Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc giảm đau chống viêm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC MS MS

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ THẮM
Mã sinh viên : 1201557

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNHMỘT SỐ THUỐC
GIẢM ĐAU CHỐNG VIÊM TRỘN
TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM
ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC- MS/MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ THẮM
Mã sinh viên: 1201557

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNHMỘT SỐ THUỐC
GIẢM ĐAU CHỐNG VIÊM TRỘN
TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM
ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà
2. DS. Thái Khoa Bảo Châu

Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa phân tích- Độc chất
2. Viện công nghệ dược phẩm quốc gia

HÀ NỘI 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi đã
nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên, bạn
bè và gia đình.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến:
PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà
DS. Thái Khoa Bảo Châu
đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên
cứu.
Cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành đếnPGS.TS.Nguyễn Thị Kiều Anh và
Ths.NCS. Đào Thị Cẩm Minhngười đã động viên, nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá
trình thực hiện.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ
môn Hóa phân tích-Độc chất đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm tại bộ môn.Tôi cũng xin cảm ơn Ban
lãnh đạo và các anh chị cán bộ Viện công nghệ dược phẩm quốc gia và Trung tâm
giám định ma tuý, Viện khoa học hình sự, Bộ công an đã tạo điều kiện hỗ trợ về
thiết bị trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo
đại học cùng toàn thể các thầy cô các bộ môn trường Đại học Dược Hà Nội đã tận
tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, quan

tâm và tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, ngày18tháng 5năm 2017
Bùi Thị Thắm


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .....................................................................................3
2.1.

Tổng quan các thuốc trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược .....3

2.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ..........................................................5
2.2.1.

Tổng quan về Paracetamol ....................................................................5

2.2.2.

Tổng quan về indomethacin ..................................................................5

2.2.3.

Tổng quan về piroxicam ........................................................................6

2.2.4.

Tổng quan về ketoprofen .......................................................................7

2.2.5. Tác dụng và tác dụng không mong muốn của các thuốc thuộc nhóm
chống viêm không steriod. ..................................................................................7
2.3. Tổng quan các phương pháp định lượng các thuốc giảm đau chống
viêm không steroid trộn trái phép trong đông dược ........................................10
2.3.1.

Trên thế giới .........................................................................................10

2.3.2.

Tại Việt Nam ........................................................................................12

2.4.

Tổng quan về sắc kí lỏng khối phổ ...........................................................13

2.4.1.

Sắc kí lỏng hiệu năng cao ...................................................................13

2.4.2.

Sắc kí lỏng khối phổ ............................................................................14

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ..............................................18
NGHIÊN CỨU .........................................................................................................18
2.1.

Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................18

2.1.1.

Hoá chất- chất chuẩn ..........................................................................18

2.1.2.

Thiết bị ..................................................................................................19

2.1.3.

Đối tượng nghiên cứu..........................................................................20

2.2.

Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................20

2.2.1.

Thu thập mẫu .......................................................................................20

2.2.2.

Xử lý mẫu .............................................................................................20


2.2.3.

Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS ......................20

2.2.4.

Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng ......................................21

2.3.

Phương pháp xử lý số liệu .........................................................................21

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................22
3.1.

Xây dựng phương pháp phân tích ...........................................................22

3.1.1.

Khảo sát điều kiện chiết.......................................................................22

3.1.2.

Khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc kí ..........................................25

3.2.

Thẩm định quy trình phân tích ................................................................34

3.2.1.

Độ phù hợp của hệ thống ....................................................................34

3.2.2.

Độ đặc hiệu ..........................................................................................35

3.2.3.

Độ đúng ................................................................................................38

3.2.4.

Độ lặp lại ..............................................................................................39

3.2.5.

Khoảng tuyến tính................................................................................40

3.2.6.

LOD và LOQ ........................................................................................41

3.3.

Ứng dụng phương pháp ............................................................................42

BÀN LUẬN ..............................................................................................................45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN

: Acetonitril

AOAC

: Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống (Association of

Official Analytical Chemists)
AR
ESI
HPLC

: Thuốc thử phân tích (Analytical reagent)
: Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI)
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid

chromatography)
HPTLC

: Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (high performance thin layer

chromatography – HPTLC)
LC/MS

: Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography – mass

spectrometry)
LOD

: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

: Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

m/z

: Khối lượng/ điện tích

MeOH

: Methanol

PA

: Tinh khiết phân tích (Pure analysis)

RSD

: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

TB

: Trung bình

TLC

: Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography – TLC)

