy Linh cùng toàn thể các thầy
cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại
học Dược Hà Nội đã tận tình giúp đỡ và hỗ trợ kịp thời, tạo mọi điều kiện cho tôi
trong quá trình học tập, nghiên cứu tại bộ môn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cũng toàn thể các thầy cô giáo
Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong
suốt thời gian năm năm học tập tại trường.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè thân thiết của tôi đã luôn động
viên, khích lệ, sát cánh bên tôi cùng tôi vượt qua mọi khó khăn.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn nên
khóa luận này có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô,
bạn bè để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2017
Tác giả khóa luận
Phương Thanh Hoa


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................2
1.1.

Giới thiệu chung về thuốc giảm đau ..........................................................2

1.2.

Thông tin chung về paracetamol và tramadol hydroclorid ........................2

1.2.1.

Paracetamol ........................................................................................2

1.2.2.

Tramadol hydroclorid .........................................................................3

1.3.
Lợi ích và ứng dụng của việc phối hợp paracetamol và tramadol
hydroclorid ..............................................................................................................5
1.4.
Các phương pháp xác định đồng thời paracetamol và tramadol
hydroclorid ..............................................................................................................5
1.4.1.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)...............................5

1.4.2.

Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) ....................6

1.4.3.

Phương pháp phân tích khối phổ (MS) ...............................................6

1.4.4.

Phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) ......................................7

1.5.

Phương pháp điện di mao quản ..................................................................7

1.5.1.

Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản ......................................7

1.5.2.

Điện di mao quản vùng (CZE) ............................................................9

1.5.3.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách trong CZE .......................10

1.5.4.

Thiết bị điện di mao quản ..................................................................11

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................14
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị .................................................................................14
2.1.1. Nguyên vật liệu .......................................................................................14
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ .....................................................................................14
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ...........................................................15
2.2.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di ..................................................15
2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích.........................................................16


2.2.3. Ứng dụng phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và tramadol
HCl trong chế phẩm .........................................................................................17
2.2.4. Xử lý số liệu ............................................................................................17
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................19
3.1.

Chuẩn bị các dung dịch ............................................................................19

3.2.

Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di ....................................................20

3.2.1.

Lựa chọn dung dịch điện ly nền ........................................................20

3.2.2.

Lựa chọn nồng độ, pH dung dịch điện ly nền ...................................21

3.2.3.

Lựa chọn điện thế ..............................................................................22

3.2.4.

Khảo sát và lựa chọn bước sóng phát hiện .......................................22

3.3.

Thẩm định phương pháp ..........................................................................24

3.3.1.

Độ đặc hiệu .......................................................................................24

3.3.2.

Độ phù hợp hệ thống .........................................................................26

3.3.3.

Độ tuyến tính và đường chuẩn ..........................................................26

3.3.4.

Độ lặp lại ...........................................................................................28

3.3.5.

Độ đúng .............................................................................................31

3.4.
Ứng dụng phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và tramadol
HCl trong chế phẩm ..............................................................................................33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................36
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BGE

Background electrolyte (Điện ly nền)

CE

Capillary electrophoresis (Điện di mao quản)

CZE

Capillary zone electrophoresis (Điện di mao quản vùng)

ĐDĐ

Điện di đồ

EF

Electrophoresis flow (Dòng điện di)

EOF

Electroosmotic flow (Dòng diện thẩm)

HLGTN Hàm lượng ghi trên nhãn
HPLC

High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HSD

Hạn sử dụng

ICH

International Conference on Harmonization (Hội đồng hòa hợp quốc tế)

MeOH

Methanol

NSAID

Non-steroidal anti-inflammatory drug (Thuốc chống viên không steroid)

P

Paracetamol

PDA

Photo diode array (Mảng diod)

RSD

Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

STT

Số thứ tự

T

Tramadol HCl

TB

Trung bình cộng

USFDA

United States Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý Thực
phẩm và Dược phẩm Mỹ)

USP

United States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)

v/v

Volume/volume (Thể tích/ thể tích)

WHO

World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Các kiểu điện di và cơ chế tách ................................................................10
Bảng 2.1: Thông tin của các chế phẩm thuốc dùng trong nghiên cứu. ....................14
Bảng 3.1: Kết quả độ phù hợp hệ thống ...................................................................26
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính tramadol HCl ..........................................27
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của paracetamol .....................................27
Bảng 3.4: Kết quả độ lặp lại trong ngày ...................................................................29
Bảng 3.5: Kết quả đánh giá độ lặp lại khác ngày của tramadol HCl ......................30
Bảng 3.6: Kết quả đánh giá độ lặp lại khác ngày của paracetamol ........................30
Bảng 3.7: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp đối với tramadol HCl ........32
Bảng 3.8: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp đối với paracetamol ..........33
Bảng 3.9: Kết quả định lượng trong chế phẩm Ultracet ..........................................34
Bảng 3.10: Kết quả định lượng trong chế phẩm Gramadol .....................................35


