Nghiên cứu xác định piroxicam và indomethacin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ TRÂM
Mã sinh viên: 1101545

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH PIROXICAM
VÀ INDOMETHACIN TRỘN TRÁI PHÉP
TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC
BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ TRÂM
Mã sinh viên: 1101545

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH PIROXICAM
VÀ INDOMETHACIN TRỘN TRÁI PHÉP
TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC
BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh
2. DS. Nguyễn Thị Hà
Nơi thực hiện:

Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:
PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
DS. Nguyễn Thị Hà
Là ngƣời đã hƣớng dẫn, tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá
trình thực hiện và hoàn thành khóa luận.
Cho phép tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS.Đào Thị Cẩm Minh, ngƣời
đã động viên, nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên bộ
môn Hóa phân tích – Độc chất, bộ môn Hóa Dƣợc đã tạo điều kiện cho tôi hoàn
thành khóa luận.
Qua đây tôi xin cảm ơn các thầy cô tại các bộ môn trƣờng Đại học Dƣợc Hà
Nội đã truyền kiến thức và niềm tự hào là sinh viên trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội
trong suốt 5 năm qua.
Cuối cùng tôi xin dành lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn khích lệ, tạo
động lực cho tôi trong quá trình học tập vừa qua.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Lê Thị Trâm


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN………………………………………………………...3
1.1. Thực trạng chế phẩm đông dƣợc bị trộn trái phép tân dƣợc............................... 3
1.2. Tổng quan về các chất nghiên cứu .................................................................... 5
1.2.1. Tổng quan về Piroxicam ................................................................................ 5
1.2.2. Tổng quan về Indomethacin ........................................................................... 7
1.3. Một số nghiên cứu xác định Piroxicam và Indomethacin trong nền mẫu đông
dƣợc………………….. ........................................................................................... 9
1.4. Tổng quan về phƣơng pháp dùng trong nghiên cứu......................................... 12
1.4.1. Phƣơng pháp xử lí mẫu ................................................................................ 12
1.4.2. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng ..................................................................... 13
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………17
2.1. Nguyên liệu, thiết bị ....................................................................................... 17
2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................................. 17
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu ........................................................................ 17
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu ..................................................................................... 17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 18
2.3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký....................................................................... 18
2.3.2. Khảo sát điều kiện xử lí mẫu ........................................................................ 18
2.3.3. Thẩm định quy trình .................................................................................... 19
2.3.4. Ứng dụng phƣơng pháp trên một số chế phẩm đông dƣợc trên thị trƣờng .... 19
2.4. Phƣơng pháp xử lí số liệu ............................................................................... 19
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……………………20
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích……………………………………..20
3.1.1. Khảo sát hệ dung môi pha động ................................................................... 20


3.1.2. Khảo sát bƣớc sóng phát hiện ...................................................................... 22

3.1.3. Khảo sát điều kiện xử lí mẫu ........................................................................ 23
3.1.4. Điều kiện phân tích ...................................................................................... 24
3.2. Thẩm định phƣơng pháp ................................................................................. 25
3.2.1. Tính thích hợp hệ thống ............................................................................... 25
3.2.2. Tính chọn lọc ............................................................................................... 26
3.2.3. Khoảng tuyến tính ....................................................................................... 28
3.2.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng ....................................................... 30
3.2.5. Độ lặp lại và độ đúng của phƣơng pháp ....................................................... 33
3.3. Ứng dụng xác định Piroxicam và Indomethacin trong một số mẫu chế phẩm
đông dƣợc trên thị trƣờng ...................................................................................... 34
3.4. BÀN LUẬN ................................................................................................... 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ACN

Acetonitril

DCM

Dicloromethan

EtOH

Ethanol

HPTLC

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin Layer
Chromatography)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lƣợng (Limit of quantitation)

M

Khối lƣợng

NSAIDs

Thuốc

chống

viêm

không

steroid

(Nonsteroidal

inflacmatory Drugs)
Rf

Hệ số lƣu giữ

RSD

Relative Standard Deviation (độ lệch chuẩn tƣơng đối)