COX

: cyclo-oxygenase


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1 Các phương pháp xác định NSAIDs trộn trong đông dược ................... 11
Bảng 2. 1. Các hóa chất- chất chuẩn ................................................................... 18
Bảng 2. 2. Công thức mẫu trắng ......................................................................... 20
Bảng 3. 1. Các thông số máy MS ....................................................................... 30
Bảng 3. 2. Điều kiện chạy LC-MS của 4 chất phân tích ....................................... 30
Bảng 3. 3. Các chương trình pha động được khảo sát .......................................... 31
Bảng 3. 4. Kết quá đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS....................... 35
Bảng 3. 5. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp ....................................... 38
Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp ...................................... 39
Bảng 3. 7. Kết quả xây dựng đường chuẩn 4 chất nghiên cứu .............................. 40
Bảng 3. 8. LOD và LOQ của 4 chất phân tích ..................................................... 41
Bảng 3. 9. Kết quả nồng độ các chất trong các mẫu thử ....................................... 42


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS với tứ cực chập ba. .................................. 14
Hình 1. 2. Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI.................................................. 16
Hình 1. 3. Tứ cực gập cong ................................................................................ 16
Hình 2. 1. Máy sắc kí Bruker EVOQ Qube ......................................................... 19

Hình 3. 1. Sắc đồ khảo sát quy trình chiết ...................................................... 24
Hình 3. 2. Phương pháp xử lí mẫu theo quy trình 4. ...................................... 25
Hình 3. 3. Phổ khối của piroxicam.................................................................. 27
Hình 3. 4. Phổ khối của ketoprofen ................................................................ 28

Hình 3. 5. Phổ khối của indomethacin ............................................................ 29
Hình 3. 6. Phổ khối hai mảnh con 65,1 và 110,1 của paracetamol................. 29
Hình 3. 7. Sắc ký đồ phân tích 4 chất khảo sát thành phần pha động ............ 33
Hình 3. 8. Sắc ký đồ phân tích 4 chất khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp37
Hình 3. 9. Sắc đồ LOD của paracetamol. ....................................................... 41
Hình 3. 10. Sắc đồ LOQ của ketoprofen. ........................................................ 41
Hình 3. 11. Sắc đồ dương tính paracetamol mẫu HC08 ................................. 43
Hình 3. 12. Sắc đồ dương tính paracetamol và indomethacin mẫu BN01 ..... 43
Hình 3. 13. Sắc đồ dương tính mẫu BN51 ...................................................... 44


ĐẶT VẤN ĐỀ
Các loại thuốc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ đông dược ngày càng
được sử dụng rộng rãi trên thị trường trong nước và trên toàn thế giới. Nó là một
phần quan trọng của xu hướng thay thế dược phẩm tổng hợp. Xu thế này đã khởi
đầu từ cách đây 20 năm, như một nghiên cứu của Harvard gần đây đã phát hiện ra
rằng một phần ba người được hỏi thừa nhận sử dụng ít nhất một liệu pháp thay thế
trong quá khứ, và chi tiêu tại Mỹ cho những biện pháp thay thế này có thể lên tới
13,7 tỷ đô la trong một năm [14]. Vì nó là những lựa chọn thay thế hoàn toàn tự
nhiên, kinh tế và được người sử dụng tin rằng chúng an toàn hơn các thuốc tân
dược. Ở Việt Nam, nguồn tài nguyên cây thuốc dồi dào và nền y học cổ truyền lâu
đời của nước ta cũng là một trong những yếu tố thuận lợi cho thuốc có nguồn gốc từ
thảo dược ngày càng chiếm ưu thế so với các thuốc tân dược. Theo Tổ chức Y tế
Thế giới (WHO) có đến 80% của những người sống ở các nước đang phát triển vẫn
dựa chủ yếu vào các loại thuốc truyền thống để chăm sóc sức khỏe của họ. Ví dụ
như dân số sử dụng thuốc đông dược để điều trị ban đầu chiếm 90% dân số của
Ethiopia, chiếm 75% dân số của Mali, chiếm 70% ở Myannar, chiếm 70% ở
Rawanda, chiếm 60% ở Tanzania, chiếm 60% ở Uganda [16]. Vậy nên việc đánh
giá mức độ an toàn của các sản phẩm đông dược ngày càng trở nên quan trọng. Gần
đây, một số báo cáo cho thấy các loại thuốc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc

đông dược đã được làm giả mạo bằng cách trộn các loại thuốc tổng hợp không được
công bố hoặc những chất tương tự được cải biến về cấu trúc của chúng.Việc cố ý
trộn lẫnthường xảy ra khi các chất tự nhiên cần thiết đang thiếu hoặc đắt hoặc khi
nhà cung cấp dự định tăng cường hiệu quả dược lý cụ thể.
Trong các nhóm dược chất được nghiên cứu, nhóm thuốc giảm đau chống
viêm không steroid và steroid là nhóm thuốc phổ biến hay được phát hiện trộn trái
phép trong các chế phẩm đông dược, thực phẩm bảo vệ sức khỏe điều trị và hỗ trợ
điều trị các bệnh về xương khớp, giải cảm, gut.Tại Singapore, nghiên cứu của AikJiang Lau và cộng sự đã tiến hành phát hiện phenylbutazon, oxyphenylbutazon trộn
lẫn trong chếphẩm đông dược bằng sắc ký hai lần khối phổ (LC-MS/MS) [20].Tại