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Công thức cấu tạo paracetamol .................................................................3
Hình 1.2: Công thức cấu tạo tramadol HCl ...............................................................4
Hình 1.3: Mô hình hệ thống điện di đơn giản ...........................................................11
Hình 3.1: Điện di đồ khi sử dụng dung dịch điện ly nền khác nhau .........................21
Hình 3.2: Điện di đồ với dung dịch điện ly nền dikali hydrophosphat 25 mM ở các

pH khác nhau ............................................................................................................22
Hình 3.3: Phổ hấp thụ của tramadol HCl và paracetamol .......................................23
Hình 3.4: Kết quả đánh giá độ đặc hiệu ...................................................................25
Hình 3.5: Đường chuẩn của tramadol HCl theo diện tích pic .................................27
Hình 3.6: Đường chuẩn của paracetamol theo diện tích pic....................................28
Hình 3.7: Kết quả định lượng mẫu chế phẩm Ultracet.............................................34
Hình 3.8: Kết quả định lượng mẫu chế phẩm Gramadol .........................................35


ĐẶT VẤN ĐỀ
Paracetamol là thuốc không kê đơn, được dùng rộng rãi trong điều trị các
chứng đau và sốt từ nhẹ đến trung bình [5], [11]. Paracetamol hiện được coi là
thuốc giảm đau cơ sở, được sử dụng ưu tiên cho cả người lớn và trẻ em do có cân
bằng lợi ích/nguy cơ tốt. Tramadol là thuốc giảm đau trung ương loại opioid được
dùng trong trường hợp đau trung bình đến nặng [5], [11]. Trên thị trường có nhiều
biệt dược chứa đồng thời hai chất này được bào chế dưới dạng viên nang cứng và
viên nén, hàm lượng paracetamol và tramadol hydroclorid trong mỗi viên đều lần
lượt là 325 mg và 37,5 mg như Ultracet (Hàn Quốc), Gramadol (Ấn Độ), Trapadol
(Việt Nam).
Trong Dược điển Việt Nam IV hiện nay chưa có chuyên luận riêng để định
lượng đồng thời hai chất này nhưng thực tế có rất nhiều phương pháp đã được xây
dựng và sử dụng như: Sắc ký lỏng hiệu năng cao [13], [21], [24], [27], [28]; sắc ký
lớp mỏng [21]; phân tích khối phổ [24], [25] và điện di mao quản [9]. Nhằm hướng
đến một phương pháp đơn giản mà hiệu quả, chúng tôi lựa chọn phương pháp điện
di mao quản để thực hiện nghiên cứu với đề tài “Xây dựng phương pháp định
lượng đồng thời paracetamol và tramadol trong một số chế phẩm rắn bằng
điện di mao quản” với các mục tiêu:
-

Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và tramadol

hydroclorid trong chế phẩm rắn bằng điện di mao quản.
-

Ứng dụng phương pháp trên để định lượng paracetamol và tramadol

hydroclorid trong một số chế phẩm rắn.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu chung về thuốc giảm đau
Theo Hiệp hội nghiên cứu đau quốc tế (International Association for the

Study of Pain - IASP), đau là một cảm giác khó chịu, có tính chất cảm tính, đi kèm
theo tổn thương có thật hay tiềm tàng của các tổ chức hoặc được mô tả như là tổn
thương tổ chức [23]. Tuy nhiên, có những trường hợp đau chỉ do xúc cảm, tự kỷ ám
thị của bệnh nhân (đau tâm lý) [6]. Các xung động truyền cảm giác đau theo hai loại
sợi cảm giác: sợi A (truyền cảm giác đau với tốc độ nhanh), sợi C (truyền cảm giác
đau với tốc độ chậm) [6].
Thuốc giảm đau được chia làm 2 nhóm theo vị trí tác dụng trên thần kinh
cảm giác: giảm đau trung ương và giảm đau ngoại vi [6].
Thuốc giảm đau trung ương ức chế trung tâm đau ở não và ngăn cản đường
dẫn truyền cảm giác đau từ tủy sống lên não. Nhóm này chia làm 2 phân nhóm theo
mức độ giảm đau: giảm đau mạnh (morphin, fentanyl…) và giảm đau yếu (codein,
tramadol).
Thuốc giảm đau ngoại vi ức chế sự tạo thành PG (prostaglandin) – chất trung

gian hóa học khởi phát nhiều quá trình sinh lý và bệnh lý của cơ thể. PG sẽ khơi
mào cho việc tạo ra các chất trung gian hóa học khác như serotonin, histamin... ở
ngọn sợi cảm giác (ngoại vi). Một số thuốc giảm đau ngoại vi như paracetamol và
các NSAID: aspirin, ibuprofen…
1.2.