S

Diện tích pic

SKĐ

Sắc ký đồ

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

S/N

Tín hiệu/nhiễu (Signal/Noise)

TB

Trung bình

TFA

Acid trifloracetic

Anti-


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số nghiên cứu xác định Piroxicam trong nền mẫu đông dƣợc 10
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu phát hiện Indomethacin trong nền mẫu đông
dƣợc. ............................................................................................................ 11
Bảng 1.3. Một số chất thƣờng dùng làm pha tĩnh cho SKLM ....................... 14
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết. .................................................. 23
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống. ................................ 25
Bảng 3.3.Kết quả đánh giá độ tuyến tính của Piroxicam và Indomethacin. ... 29
Bảng 3.4. Kết quả xác định LOD, LOQ của Piroxicam và Indomethacin. .... 33
Bảng 3.5. Kết quả xác định độ lặp lại và độ đúng. ........................................ 34
Bảng 3.6. Kết quả kiểm tra mẫu chế phẩm đông dƣợc trên thị trƣờng bằng
SKLM. ......................................................................................................... 36


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1. Kết quả khảo sát dung môi pha động. ........................................... 20
Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát tỉ lệ pha động. ................................................. 21
Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát bƣớc sóng phát hiện. ....................................... 22
Hình 3.4. Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi chiết. .................................... 24
Hình 3.5. Sơ đồ xử lí mẫu phân tích. ............................................................ 24
Hình 3.6. Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của phƣơng pháp. ........................ 26

Hình 3.7. Sắc ký đồ analog xác định độ chọn lọc của Piroxicam và
Indomethacin. ............................................................................................... 27
Hình 3.8. Sắc ký đồ đánh giá độ tuyến tính Piroxicam và Indomethacin. ..... 28
Hình 3.9. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của Piroxicam và Indomethacin. .. 29
Hình 3.10. Sắc ký đồ xác định LOD Piroxicam và Indomethacin. ................ 30
Hình 3.11. Sắc ký đồ analog xác định LOD, LOQ Piroxicam. ...................... 31
Hình 3.12. Sắc ký đồ analog xác định LOD, LOQ Indomethacin. ................ 32
Hình 3.13. Sắc ký đồ kết quả mẫu chế phẩm đông dƣợc trên thị trƣờng bằng
SKLM. ......................................................................................................... 35
Hình 3.14. Sắc ký đồ analog mẫu TB01 phát hiện ở 254 nm. ....................... 37


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, các loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên của y học
truyền thống phƣơng đông (đông dƣợc) ngày càng đƣợc nhiều ngƣời chú ý và sử
dụng bởi họ tin rằng những sản phẩm này đáng tin cậy, an toàn, ít độc hại và thƣờng
rẻ tiền. Cùng với đó là việc sử dụng theo truyền miệng, không quan tâm đến nguồn
gốc xuất xứ, các sản phẩm đƣợc bán tự do trong các cửa hàng thực phẩm sức khỏe,
trong siêu thị và đƣợc quảng cáo tràn lan trên các trang mạng,... Do đó, nhiều cơ sở
sản xuất vì mục đích lợi nhuận đã cố tình trộn trái phép thuốc tân dƣợc vào các chế
phẩm đông dƣợc, thực phẩm chức năng để làm giảm nhanh các triệu chứng hay tạo
cảm giác đánh lừa ngƣời tiêu dùng. Hậu quả của việc dùng thuốc đông y trộn trái
phép tân dƣợc rất nghiêm trọng và khó lƣờng vì ngƣời tiêu dùng cho rằng mình
đang dùng thuốc có nguồn gốc tự nhiên nên an toàn và có thể dùng kéo dài.
Cho tới nay đã có rất nhiều chế phẩm đƣợc phát hiện là có chứa NSAID nhƣ:
Joint-Soft, Ke Bi Gu Tai Jiao Nang đƣợc bán qua đƣờng xách tay vào Singapore,
thuốc gia truyền Hou Li Bao sản xuất tại Malaysia (trộn Piroxicam) [14], [15], Pil
Raja Urat Asli đƣợc bán trên mạng (trộn Piroxicam và Indomethacin) [14], Zhen