1


Ấn Độ, nghiên cứu của Savaliya và cộng sự đã tiến hành định tính 25 dược chất
gồm cả giảm đau, chống viêm steroid và khôngsteroid bằng LC-MS/TOF và định
lượng các chất dương tính gồm diclofenac, dexamethason,piroxicam bằng
HPLC[28]. Các trường hợp sử dụng các thuốc đông dược điều trị bệnh xương
khớp(viêm khớp dạng thấp) làm cho bệnh càng trở nên trầm trọng hơn được phát
hiện trộn các thuốc giảm đau chống viêm phenylbutazon, diclofenac, prednisolon và
paracetamol [31].
Do đó, hiện nay các nước phát triển khá mạnh các phương pháp định tính,
định lượng và phát hiện được rất nhiều các nhóm thuốc tân dược được trộn lẫn
trong thuốc đông dược, thực phẩm chức năng như LC-MS/MS, HPTLC, LCUV, NMR và LC-NMR[16].Nhưng khi nghiên cứu phát hiện các thuốc tân dược
trộn lẫn trong thuốc đông dược thì nền mẫu pha tạp giữa các dược liệucó thành phần
rất phức tạp nên chúng tôi chọn phương pháp LC/MS đạt được độ nhạy và độ đặc
hiệu cao để định tính và định lượng.
Để góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn trong thuốc
đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp xác định một số
thuốc giảm đau chống viêm trộn trái phép trong chế phẩm thuốc đông dược bằng
LC-MS/MS”.

Với mục tiêu:
1. Xây dựng qui trình định tính, định lượng paracetamol, piroxicam,
indomethacin và ketoprofen trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng
phương pháp LC/MS.
2. Ứng dụng phương pháp LC/MS để xác định paracetamol, piroxicam,
indomethacin và ketoprofen trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược.

2


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
2.1.

Tổng quan các thuốc trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược
Mặc dù thuốc đông dược đã sử dụng từ lâu, nhưng người sử dụng có rất ít

kiến thức về thành phần, tác dụng dược lý, an toàn hiệu quả của nó. Thuốc
đông dược được tự do bán trong cửa hàng thực phẩm sức khỏe, trong siêu thị,
và được tiếp thị tràn lan trên các trang mạng. Do quy định ít chặt chẽ, có nhiều
thuốc thảo dược kém chất lượng và có tình trạng trộn với thuốc tổng hợp (tân
dược) không khai báo. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Liên minh Châu Âu
(EU) ban hành một số hướng dẫn và các hành động liên quan đến an toàn và sử
dụng thuốc thảo dược thích hợp.Ở nước ta, nhằm đảm bảo chất lượng dược
liệu, chế phẩm đông dược sử dụng trong phòng và điều trị bệnh, Bộ Y tế đã
ban hành nhiều văn bản chỉ đạo, thông tư hướng dẫn nhằm tăng cường công tác
quản lý chất lượng, đáng chú ý là Thông tư 43/2014/TT- BYT ngày 24 tháng
11 năm 2014 Quy định về quản lý thực phẩm chức năng. Đặc biệt, trong năm
2016 Quốc hội đã ban hành Luật Dược 2016 số 105/2016/QH13, trong đó dành
riêng chương IV với 8 điều qui định về dược liệu và thuốc cổ truyền sản xuất
và lưu hành tại Việt Nam.

Tuy nhiên, trong nhiều năm gần đây có nhiều báo cáo cho thấy tình trạng
trộn lẫn các thuốc tân dược trong đông dược ở các nước khá nhiều và đã gây ra
nhiều tác dụng phụ nguy hiểm có thể gây tử vong cho người sử dụng.Các nhóm
thuốc tân dược trộn lẫn trong đông dược Trung Quốc bao gồm nhóm giảm đau
chống viêm steroid và không steroid (paracetamol, diclofenac, indomethacin,
aspirin), thuốc chống co giật, thuốc rối loạn chức năng cương dương, thuốc hạ
đường huyết được báo cáo tại tìm thấy các nước Hà Lan, Bỉ, New Zealand, Úc,
Nhật Bản, Anh, Đài Loan, Mỹ[30].
Chế phẩm đông dược thường phân chia theotác dụng dược lý như nhóm
thần kinh cơ; nhóm thuốc chữa các bệnh về Âm, về Huyết; nhómthuốc điều
kinh, an thai; nhóm thuốc thanh nhiệt, giải độc, tiêu ban, lợi thuỷ… Khi các
nhómthuốc dược chất được trộn trái phép thường có tác dụng dược lý gần