Thông tin chung về paracetamol và tramadol hydroclorid

1.2.1. Paracetamol
 Công thức cấu tạo, tính chất
o Tên khác: Acetaminophen
o Tên khoa học: N-(4-hydroxyphenyl)acetamid hay p-hydroxyacetanilid
hay 4-hydroxyacetanilid.
o Công thức phân tử: C8H9NO2 hoặc HOC6H4NHCOCH3
o Công thức cấu tạo:

2


Hình 1.1: Công thức cấu tạo paracetamol
o Đặc tính lý, hóa:
 Khối lượng phân tử: 151,165 g/mol.
 Độ hòa tan [3], [4], [27]: Trong nước 14000 mg/L ở 25oC; rất ít
tan trong nước lạnh và ether, tan trong nước sôi (1:20 [18]) và các dung dịch kiềm;
dễ tan trong rượu: MeOH, EtOH (1:10 [18]); không tan trong benzen.
 pH của dung dịch bão hòa trong nước là 5,3-5,6 [3].
 pKa=9,51 [3].
 Dược lực học
Paracetamol là thuốc giảm đau ngoại vi, không có tác dụng chống viêm. Với
liều ngang nhau tính theo gam, paracetamol có tác dụng giảm đau và hạ sốt tương

tự như aspirin [5].
 Dược động học
Paracetamol được hấp thu nhanh chóng và hầu như hoàn toàn qua đường tiêu
hóa. Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt trong vòng 30 đến 60 phút sau khi uống
với liều điều trị, nửa đời huyết tương của paracetamol là 1,25 - 3 giờ, thời gian tác
dụng khoảng từ 3 đến 6 giờ [5], [6].
 Kiểm nghiệm chế phẩm dạng viên paracetamol đơn độc
o Định tính: Phản ứng màu với kali dicromat 5% [5]; đo nhiệt độ nóng
chảy [5]; sắc ký lớp mỏng [5], [12], [27]; HPLC [27].
o Định lượng: Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến [5];
HPLC [12], [27].
1.2.2. Tramadol hydroclorid
 Công thức cấu tạo, tính chất

3


o Tên

khoa

học:

(1RS,2RS)-2-[(dimethylamino)methyl]-1-(3-

methoxyphenyl)cyclohexan-1-ol hydrochlorid.
o Công thức phân tử: C16H25NO2.HCl
o Công thức cấu tạo:

▪ H–Cl

Hình 1.2: Công thức cấu tạo tramadol HCl
o Đặc tính lý, hóa:
 Khối lượng phân tử: 299,839 g/mol
 Độ tan: Dễ tan trong nước và MeOH, tan kém trong aceton [2],
[12], [14].
 pKa=9,41 [16]
 Dược lực học
Tramadol là thuốc giảm đau tổng hợp mới, thuộc nhóm thuốc giảm đau trung
ương mức độ yếu. Ở liều điều trị, đây là một thuốc giảm đau trung ương có hiệu quả
dựa trên tác dụng hiệp đồng thông qua 2 cơ chế: Tác dụng tương tự các opioid
thông qua việc gắn vào thụ thể μ của opioid và tác dụng trên hệ thần kinh trung
ương do ức chế tái thu hồi noradrenalin và serotonin, do đó kiểm soát được sự
truyền tín hiệu đau về thần kinh trung ương [2], [11]. Nếu coi độ mạnh của morphin
là 1 thì độ mạnh của tramadol là 0,2 [23]. Khi sử dụng ở liều điều trị, thuốc ít tác
động trên tiêu hóa, ít ức chế hô hấp hơn so với morphin [11], [18].
 Dược động học
Tramadol HCl được hấp thu nhanh chóng và hầu như hoàn toàn qua đường
tiêu hóa. Nửa đời huyết tương của tramadol là 5 - 7 giờ [10].

4


 Kiểm nghiệm chế phẩm dạng viên tramadol HCl đơn độc
o Định tính: Phương pháp sắc ký lớp mỏng [12], đo phổ hồng ngoại
[27], HPLC [27].
o Định lượng: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [12], [27].
1.3.

Lợi ích và ứng dụng của việc phối hợp paracetamol và tramadol

hydroclorid
Trong nguyên tắc phối hợp thuốc giảm đau của WHO, paracetamol được
phối hợp các opioid yếu như tramadol khi đau mức độ trung bình hoặc đau mức độ
nhẹ không kiểm soát được bằng các thuốc giảm đau ngoại vi [10]. Kết hợp có hiệu
quả do kết hợp 2 nhóm thuốc giảm đau khác cơ chế, giúp cho hiệu quả giảm đau
cộng hợp, giảm liều của từng thuốc thành phần và giảm tác dụng bất lợi khi phải
dùng từng thuốc ở liều cao [6].
1.4.

Các phương pháp xác định đồng thời paracetamol và tramadol

hydroclorid
Hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu định lượng đồng thời paracetamol
và tramadol HCl nhưng trên thế giới đã có rất nhiều phương pháp được xây dựng để
phân tích hai đối tượng này cả trong chế phẩm và dịch sinh học.
1.4.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột
chứa các hạt pha tĩnh [1]. Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển và
hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích.
Nhiều tác giả đã dùng phương pháp này để xác định đồng thời paracetamol và
tramadol HCl.
Trong nghiên cứu của Devalaraju Ravisankar và các cộng sự [13] đã sử dụng
HPLC để phân tích đồng thời paracetamol và tramadol HCl trong chế phẩm. Pha
tĩnh là cột C8 (250 mm × 4,6 mm, đường kính hạt 5µm), pha động bao gồm
phosphat (pH 6,8) và methanol (80:20, v/v), bước sóng phát hiện ở 215 nm.
V.V.Vaidya và các cộng sự [28] cũng dùng RP-HPLC để phân tích đồng thời
aceclofenac, paracetamol và tramadol HCl trong chế phẩm thuốc, sử dụng chuẩn