Feng Da Brand Xi Tong Wan, Huo Luo Jing Dan do Trung Quốc sản xuất (trộn
Indomethacin) [16], [17], Meizitang Botanical Slicming 100% Natural Soft Gel
đƣợc bán qua mạng ở Trung Quốc (trộn Diclofenac) [13],… Các trƣờng hợp này
đƣợc báo cáo với các biểu hiện nhƣ: xuất huyết dạ dày, có phản ứng da nghiêm
trọng, rối loạn huyết học,… [17], buồn nôn, nôn [14].
NSAID là nhóm thuốc chống viêm không steroid với nhiều tác dụng phụ, cần
đƣợc kê đơn và phải theo dõi chặt chẽ khi dùng. Với tác dụng giảm đau, chống
viêm, các thuốc này có thể đƣợc trộn vào trong các chế phẩm điều trị giảm đau,
viêm khớp, thấp khớp, gout,… nhằm mục đích giảm nhanh triệu chứng của các
bệnh này. Nghiên cứu xác định một số thuốc chống viêm giảm đau trộn lẫn trong
chế phẩm thuốc đông dƣợc bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và sắc kí lỏng
hiệu năng cao của Nguyễn Thị Hà (2016) đã xây dựng qui trình định tính, định
lƣợng Paracetamol, Diclofenac natri trộn lẫn trong chế phẩm đông dƣợc bằng


2

phƣơng pháp HPTLC và HPLC và ứng dụng phƣơng pháp đã xây dựng để xác
định hai chất này trong chế phẩm đông dƣợc trên thị trƣờng [4].
Piroxicam và Indomethacin là hai thuốc thuộc nhóm NSAID có tác dụng
giảm đau, hạ sốt, chống viêm, chống kết tập tiểu cầu đƣợc sử dụng rộng rãi và giá
thành trên thị trƣờng tƣơng đối rẻ, do đó thƣờng dễ bị trộn vào các chế phẩm đông
dƣợc. Hiện nay ở Việt Nam, tác giả Cao Công Khánh và cộng sự đã xây dựng
phƣơng pháp xác định sự có mặt của Piroxicam trong thực phẩm chức năng bằng
HPLC (2013).
Nhằm mục đích góp phần trong công tác nghiên cứu xác định thuốc tân dƣợc
đƣợc trộn trái phép trong các chế phẩm đông dƣợc, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài: “Nghiên cứu xác định Piroxicam và Indomethacin trộn trái phép trong chế
phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng” với hai mục tiêu cụ thể sau:
1. Xây dựng phƣơng pháp xác định Piroxicam và Indomethacin trong chế phẩm đông

dƣợc bằng sắc ký lớp mỏng.
2. Áp dụng phƣơng pháp xây dựng đƣợc để xác định Piroxicam và Indomethacin
trong

một

số

chế

phẩm

đông

dƣợc

(dạng

rắn)

trên

thị

trƣờng.


3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.

Thực trạng chế phẩm đông dƣợc bị trộn trái phép tân dƣợc.
Hiện nay, tình trạng thuốc đông dƣợc, thực phẩm chức năng bị trộn trái phép