3


giống tác dụng dược lý củachế phẩm đông dược, gây sự nhầm lẫn tác dụng của
chế phẩm với dược chất.Các hoạt chất tân dược được dùng để trộn lẫn bao gồm
nhiều nhóm hợp chất khác nhau, trong đó đáng chú ý là: Nhóm hoạt chất tăng
cường khả năng sinh lý (sildenafil và dẫn chất sildenafil, tadalafil và
homosildenafil) [8],[12], [15],[21], [22], [23], [27]. Nhóm phenylbutazon,
caffein và oxyphenbutazon [20]. Nhóm Corticoid (dexamethason, prednisolon,
betamethason…)[13],

[28],

[34].

Nhóm

thuốc

kháng

Histamin

(clopheniramin,...). Nhóm thuốc an thần gây ngủ (diazepam) [23]. Nhóm thuốc
giảm béo (sibutramin, phenolphthalein, N-mono-desmethyl sibutramin) [12],
[17], [25], [32]. Nhóm thuốc hạ glucose-huyết (metformin, gliclazid,...) [12],
[19], [24]. Nhóm thuốc hạ huyết áp (nifedipin, amlodipin,propranolon...) [23],
[24], [29].Và nhóm lợi tiểu [35].
Trong đó, có các thuốc nhóm giảm đau chống viêm không steroid
(diclofenac, ibuprofen, indomethacin, paracetamol, ketoprofen, piroxicam…)
được phát hiện trộn trong các thuốc đông dược[18],[23], [28], [33], [34]. Do
nhóm thuốc có giá thành hợp lí và tác dụng dược lí mạnh nên được trộn nhiều
trong chế phẩm đông dược. Bên cạch đó nhóm thuốc chống viêm không steroid
có nhiều tác dụng không mong muốn. Nênnhóm nghiên cứu lựa chọn 6 chất
diclofenac, ibuprofen, indomethacin, paracetamol, ketoprofen, piroxicam để
xây dựng phương pháp xác định các chất này trong chế phầm đông dược.
Trong khuôn khổ luận văn dưới đây sẽ trình bày phương pháp xác định 4 chất
paracetamol, piroxicam, ketoprofen và indomethacinđược trộn trong đông
dược bằng LC/MS sử dụng ion hóa phun điện tích dương ESI(+).

4


2.2.

Tổng quan về đ
đối tượng nghiên cứu

2.2.1. Tổng quan về Paracetamol
-

Công thức hóa học: C8H9NO2

-

Khối lượng phân tử: M= 151,2

-

Tên khoa học:N-(4- hydroxyphenyl) acetamid
acetamid.

-

Tính chất:Bột kếtt tinh tr
trắng, không mùi, vị đắng nhẹ,, nóng chảy
ch ở khoảng 170oC,
pKa= 9,51.. Hơi tan trong nư
nước,tan nhiều hơn trong nướ
ớc sôi, rất khó tan
cloroform,ether, methylen clorid, ddễ tan trong dung dịch kiềm,
m, ethanol 96%. Dung
dịch hòa trong nướcc có pH kho
khoảng 5,3 -5,6[2], [6].

-

Liều dùng:Liềuu dùng cho ngư
người lớn và trẻ em trên 11 tuổi,
i, uống
u
hoặc đưa vào
trựctràng là 325 - 650 mg, ccứ 4 - 6 giờ một lần,
n, nhưng không quá 4g một
m ngày[2],
[3].
2.2.2. Tổng quan về indomethacin

5


-

Công thức phân tử: C19H16ClNO4.

-

Khối lượng phân tử: M= 357,8

-

Tên khoa học: Acid 1 ––(4-clorobenzoyl)-5-methoxy-2-methylindol
methylindol-3-yl acetic.

-

Tính chất:Bột kếtt tinh tr

trắng đến vàng (không bền vớii ánh sáng),
sáng) không mùi hay hầu
như không mùi. Thựcc ttế không tan trong nước,
c, tan trong cloroform,
clorofor hơi tan trong
ethanol 96% và aceton. B
Bền trong môi trường trung tính hoặcc acid yếu,
y
phân hủy
trong dung dịch kiềm
mm
mạnh.
Độ chảy khoảng 158oC – 162oC.
Có tính acid, cho phảnn ứng của nhân indol, nhân thơm và clo hữ
ữu cơ[2], [6].

-

Liều dùng: 0,05-0,075
0,075 g/ngày, chia 3 llần sau khi ăn hoặc là đặặt hậu môn viên đạn
0,05 g hay 0,1 g vào bu
buổi tối [6].
2.2.3. Tổng quan về piroxicam

-

Công thức phân tử: C15H13N3O4S.