5

nội là methyl paraben. Chạy sắc ký trên cột C18 (250 mm × 4,6 mm, 5µm), pha động
gồm KH2PO4 pH 3,0 (chỉnh pH bằng H3PO4 và acetonitrile (40:60, v/v), phát hiện ở
bước sóng 270 nm.
Trong một nghiên cứu khác của M.Gandhimathi và T.K. Ravi [21], các tác
giả đã dùng pha động bao gồm KH2PO4 (0,1 M; pH 5,5) và methanol (45:55, v/v)
để phân tích đồng thời paracetamol và tramadol HCl trong chế phẩm thuốc bằng
chất chuẩn nội valdecoxib ở bước sóng phát hiện là 273 nm.
Việc phân tích đồng thời 2 chất này bằng HPLC cũng được trình bày trong
nghiên cứu của Tarek Belal và cộng sự [24]. Họ sử dụng pha động là dung dịch
phosphat pH 6,3 và acetonitril (90:10, v/v), phát hiện ở bước sóng 220 nm.
Trong USP [27] cũng sử dụng HPLC để định lượng viên nén chứa hai chất
này. Điều kiện chạy HPLC là: cột L11, pha động gồm Tetrahydrofuran,
triethylamin, nước, acid trifluoroacetic với tỉ lệ thể tích 8:0,1:92:0,1; detector phát
hiện ở hai bước sóng: 216 nm (cho tramadol HCl) và 249 nm (cho paracetamol).
1.4.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High-Performance Thin-Layer
Chromatography – HPTLC) được cải tiến từ sắc ký lớp mỏng, sử dụng bản mỏng có
hiệu quả tách cao và thiết bị hiện đại: tiêm mẫu lượng chính xác, sắc ký đồ được
chuẩn hóa và có phần mềm kiểm soát.
Cũng trong nghiên cứu của M.Gandhimathi và T.K. Ravi [21], các tác giả
còn sử dụng HPTLC để phân tích đồng thời hai chất này trong chế phẩm. Họ sử
dụng pha tĩnh là bản mỏng silicagel G60 F254 được tráng sẵn, pha động là ethyl
acetat, toluen và amoniac (6:4:0,1, v/v/v), phát hiện ở bước sóng 254 nm.
1.4.3. Phương pháp phân tích khối phổ (MS)
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry – MS) là một kỹ thuật phân tích
hóa học giúp xác định hàm lượng và loại chất hóa học có trong một mẫu bằng cách
đo trực tiếp tỷ lệ khối lượng và điện tích của ion được tạo thành trong pha khí từ
phân tử hoặc nguyên tử của mẫu [12].

6


GC-MS được dùng để phân tích chế phẩm chứa paracetamol và tramadol
trong nghiên cứu của Tarek Belal và cộng sự [24]. Họ sử dụng cột 100%
dimethylpolysiloxan.
Ngoài ra, LC-ESI-MS còn được ứng dụng để phân tích paracetamol và
tramadol đồng thời trong huyết tương người. Chi tiết được trình bày trong nghiên
cứu của Tian Zhu và cộng sự [25].
1.4.4. Phương pháp điện di mao quản vùng (CZE)
Điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis – CZE) có cơ chế
tách dựa vào linh độ khác nhau của các ion trong dung dịch tự do. Hiện nay, CE
được sử dụng như một công cụ thay thế hoặc một công cụ hỗ trợ và có hiệu lực tách
cao hơn HPLC [7].
Trong nghiên cứu của Adriana Ciurba và cộng sự [9], họ đã phân tích được
paracetamol và tramadol HCl trong các chế phẩm với các tá dược khác nhau với
thời gian chạy chỉ 1 phút. Họ sử dụng mao quản silica nung chảy có chiều dài hiệu
dụng 20 cm đường kính trong 50 µm, chế độ tiêm mẫu thủy lực với 50 mbar trong 3
giây dung dịch điện ly nền là natri tetraborat 25 mM pH 9,8 (chỉnh pH bằng NaOH
0,1 M), điện thế áp vào hai điện cực là +20 kV (dòng < 100µA), nhiệt độ mao quản
giữ ở 20ºC, bước sóng phát hiện là 210 nm đối với tramadol và 240 nm đối với
paracetamol.
1.5.

Phương pháp điện di mao quản

1.5.1. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản
Điện di (electrophoresis) là một kỹ thuật tách các chất trong hỗn hợp dựa vào
sự di chuyển với vận tốc khác nhau của các thành phần phân tử mang điện dưới tác

động của điện trường.
Điện di mao quản (capillary electrophoresis – CE) là một kỹ thuật phân tích
hiện đại cho phép tách nhanh và hiệu quả hỗn hợp nhiều thành phần mang điện
khác nhau trong một hỗn hợp với thể tích mẫu nhỏ. Quá trình tách CE được thực
hiện trong môi trường bên trong mao quản có kích thước rất nhỏ (đường kính
<100µm). CE vượt trội hơn điện di cổ điển trên bản mỏng về hiệu lực tách, thời

7


gian thực hiện, độ tin cậy khi định lượng, bên cạnh đó CE còn dễ sử dụng và dễ tự
động hóa hơn.
Sự chuyển động của các chất phân tích trong mao quản phụ thuộc chủ yếu
vào dòng điện di và dòng điện thẩm.
1.5.1.1.