tân dƣợc đang diễn ra phổ biến, đây không chỉ là vấn đề riêng của nƣớc ta mà còn là
vấn đề của các nƣớc trên thế giới.
Ở Châu Âu, nƣớc Anh đã ghi nhận các trƣờng hợp ngƣời bệnh nhập viện điều
trị các tác dụng phụ do trộn Hydrocortison, Clobetason butyrat, Betamethason
valerat, Clobetasol propionat trong các chế phẩm đông dƣợc [27]. Ở Châu Á, ngay
cả nƣớc phát triển nhƣ Nhật Bản vẫn phát hiện trộn trái phép các thuốc điều trị tiểu
đƣờng nhóm sulfonylurea trong thực phẩm chức năng [20]. Rất nhiều nhóm thuốc
tân dƣợc đƣợc trộn trong thuốc đông dƣợc, thực phẩm chức năng bị phát hiện tại Ấn
Độ và Trung Quốc [21], [24], [28]. Đặc biệt khu vực Đông Nam Á, các nƣớc nhƣ
Thái Lan, Indonesia cũng tích cực trong việc xây dựng phƣơng pháp phát hiện các
thuốc tân dƣợc đƣợc trộn trái phép trong các thuốc đông dƣợc [32].
Ở Việt Nam, bên cạnh sự phát triển sản xuất, sử dụng dƣợc liệu và các thành
phẩm từ dƣợc liệu (đông dƣợc), việc quản lý chất lƣợng những sản phẩm này chƣa
đƣợc tiến hành đồng bộ và triệt để, dẫn đến tình trạng thuốc đông dƣợc kém chất
lƣợng, bị làm giả vẫn còn tồn tại.
Các thuốc tân dƣợc đƣợc dùng để trộn vào các chế phẩm đông dƣợc gồm
nhiều nhóm hợp chất khác nhau, trong đó đáng chú ý nhất là:
-

Nhóm hoạt chất tăng cƣờng khả năng sinh lý (Sildenafil và dẫn chất) [9].

-

Nhóm Corticoid (Dexamethason, Prednisolon, Betamethason [5], [7].

-

Nhóm thuốc kháng Histamin (Clopheniramin,...) [22], [31].

-

Nhóm thuốc chống viêm không Steroid (Diclofenac, Ibuprofen, Piroxicam,
Indomethacin) [22], [28], [31].

-

Nhóm thuốc hạ nhiệt giảm đau (Paracetamol, Aspirin) [31].

-

Nhóm thuốc an thần gây ngủ (Diazepam) [6].

-

Nhóm thuốc giảm béo (Sibutramin),... [19].

-

Nhóm thuốc hạ glucose huyết (Metformin, Gliclazid, Glimepirid,...) [20], [21].


4

-

Thuốc hạ huyết áp (Nifedipin, Amlodipin,...) [23], [33].
Thuốc giả thƣờng đƣợc phát hiện ở vùng sâu vùng xa và nông thôn, nhƣng

những năm qua thuốc giả đã đƣợc bày bán cả ở hiệu thuốc, đi vào cả bệnh viện
thông qua đấu thầu. Đặc biệt, thuốc giả ngày càng đƣợc làm khéo léo, tinh vi hơn,
ví dụ trộn tân dƣợc vào vỏ nang mềm, lƣợng trộn đƣợc tính theo liều dùng của
thuốc,… nên bằng cảm quan rất khó phát hiện, do đó mà ngƣời bệnh khó có thể
phân biệt đƣợc thuốc giả để có thể tránh sử dụng.
Một số ví dụ về các thuốc đã bị phát hiện nhƣ:
-

Năm 2005: nang mềm Tăng phì hoàn (Ceng Fui Yen) do công ty TNHH Dƣợc
phẩm WELIP – Malaysia sản xuất, công ty CP Dƣợc liệu TW2 nhập khẩu, trộn
Dexamethason và Cyproheptadin [6].

-

Năm 2007, thuốc Dân tộc cứu nhân vật, sản xuất tại Campuchia, trộn 4 loại tân
dƣợc là Dexamethason, Diazepam, Paracetamol và Cypro-heptadin [6].

-

Năm 2008, cơ sở thuốc gia truyền lƣơng y Dƣơng Ngô Hiếu (địa chỉ: Đồng Ngô,
Ngọc Vân, Tân Yên, Bắc Giang) sản xuất 2 thuốc chƣa đƣợc cấp phép lƣu hành:
thuốc KQ 3 Thận khí hoàn chữa đái tháo đƣờng trộn Glibenclamid và GB giải
biểu hoàn trộn Paracetamol [6].