-

Khối lượng phân tử: M= 331,4.

-

Tên

khoa

học:

4--Hydroxyl-2-methyl-N–(pyridine-2-yl)-2H
2H-1,2-benzothiazin-3-

carboxamid - 1,1 - dioxid
dioxid.
-

Tính chất:Bột kếtt tinh màu vàng nh
nhạt, vị đắng, không mùi. Thự
ực tế không tan trong
nước, tan trong methylen clorid, khó tan trong ethanol. Dung dịch
d
bão hòa trong
dioxan- nước (2:1)
2:1) có pKa kho
khoảng 6,3.Nhiệt độ nóng chảy khoảảng 200oC [2], [6].

-

Liều dùng:Người lớnn uuống 10-30 mg/ngày, một lần vào bữaa ăn (không quá liều tối

đa 40 mg/ngày) hoặcc đđặt thuốc đạn 1 viên vào buổi tối trướcc khi đi ngủ.
ng

6


Đau cấp: Tiêm bắpp ngày 1 ống(nếu đau quặn thì có thể tiêm 2 ống) chỉ dùng trong
vài ngày rồi chuyểnn sang uuống hoặc nạp đạn [6].
2.2.4. Tổng quan về ketoprofen

-

Công thức phân tử: C16H14O3

-

Khối lượng phân tử:: M= 254,3

-

Tên khoa học: Acid 2-((3- benzoylphenyl) propionic[2], [3].

-

Tính chất: Bột kếtt tinh tr
trắng hoặc gần như trắng, thực tế không tan trong nước,
nư
dễ
tan trong aceton,
on, ethanol, và methylen clorid [2], [6].

-

Liều dùng: Vài ngày đđầu dùng liều tấn
n công 300 mg, chia làm 3 lần/ngày,
l
uống sau
bữa ăn. Sau dùng liềuu duy trì 150
150-200 mg, hoặc nạp ngày 1, 2 viên thuốc
thu đạn. Liều
tiêm bắp ngày 50-100
100 mg.
Thuốc bôi trị bong gân, viêm gân, hư kh
khớp, ngày bôi 2 lần [6].
2.2.5. Tác dụng
ng và tác dụng không mong muốn của các thuốcc thuộc
thu nhóm chống
viêm không steriod.
a) Tác dụng
ng và cơ ch
chế tác dụng
Tác dụng giảm
m đau, hhạ sốt, chống viêm: Nhóm thuốcc này có tác dụng
d
giảm
đau, hạ sốt, chống
ng viêm ở những mức độ khác nhau. Thuốc ứcc chế
ch cyclo-oxygenase
(COX)) là enzym xúc tác vi
việc sản xuất một số chấtt trung gian, đặc

đ biệt là
prostaglandin, một chấất gây ra phản ứng đau, sốt,
t, viêm. Có hai dạng
d
enzym COX
là COX-1 có ở thành ddạ dày, thành mạch, thận và COX-2 có ở tổ
t chức viêm hay tổn
thương. Do đó thuốcc ức chế COX-2 thì có tác dụng điều trị,, thuốc
thu tác dụng lên
COX- 1 thì gây ra tác ddụng phụ. Các thuốc chống
ng viêm không chọn
ch lọc ức chế cả
hai loại COX-11 và COX
COX-2, bao gồm
m ibuprofen, indomethacin, naproxen, piroxicam,
7


diclofenac, ketoprofen. Sự khác nhau giữa các thuốc chống viêm không steroid chủ
yếu là các biểu hiện của tác dụng không mong muốn. Các thuốc có tính chọn lọc ít
gây các tác dụng phụ, còn tác dụng chống viêm, giảm đau giống như các thuốc
không chọn lọc. Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 có thể gây các tác dụng phụ ở
thận giống như các thuốc không chọn lọc. Ngoài ra các thuốc ức chế chọn lọc
không có tác dụng ức chế tiểu cầu kết dính, còn các thuốc ức chế không chọn lọc có
tác dụng ức chế kết dính tiểu cầu nhưng có thể hồi phục được, trái với acid
acetylsalicylic.
Tác dụng hạ nhiệt: Do ức chế trung tâm điều hòa nhiệt ở vùng dưới đồi, gây
giãn mạch ngoại biên, tăng tỏa nhiệt và tăng tiết mồ hôi.
Tác dụng giảm đau của nhóm thuốc này chỉ đối với triệu chứng đau nhẹ do
viêm như đau đầu, đau răng, đau dây thần kinh, đau khớp, đau cơ [6].