Dòng điện di
Dòng điện di (electrophoresis flow – EF) là dòng điện tạo ra do các ion

hoặc các phân tử mang điện di chuyển theo mao quản đi về phía cực trái dấu dưới
tác dụng của lực điện trường.
Trong mao quản chứa một dung dịch điện ly nền (background electrolyte
– BGE), cường độ điện trường đồng đều ở mọi điểm trong mao quản, ion i sẽ chịu
ảnh hưởng của lực điện và lực ma sát từ môi trường, do đó, có thể biểu diễn linh độ
điện di µi (cm2/V.s) như sau:
µ𝑖 =

𝑞𝑖
6. 𝜋. 𝜂. 𝑟𝑖

Trong đó: 𝑞𝑖 : điện tích của ion i (C)
η : độ nhớt của BGE (g/cm.s)
𝑟𝑖 : bán kính ion i (cm)
Từ phương trình cho thấy, linh độ điện di là một đại lượng đặc trưng cho
sự di chuyển của một ion, chịu ảnh hưởng bởi điện tích của nó, độ nhớt của môi
trường và bán kính của nó trong dung dịch mà không phụ thuộc vào điện thế được
đặt hay chiều dài mao quản. Điện tích của chất có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi
mức độ ion hóa của nhóm acid hay base của chất đó thông qua hệ số phân ly. Phân
tử trung hòa không mang điện tích (q=0) không di chuyển.
Bên cạnh đó, vận tốc di chuyển của ion i (cm/s): vi= µi . E (E là cường độ
điện trường – V/cm). Do đó, vận tốc ion di chuyển trên mao quản phụ thuộc vào
linh độ điện di và điện thế đặt vào mao quản.
1.5.1.2.

Dòng điện thẩm
Dòng điện thẩm (electroosmotic flow hoặc electroendoosmotic flow –

EOF) là dòng dung dịch chảy trong mao quản dưới tác động của điện trường, do thế

8


zeta tạo ra trên giao diện tiếp xúc giữa bề mặt mao quản và dung dịch trong mao
quản.
Khi điện di với mao quản silica, các nhóm silanol (SiOH) ở trên thành
trong của mao quản sẽ giải phóng ra H+ vào dung dịch và bề mặt thành mao quản sẽ
mang điện tích âm. Quá trình giải phóng H+ phụ thuộc vào hằng số cân bằng K. Khó
để xác định chính xác trị số K nhưng thực nghiệm chỉ rõ dòng EOF có giá trị đáng
kể khi pH dung dịch trên 4 [7].
Do bề mặt thành trong mao quản mang điện tích âm nên đối ion (chủ yếu

là cation) do lực hút tĩnh điện sẽ tạo thành một lớp điện kép để cân bằng điện tích
và tạo nên một hiệu điện thế ở vùng sát thành mao quản gọi là thế Zeta. Khi áp thế
vào mao quản, các cation này sẽ bị solvat hóa nên kéo cả khối dung dịch trong mao
quản đi về catod. Sự di chuyển của khối dung dịch trong mao quản silica dưới tác
dụng của điện trường được gọi là dòng điện thẩm EOF.
Tốc độ (ʋeo) và linh độ (µeo) của dòng EOF được biểu thị bằng công thức
sau:
ʋeo = (εζ/η).E
µeo = εζ/η
Trong đó: µeo : linh độ dòng EOF (cm2/V.s)
ζ : thế Zeta (V)
ε : hằng số điện môi của dung dịch điện ly
1.5.2. Điện di mao quản vùng (CZE)
Các kỹ thuật điện di có thể phân thành 2 nhóm chính: Nhóm các kỹ thuật
điện di vùng và nhóm các kỹ thuật điện di trạng thái dừng. Nhóm điện di vùng gồm
4 kiểu điện di sau [1]:

9


Bảng 1.1: Các kiểu điện di và cơ chế tách
Kiểu điện di
Điện di mao quản vùng

Cơ chế tách
Linh độ khác nhau của các ion trong dung dịch tự do

Điện di mao quản trên gel Kích thước và điện tích
Sắc ký điện động

Tương tác sơ nước/ion với hạt mixen trong dung dịch

Sắc ký điện mao quản

Sự phân bố và linh độ khác nhau của các chất

Trong đó điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis – CZE) là
kỹ thuật CE được sử dụng phổ biến nhất do sự linh hoạt, dễ tiến hành và năng lực
tách tốt. Tuy nhiên CZE chỉ ứng dụng được để tách các chất mang điện.
Trong CZE mao quản chỉ chứa một dung dịch BGE và linh độ điện di của
các chất phân tích phụ thuộc vào tỷ lệ giữa khối lượng và điện tích của chúng. Các
chất phân tích tách nhau nhờ kết quả tổng hợp của vận tốc di chuyển điện di (đặc
trưng cho từng chất) và vận tốc di chuyển điện thẩm (giống nhau với mọi chất vì
phụ thuộc vào EOF). Nếu EOF đủ lớn, CZE sẽ tách đồng thời được cả các ion di
chuyển cùng hay ngược chiều với EOF vì chúng đều được EOF đưa về phía
detector (tức là hướng về cathod). Trong trường hợp maoquản silica nung chảy
(thành mao quản mang điện tích âm), thứ tự rửa giải là cation, phân tử trung hòa và
anion.
1.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách trong CZE
 pH dung dịch điện ly nền
Đây là yếu tố quan trọng để thực hiện tốt quá trình tách vì pH quyết định
mức độ ion hóa và linh độ của các chất phân tích. Ở pH thấp, silanol không được
ion hóa do đó tốc độ dòng giảm nhiều hoặc có thể về 0 khi giá trị pH quá thấp [20].
Vì vậy cần lựa chọn loại BGE có khả năng đệm tốt trong pH lựa chọn. Ngoài ra,
BGE cần có đáp ứng thấp với detector và linh độ thấp để giảm thiểu cường độ dòng
trong mao quản.

10

 Dòng điện thẩm EOF
Khi EOF quá lớn, các chất phân tích sẽ di chuyển qua detector quá nhanh mà
chưa kịp tách; khi EOF quá nhỏ, thời gian phân tích sẽ kéo dài. Để kiểm soát được
EOF cần điều chỉnh:
o Điện tích bề mặt mao quản
o Độ nhớt dung dịch điện ly nền
o Điện thế: Giảm điện thế chạy điện di sẽ làm giảm EOF, nhưng đồng
thời cũng giảm hiệu lực tách và kéo dài thời gian phân tích.
o Nồng độ và lực ion của dung dịch điện ly nền: nồng độ càng tăng sẽ
làm giảm thế zeta, dẫn đến giảm EOF [7], [20]. Nồng độ dung dịch BGE thường
được sử dụng trong khoảng 10 – 50 mM, có thể tăng đến 100 mM với những dung
dịch có độ dẫn điện thấp [7].
 Bề mặt thành mao quản
Sử dụng mao quản silica nung chảy có thể gây ra quá trình hấp phụ các chất
phân tích có mật độ điện tích dương lớn lên bề mặt silica, do đó làm biến dạng pic
và giảm hiệu lực tách. Để tránh hiện tượng hấp phụ cũng như làm giảm hoặc loại
trừ EOF, có thể cho một chất nào đó hấp phụ lên thành mao quản để ngăn cản các
silanol tiếp xúc với BGE.
1.5.4. Thiết bị điện di mao quản
Hình 1.3 mô tả các thành phần cơ bản của một hệ thống CE đơn giản.

Hình 1.3: Mô hình hệ thống điện di đơn giản

11


Thực nghiệm CE được tiến hành theo 4 bước: Thay dung dịch BGE đầu bằng
dung dịch mẫu phân tích; bơm mẫu vào mao quản; đưa trở lại dung dịch BGEvào;
áp thế vào mao quản. Sau một thời gian, các pic điện di sẽ xuất hiện.
 Tiêm mẫu

Mẫu phân tích (dạng dung dịch) được đưa trực tiếp vào mao quản bằng cách
nhúng một đầu mao quản vào lọ đựng mẫu, sau đó dùng áp suất hoặc điện thế để
đẩy dung dịch mẫu vào trong lòng mao quản.
Thực nghiệm cho thấy, chiều dài vùng mẫu tiêm không nên vượt quá 1%
tổng chiều dài của mao quản [7]. Thông thường, thể tích mẫu tiêm thường hạn chế
trong khoảng từ 10 – 50 nL (tùy thuộc kích thước mao quản) để tránh hiện tượng
mở rộng dải [7], [15], [20].
Có hai hệ tiêm mẫu thông dụng là tiêm mẫu thủy lực và tiêm mẫu điện động.
Tiêm mẫu thủy lực là tạo chênh lệch áp suất giữa hai đầu mao quản, nhờ đó
mẫu từ lọ đựng được đưa vào trong mao quản. Với các điều kiện khác không thay
đổi, thời gian tiêm mẫu và diện tích pic tạo thành một đường tuyến tính (không đi
qua gốc tọa độ) [15], [19]. Trong thực nghiệm, chế độ này thường được sử dụng
nhiều hơn chế độ tiêm mẫu điện động [7], [15].
 Mao quản
Mao quản làm bằng silica nung chảy là loại mao quản được sử dụng phổ biến
nhất do những đặc tính nội tại phù hợp. Đường kính trong mao quản phổ biến là 50
µm và 70 µm, chiều dài phổ biến thường từ 50 – 100 cm.
Vì các mao quản silica nung chảy rất dễ gãy nên chúng được bao ngoài bằng
một lớp polyimid để tăng tính mềm dẻo, giúp việc sử dụng mao quản thuận lợi hơn
[7].
Xử lý tốt mao quản sẽ cho dữ liệu lặp lại. Xử lý mao quản là phải loại các
chất hấp phụ trên bề mặt, làm mới lại và tạo điều kiện cho silanol điện ly, tạo bề
mặt mao quản mang điện tích.