-

Một số đông dƣợc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ dƣợc liệu trộn hoạt

chất tăng cƣờng khả năng sinh lý: viên nang Supai 99 Tongkat Ali plusdo
Malaysia sản xuất, công ty TNHH Giai Cảnh nhập khẩu có chứa
Noracetildenafil; viên nang Mãnh Nam do công ty TNHH Dƣợc phẩm Ngọc
Khánh (địa chỉ: xã Nam Hồng, Đông Anh, Hà Nội) sản xuất có chứa
Acetyldenafil; viên nang Bổ Thận Hà Thành do công ty TNHH Hà Thành sản
xuất có chứa Sildenafil,... [6].

-

Một số thực phẩm chức năng giảm béo: viên nang Lishoudo Supersive sản xuất
bởi Baian (Hong Kong) và viên nang Phục Linh Juji do công ty Khoa học Kỹ
thuật Y Dƣợc Bách An (Trung Quốc) sản xuất có chứa Sibutramin.


5

-

Thuốc gia truyền Hou Li Bao dạng viên nang sản xuất tại Shen Loo She Sdn
Bhd, Penang, Malaysia, phân phối bởi Wai Kang Enterprise, Malaysia trộn
Furosemid, Piroxicam và Chlorpheniramin [15].

-

Ren Sem Tu Chon Chin Kuo Pill sản xuất tại nhà máy Lian He Drug, Quảng
Đông, Trung Quốc, trộn Dexamethasone and Chlorpheniramin [15].

-

Joint-Soft đƣợc đƣa vào Singapore qua đƣờng xách tay trộn Piroxicam,

Dexamethason [14].

-

Ke Bi Gu Tai Jiao Nang đƣợc đƣa vào Singapore qua đƣờng xách tay, trộn
Hydrochlorothiazid, Piroxicam và Prednison [14].

-

Pil Raja Urat Asli đƣợc bán trên mạng, trộn Piroxicam và Indomethacin [14].

-

Zhen Feng Da Brand Xi Tong Wan trộn Indomethacin do công ty TNHH An
Huy, Trung Quốc sản xuất [17].

-

HUO LUO JING DAN chứa Indomethacin, Dexamethason and Prednisolon sản
xuất bởi công ty Tian Jin Ren Ji Trung Quốc [16].

-

Meizitang Botanical Slimming 100% Natural Soft Gel do Trung Quốc sản xuất
đƣợc bán trên mạng chứa Diclofenac [13].

1.2.

Tổng quan về các chất nghiên cứu

1.2.1. Tổng quan về Piroxicam
1.2.1.1.

Công thức

-

Công thức cấu tạo:

-

Công thức phân tử: C15H13N3O4S. Khối lƣợng phân tử: 331,4.

-

Tên khoa học: 4- hydroxyl – 2 – methyl – N – (pyridine-2-yl) – 2H – 1,2
benzothiazin – 3 – carboxamid – 1,1 – dioxid [3], [25], [30].


6

1.2.1.2.

Tính chất vật lí

-

Hình thức: bột kết tinh màu vàng nhạt, vị đắng, không mùi.

-

Độ tan: rất ít tan trong nƣớc (0,015 mg/ml), trong dung dịch acid (0,023 mg/ml
ở pH 2,0) và trong một số dung môi hữu cơ, ít tan trong alcol và dung dịch kiềm
(1,03 mg/ml ở pH 7,5), tan trong dicloromethan [25], [30].

1.2.1.3.
-

Định tính

Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của Piroxicam
chuẩn [3].

-

Đo phổ hấp phụ tử ngoại: phổ tử ngoại của dung dịch chế phẩm 0.001% trong
hỗn hợp dung dịch acid hydrocloric 1 M – methanol cho cực đại hấp thụ ở bƣớc
sóng 334 nm và 242 nm, tỷ số giữa độ hấp thụ ở 334 nm và 242 nm từ 2,2 đến
2,5 [3].

1.2.1.4.

Định lƣợng

Định lƣợng bằng phƣơng pháp chuẩn độ trong môi trƣờng khan: hòa tan dƣợc
chất trong hỗn hợp đồng thể tích anhydric acetic và acid acetic, chuẩn độ bằng dung
dịch acid percloric 0,1 M [3].
1.2.1.5.