b) Tác dụng không mong muốn
Các tác dụng phụ do ức chế tổng hợp prostaglandin
Rối loạn dạ dày-ruột: Thuốc chống viêm không steroid với mức độ khác nhau ức
chế COX-1 làm giảm tổng hợp prostaglandin ở dạ dày dẫn đến ức chế sản sinh ra
chất mucin (yếu tố bảo vệ dạ dày), tạo điều kiện cho HCl và pepsin của dịch vị gây
tổn thương cho niêm mạc. Ngoài ra các thuốc chống viêm không steroid còn tác
động trực tiếp hủy hoại các tế bào biểu mô tiêu hóa, gây thủng ổ loét do phần lớn
chúng đều là những acid.
Trên hệ tiết niệu: Ức chế prostaglandin ở thận làm giảm tưới máu nuôi thận, giảm
mức lọc cầu thận, giải phóng các renin, ảnh hưởng tới việc di chuyển ion và trao đổi
nước, gây nên các rối loạn chức năng tiểu cầu thận, viêm thận mô kẽ, suy thận cấp.
Trên hệ huyết học: Tăng nguy cơ chảy máu, kéo dài thời gian đông máu, có thể gây
ra hiện tượng xuất huyết dưới da do ức chế ngưng kết tiểu cầu.
Với thai phụ: Dễ gây quái thai ở 3 tháng đầu, ở 3 tháng cuối có thể làm tăng thời
gian mang thai, có thể gây đóng sớm ống động mạch, chảy máu trong tử cung, nguy
hiểm cho sản phụ.

8


Với những người bị phù hoặc có xu hướng phù: Như suy tim, suy thận mạn, suy gan
có thể gây tình trạng giữ nước nặng nếu điều trị bằng nhóm thuốc này.

9


Các tác dụng phụ không do ức chế tổng hợp prostaglandin
Trên hệ thần kinh: Có thể gây ù tai, điếc thoáng qua, say thuốc. Ngoài ra thuốc có
thể gây dị ứng, gây cơn hen giả vì thuốc ức chế COX nên làm tăng các chất chuyển
hóa theo đường lipooxygenase (tăng leucotrien). Rối loạn chức năng gan, rối loạn

về máu theo kiểu nhiễm độc tế bào (mất bạch cầu hạt).
Trên hệ tim mạch: Các thuốc ức chế COX-2 và liều cao các thuốc chống viêm
không steroid truyền thống có nguy cơ gây nhồi máu cơ tim [3].
2.3.

Tổng quan các phương pháp định lượng các thuốc giảm đau chống
viêmkhông steroid trộn trái phép trong đông dược

2.3.1. Trên thế giới
Hiện nay có nhiều phương pháp xác định các thuốc trộn trong đông dược như
LC-MS/MS, HPTLC, LC-UV, NMR và LC-NMR. Các phương pháp phổ biến tiến
hành định lượng các thuốc giảm đau chống viêm trộn trong chế phẩm đông dược
tham khảo được tổng hợp trong bảng 1.1.

10


Bảng 1. 1 Các phương pháp xác định NSAIDs trộn trong đông dược
TLTK Hoạt chất
Phương pháp
18

Indomethacin
Acetaminophen
Piroxicam
Ketoprofen

LC/MS
Cột: HSS T3 (2,1mm × 100 mm; 1,8 μm)
Pha động: 10 mM ammonium acetat trong nước cất (A) và

CAN (B) (gradient).
Detector : ESI- MS.

28

Indomethacin
Acetaminophen
Piroxicam
Ketoprofen

33

Paracetamol
Indomethacin

11

Paracetamol
Indomethacin
Ketoprofen

34

Paracetamol
Piroxicam

26

paracetamol
Ibuprofen

Diclofenac
Aspirin

LC/MS
Cột C18 (250 mm × 4,6 mm; 5 µm).
Pha động: Methanol (A) : 0,01 M Ammonium acetat (B)
(gradient ).
Detector: APCI và ESI- MS và bước sóng UV 230 nm và
330 nm cho NSAIDs.
LC/MS
Cột Nucleodur Sphinx RP (150 mm × 4,6 mm; 5µm).
Tiền
cột:
Nucleodur
Sphinx
RP
(125 mm × 10 mm, 5 µm)
Pha động: Nước (A) và acetonitril (B) đều có acid acetic
0,1% (gradient ).
Detector: ESI-MS và bước sóng phát hiện 254 nm.
LC/MS
Cột: Superspher 100 RP-18 (125 mm × 3 mm, 4µm) với cột
bảo vệ Superspher 100 RP-18(4 mm × 4 mm).
Pha động: Đệm 10 mM ammonium formate, pH 3,0 (A):
acetonitrile (B)
Detector: ESI-MS.
TLC
Bản mỏng sillica gel GF 254.
Dung môi: Cloroform- methanol (9:1)
Phát hiện vết : UV (254 nm)

TLC
Bản mỏng: Silicagel H
Detector: Hơi iod
Pha động: Toluen : n-propanol : acid formic (5: 4: 1)
n-hexan :1% CTAB trong MeOH : ethyl acetat: acid
acetic(13:1:4:2)
Toluen: 1% CTAB trong MeOH : n-propanol: acid formic
(14:1:3:2).
n-hexane : ethyl acetate : acid acetic (7: 2,5: 0,5).