12


Nhiệt độ mao quản cần được kiểm soát chặt chẽ, dao động của nhiệt độ
không quá ± 0,1oC [7]. Thường dùng 2 cách để điều nhiệt: dùng chất lỏng và dùng
dòng không khí (tốc độ dòng không khí bằng 10 m/s thường đủ để giải nhiệt).

Điện thế áp vào hai đầu mao quản là điện thế một chiều, tối đa là 30 kV,
dòng dao động 50 – 100 mA [7]. Dòng cao hơn có thể làm tăng nhiệt độ trong lòng
mao quản và làm cho mở rộng dải dẫn đến giảm độ phân giải [20]. Thế cấp dao
động ≤ 0,1% sẽ đảm bảo độ lặp lại cho thời gian di chuyển [7].
 Detector
Detector trong CE phải cho phép phát hiện chất cần phân tích với một dung
tích rất nhỏ. Có nhiều loại detector, trong đó detector hấp thụ UV-VIS là detector
phổ biến nhất trong CE do nó có thể phân tích một số lượng lớn các đối tượng hợp
chất và dễ sử dụng.
Nguồn bức xạ liên tục ngoài việc ghi nhận điện di đồ theo thời gian tại các
bước sóng riêng lẻ, thiết bị có thể ghi lại phổ hấp thụ UV-VIS của từng chất được
tách ra trong quá trình điện di. Tuy detector đa bước sóng cho phép thực hiện phân
tích một cách linh hoạt và chọn lọc nhưng nó có giá thành cao và kém nhạy, kém ổn
định hơn so với detector đơn bước sóng [7].
 Hệ thống thu nhận dữ liệu
Hệ thống CE hiện đại có kèm theo máy tính cùng phần mềm điều khiển hoạt
động của thiết bị, thu nhận dữ liệu, tính toán các thông số phân tích và trình bày báo
cáo kết quả.

13


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
2.1.1.1. Chất chuẩn
Paracetamol: SKS: 0415019, hàm lượng 100,04 % nguyên trạng, Viện Kiểm
nghiệm thuốc Trung ương.
Tramadol hydroclorid: chuẩn làm việc, hàm lượng 99,5 % nguyên trạng,
Công ty Cổ phần Dược phẩm Vĩnh Phúc.

2.1.1.2. Hóa chất dung môi
Các hóa chất tinh khiết phân tích: natri hydroxid (NaOH), dinatritetraborat
decahydrat (Na2B4O7.10H2O), dikalihydrogenphosphat trihydrat (K2HPO4.3H2O)
(Merck, Đức), acid orthophosphoric 85% (H3PO4), methanol (MeOH): hàm lượng ≥
99,5% (Merck, Đức).
Nước siêu lọc
2.1.1.3. Các chế phẩm thuốc
Bảng 2.1: Thông tin của các chế phẩm thuốc dùng trong nghiên cứu.
STT

Tên thuốc

Hàm lượng

Nhà sản xuất

hoạt chất
Viên

1

Korea 19481

03/2019

Ltd, Hàn Quốc

chứa:

Viên nang paracetamol

2

HSD

xuất

nén Trong 1 viên Janssen

Ultracet

Số lô sản

Gracure

cứng

325

Gramadol

tramadol HCl Ltd, Ấn Độ.

CE-1569

17/12/2018

mg, pharmaceuticals

37,5 mg

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
2.1.2.1. Thiết bị
-

Máy điện di mao quản P/ACEMDQ Plus, SCIEX (Mỹ) trang bị detector

PDA.
-

Máy cất nước hai lần Hamilton, Anh

14


-

Máy lọc nước tinh khiết Purelab Classic, mode UV, Elga, Anh.

-

Máy đo pH FiveEasy - Mettler Toledo FE20

-

Máy rung siêu âm Ultrasonic LC 60H, Elma, Đức

-

Máy lắc xoáy Labinco L46

-

Cân phân tích TE214S, Sartorius, Đức: Độ phân giải 0,1 mg.

-

Tủ lạnh bảo quản mẫu.

2.1.2.2. Dụng cụ
-

Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, cốc thủy tinh, pipet thường, phễu.

-

Pipet pasteur với các cỡ khác nhau: 100; 1000 µL và đầu côn tương ứng.

-

Đầu lọc có đường kính lỗ lọc 0,2 µm.

-

Các xylanh để lọc mẫu.

-

Mao quản sử dụng là mao quản silica nung chảy, chiều dài hiệu dụng 50cm,

chiều dài tổng cộng 62,5 cm, đường kính trong là 75 µm.

-

Các dụng cụ thông thường khác của phòng thí nghiệm: cối, chày, giấy lọc.

2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di
Theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất và tham khảo từ các nghiên cứu
trước đó về điện di mao quản của tramadol hydroclorid và paracetamol [9], [22],
chúng tôi đưa ra điều kiện điện di áp dụng cho nghiên cứu như sau:


Mao quản: silica nung chảy dài 62,5 cm (chiều dài hiệu dụng 50 cm),

đường kính trong 75 µm.


Nhiệt độ mao quản: 25oC



Nhiệt độ bảo quản mẫu: 25oC



Áp suất, thời gian tiêm mẫu: 0,5 psi x 10 giây



Hoạt hóa mao quản lần đầu: Rửa mao quản bằng nước trong 5 phút,

NaOH 0,1 M trong 30 phút, nước trong 10 phút và BGE trong 30 phút.


Vào thời điểm đầu ngày rửa bằng nước trong 10 phút.



Để cân bằng mao quản, rửa theo thứ tự: nước trong 2 phút,

NaOH 0,1 M trong 10 phút, nước trong 2 phút và BGE trong 5 phút.

15




Trước mỗi lần phân tích, mao quản được rửa theo thứ tự: Nước trong

2 phút, NaOH 0,1M trong 2 phút, nước trong 1 phút và BGE trong 2 phút.


Thời điểm cuối ngày, mao quản được rửa với dung dịch nước trong 5

phút, NaOH 0,1M trong 5 phút và nước trong 10 phút.
Các điều kiện chúng tôi tiến hành phân tích và lựa chọn:


Dung dịch điện ly nền



Nồng độ và pH dung dịch điện ly nền



Điện thế đặt vào hai đầu mao quản



Bước sóng phát hiện

2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích
Sau khi khảo sát và lựa chọn được điều kiện điện di, tiến hành thẩm định để
đảm bảo phương pháp xây dựng là phù hợp. Theo các quy định của USFDA, USP
và ICH [8], [17], [26]; các thông số cần thẩm định bao gồm:
 Độ đặc hiệu
Phân tích mẫu trắng, lặp lại 6 lần. Mẫu trắng phải không được cho tín hiệu
chất phân tích. Phân tích chuẩn đơn từng chất, chuẩn hỗn hợp hai chất và mẫu chế
phẩm. So sánh thời gian lưu và phổ UV của từng chất trong mẫu.
 Độ phù hợp hệ thống
Tiêm lặp lại một dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp 6 lần để xác định độ tái lặp
của hệ thống CE. Giá trị thời gian di chuyển và diện tích pic thu được tiêm lặp lại sẽ
được sử dụng để tính toán RSD. Độ lệch chuẩn tương đối cho sự tiêm lặp lại không
được quá 3,0% [4].
 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Tiến hành điện di dung dịch chuẩn tramadol HCl có nồng độ từ 57,2–114
µg/mL và dung dịch chuẩn paracetamol có nồng độ từ 498–996 µg/mL tại 6 điểm
nồng độ. Sau khi xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn và xác định hệ
số hồi quy (a, b trong phương trình hồi quy y= ax+b, hệ số tương quan R). Cần phải
có quan hệ tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và đáp ứng pic của từng đối tượng

phân tích (hệ số R  0,995, tương ứng với R2  0,99).

16


 Độ lặp lại
Tiến hành phân tích trên mẫu thực, làm thí nghiệm lặp lại 6 lần trong một
ngày, một điều kiện phân tích để xác định độ lặp lại trong ngày. Làm tương tự với 6
mẫu ở các ngày tiếp theo để xác định độ lặp lại khác ngày. Đánh giá độ lặp lại trong
ngày và khác ngày dựa trên giá trị RSD của hàm lượng từng hoạt chất thu được giữa
các lần phân tích thực nghiệm khác nhau so với HLGTN với yêu cầu RSD  2%.
 Độ đúng
Dùng phương pháp đánh giá độ thu hồi (hay còn gọi là độ tìm lại). Thêm một
lượng chính xác chất chuẩn vào mẫu thử sao cho nồng độ của hoạt chất vẫn nằm
trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Tính đến cả hàm lượng hoạt chất có sẵn trong
nền mẫu chế phẩm thực, các mức thêm chuẩn được tính toán để tổng nồng độ hoạt
chất trong mẫu thêm chuẩn ở ba mức đánh giá độ đúng vào khoảng 80%, 100% và
120% so với nồng độ định lượng thường quy của dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
Mỗi nồng độ phân tích 3 lần, xác định tỷ lệ (%) tìm lại được so với lượng thêm vào.
Độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại. Tỉ lệ thu
hồi phải nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0%.
2.2.3. Ứng dụng phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và tramadol
HCl trong chế phẩm
Tiến hành pha dung dịch mẫu thử của một số chế phẩm rắn với nồng độ ước
lượng trong khoảng tuyến tính và chạy điện di. Dùng phương pháp so sánh để tính
hàm lượng so với HLGTN của chế phẩm. Với HLGTN của tramadol HCl là 37,5
mg và paracetamol là 325 mg thì giới hạn cho phép của tramadol HCl là ± 10% (tức
là từ 90% - 110%) và paracetamol là ± 5% (tức là từ 95% - 105%) [4].
Bên cạnh đó, trong USP 35 – NF 30, chuyên luận “Acetaminophen and
Tramadol Hydrochloride Tablets” (Viên nén Acetaminophen và Tramadol

hydroclorid) quy định giới hạn cho phép về hàm lượng so với HLGTN của cả hai
chất đều là ± 10,0%.
2.2.4. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel 2013.

17