11


2.3.2. Tại Việt Nam
Mặc dù các chất thuộc nhóm giảm đau chống viêm steroid đã được quan tâm
từ rất lâu và đã có nhiều nhóm nghiên cứu tại Việt Nam đã tiến hành xây dựng các
phương pháp phát hiện các chất giảm đau chống viêm steroid trộn trái phép trong
chế phẩm đông dược. Các phương pháp đã được xây dựng phát hiện các thuốc này
như LC-UV [4], [5], [7], TLC [8] và LC-MS tiêm trực tiếp mẫu vào khối phổ [10].
Nhưng các chất thuộc nhóm giảm đau chống viêm không steroid có rất ít nghiên
cứu xây dựng phương pháp phát hiện các chất này trộn trái phép trong chế phẩm
đông dược. Hơn nữa, số nghiên cứu tiến hành trên các mẫu đông dược là thực phẩm
chức năng chưa nhiều chủ yếu tiến hành trên các mẫu đông dược.
Chúng tôi chỉ tìm thấy 2 nghiên cứu đã công bố về phát hiện các chất thuộc
nhóm giảm đau chống viêmkhông steroid trộn lẫn trong chế phẩm đông dược và
thực phẩm chức năng:
Nghiên cứu của Cao Công Khánh đã tiến hành địnhlượng silbutramin,
furosemid, piroxicam, dexamethason trong thực phẩm chức năng bằng HPLCtrên
các dạng viên nén, nang và lỏng cho thấy có 5 mẫu dương tính sibutramin, không
cópiroxicam, dexamethason và furosemid trong 20 mẫu thu thập trên thị trường [7].

Năm 2016, nhóm nghiên cứu của chúng tôi tại trường đại học Dược Hà Nội đã
thực hiện xây dựngphương pháp phân tích paracetamol, piroxicam, diclofenac,
indomethacin trộn lẫn trong chếphẩm đông dược bằng HPTLC với hệ dung môi
triển khai n-hexan: ethyl acetat: acid acetic(6:2,5:1,5), phát hiện tại bước sóng 254
nm và quét phổ UV trong khoảng 200 – 700 nm của vếtchất dương tính được tách
ra so với phổ chuẩn và đã xác định 1 mẫu dương tính vớiparacetamol chứa 37,64
mg/liều trong 29 mẫu thu thập trên thị trường [9].
Bên cạnh đó, các chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng có mặt trên thị
trường trong nước hiện nay rất đa dạng, nhiều thành phần, không được kiểm soát
chặt chẽ được bán tràn lan trên mạng, trong siêu thị… nên có nguy cơ cao các sản
phẩm này được làm giả gây ra nhiều tác dụng không muốn khi sử dụng cho người
dùng.

12


Việc sử dụng HPTLC và LC-UV có nhiều ưu điểm xong bên cạnh đó cũng có
những hạn chế nhất định. Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành
xác định một số chất giảm đau chống viêm không steroid trộn trong chế phẩm đông
dược bằng phương pháp TLC và HPTLC [9]. Trong nghiên cứu sử dụng TLC phát
hiện các mẫu dương tính nhưng khi mẫu được đưa vào chồng phổ trong phương
pháp HPTLC thì không trùng phổ với phổ chất chuẩn. Do vậy khi dùng phương
pháp TLC xuất hiện trường hợp dương tính giả. Đồng thời, có các mẫu được xác
định bằng phương pháp HPTLC không trùng phổ với phổ chất chuẩn nhưng khi đưa
vào phân tích bằng phương pháp HPLC có kết quả dương tính. Do vậy khi sử dụng
phương pháp HPTLC có những trường hợp âm tính giả. Từ đó, ta thấy trên một nền
mẫu có tính chất rất phức tạp như chế phẩm đông dược, có thể có các thành phần
trong nền mẫu không tách hoàn toàn ra khỏi pic chính chất phân tích nên có thể dẫn
đến việc đôi khi bị nhầm lẫn trong phân tích định tính và định lượng. Bên cạnh đó
phương pháp LC/MS có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đã được ứng dụng nhiều trên

thế giới nhưng chưa được ứng dụng nhiều trong nước ta để phân tích các thuốc
giảm đau chống viêm không steroid trong các chế phẩm đông dược. Trong đề tài
này, phương pháp LC/MS được sử dụng định tính và định lượng các thuốc giảm đau
chống viêm không steroid trong chế phẩm đông dược để cải thiện độ nhạy và độ đặc
hiệu so với các phương pháp khác, giúp cho kết luận có độ tin cậy cao hơn.
2.4.

Tổng quan về sắc kí lỏng khối phổ

2.4.1. Sắc kí lỏng hiệu năng cao
a. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi
ion, loại cỡ, ái lực… tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng.
b. Nguyên tắc
Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và được cho qua cột bằng một
dòng chất lỏng liên tục (pha động). Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển

13


qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất
tan với pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển qua cột khác nhau, các thành
phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định
lượng [1].
c. Cấu tạo máy HPLC
-

Bình chứa pha động

-

Bơm cao áp

-

Bộ phận nạp mẫu

-

Cột sắc kí

-

Đầu dò (Detector)

-

Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lí dữ liệu và điều khiển hệ
thống.

2.4.2. Sắc kí lỏng khối phổ
a. Khái niệm
Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách
các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance
liquid chromatography – HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận
khối phổ (Mass spectrometry – MS).
Nguồn ion
hóa

Tứ cực thứ
nhất

Buồng va
chạm

Tứ cực thứ
hai

Hình 1. 1. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS với tứ cực chập ba.
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu
các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên
sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc
từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn
đối với chuyển động trong điện trường hay từ trường của ion. Nếu biết được điện
tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó.
14


b. Thiết bị khối phổ (Đầu dò khối phổ)
-

Bộ nạp mẫu: Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết bị khối
phổ.Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký.

-

Bộ nguồn ion hóa: Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử
mang điện tích hoặc sự bắn phá, phânmảnh phân tử trung hoà thành cácmảnh ion,

các

gốc

mang

điện

tích

bằng

các

phần

tử

mangnăng

lượng

cao.Ionphântửvàcácmảnhionlàcácphântửcókhối
lượngtừđóngườitatínhđượcsốkhốiz=m/e(khốilượngion/điệntích).
So với các kĩ thuật ion hóa đòi hỏi áp suất thấp như bắn phá nguyên tử nhanh
với dòng liên tục (Continuous Flow- Fast Atom Bombardment CF- FAB) hay tia
nhiệt (Thermospray- TS), kĩ thuật ion hóa áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure
Ionization- API) có ưu điểm hơn. Ngoài ra, API ion hóa mềm (soft ionization),
không phá vỡ cấu trúc hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion
phân tử. Với API có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra

những ion con tùy theo yêu cầu phân tích.
Có ba kiểu hình thành ion: Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton –
ESI), Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical
Ionization – APCI), Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric
Pressure Photonization – APPI).
Trong đó, kiểu ion hóa phun điện tử (ESI) thực hiện ở áp suất khí quyển. Các
mẫu thử trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một ống mao quản mà ở đầu
ống này có một điện thế có thể lên đến 3500V. Đồng thời, các dung dịch mẫu này
được phun sương dưới tác động của một dòng khí. Kết quả là tạo ra các hạt mang
điện tích và được gia tốc đến điện cực. Kỹ thuật này phù hợp cho chất phân cực,
không bền với nhiệt và nghiên cứu các phân tử sinh học có khối lượng tới 100
000Da.

15


-

Hình 1. 2. Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI
Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Sau khi được tạo thành thì các ion sẽđược
gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và từ trường để đi
đến bộ phận phát hiện.
Một số bộ phân tích khối thường dùng: Tứ cực (Quadrupole), Bẫy ion (Ion
trap), Ống đo thời gian bay (Time-of-flight tube).

Hình 1. 3. Tứ cực gập cong
Trong đó, bộ phân tích khối Tứ cực (Quadrupole): Có 4 thanh tích điện đặt
song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau. Các ion phù hợp với tần số quét
sẽ đi thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực.
Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2,

Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ. Tứ cực Q1, Q3 làm nhiệm vụ phân tích

16


khối, tứ cực Q2 là ngăn để cho các ion va chạm, tạo ra các ion mảnh nhỏ hơn, khí
dùng cho va chạm thường là khí argon. Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này được
gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thường được dùng để khẳng định cấu trúc các
chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành phần .
-

Bộ phận phát hiện ion (detector): Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch đại
thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.

-

Bộ

phận

ghi

và

xử

lý

số

liệu

(data

system):

Làmộthệthốngbaogồmhệthốngkếtnốivàthunhậndữliệuthôvà
phầnmềmkiểmsoát,điềukhiểnthiếtbị,quátrìnhphântíchvàtínhtoán,xử
lý,báocáo,kếtxuấtdữliệuthôvừathuđược. Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối
phổ bao gồm :
 Quét toàn phổ (SCAN):
Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho
khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường
dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu
dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thường được lựa chọn để khảo sát ion
mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thường được sử dụng
để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất
 SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring)
Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2
kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.
SRM: Cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh
ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.
MRM: Trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên
các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông
dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân
mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion
con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để
phát hiện.

17