Tác dụng

Piroxicam là thuốc chống viêm không steroid (NSAID), thuộc nhóm oxicam.
Thuốc có tác dụng chống viêm, hạ sốt, giảm đau và chống kết tập tiểu cầu. Cơ chế
tác dụng của thuốc chƣa rõ ràng. Tuy nhiên có thể do ức chế tổng hợp prostaglandin
ở các mô cơ thể bằng cách ức chế cyclooxygenase. Piroxicam ức chế ít nhất 2
isozym là COX-1 (cyclooxygenase-1 còn gọi là PGHS-1) và COX-2
(cyclooxygenase-2 còn gọi là PGHS-2)[2].
1.2.1.6.
-

Chỉ định

Piroxicam không đƣợc xem là chỉ định đầu tiên khi có chỉ định dùng NSAID
[2].

-

Điều trị triệu chứng trong các trƣờng hợp sau:
 Viêm khớp dạng thấp, thoái hóa khớp.
 Viêm cột sống dính khớp, bệnh cơ xƣơng cấp và chấn thƣơng trong thể thao.


7

 Thống kinh và đau sau phẫu thuật.
 Bệnh gout cấp.
1.2.1.7.

Tác dụng không mong muốn

Piroxicam có hầu hết các tác dụng không mong muốn nhƣ các thuốc khác
trong nhóm NSAID [2]:
-

Trên tiêu hóa: viêm miệng, chán ăn, đau vùng thƣợng vị, buồn nôn, táo bón, đau
bụng, ỉa chảy, khó tiêu.

-

Tiết niệu: ức chế prostaglandin ở thận làm giảm tƣới máu đến thận, giảm mức
lọc cầu thận, giải phóng các renin, ảnh hƣởng tới việc di chuyển ion và trao đổi
nƣớc, gây nên các rối loạn chức năng tiểu cầu thận, viêm thận mô kẽ, suy thận
cấp.

-

Da: ngứa, phát ban.

-

Toàn thân: đau đầu, khó chịu.

-

Giác quan: ù tai.

-

Huyết học: giảm hồng cầu và hematocrit, thiếu máu, giảm bạch cầu, tăng bạch
cầu ƣa acid.

-

Trên hệ thần kinh: hoa mắt, chóng mặt, buồn ngủ.

-

Trên hệ tim mạch, hô hấp: phù.

1.2.1.8.

Liều dùng: 20 – 40 mg /lần/ngày [2].

1.2.2. Tổng quan về Indomethacin
1.2.2.1.

Công thức

-

Công thức cấu tạo:

-

Công thức phân tử: C19H16CINO4. Khối lƣợng phân tử: 357,8


8

-

Tên khoa học: acid 1 –(4-clorobenzoyl)-5-methoxy-2-methylindol-3-yl acetic
[3], [25], [30].

1.2.2.2.

Tính chất vật lí

-

Hình thức: bột kết tinh trắng đến vàng, không mùi hay hầu nhƣ không mùi.

-

Độ tan: không tan trong nƣớc, tan trong cloroform, hơi tan trong ethanol 96% và
ether [3].

1.2.2.3.
-

Định tính

Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của
Indomethacin chuẩn.

-

Đo phổ hấp phụ tử ngoại: phổ tử ngoại của dung dịch chế phẩm 0.0025% trong
hỗn hợp dung dịch acid hydrocloric 1 M – methanol (1:9), đƣợc đo trong khoảng
bƣớc sóng từ 300 đến 350 nm, cho một cực đại hấp thụ ở bƣớc sóng 318 nm. A

(1%, 1 cm) ở cực đại từ 170 đến 190.

-

Phản ứng với Fe3+ cho sản phẩm có màu hồng tím.

-

Điểm chảy 158 oC đến 162 oC [3].

1.2.2.4.

Định lƣợng

Định lƣợng bằng phƣơng pháp chuẩn độ trong môi trƣờng khan: hòa tan dƣợc
chất trong aceton, chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 N, chỉ thị
phenolphtalein [3].
1.2.2.5.

Tác dụng

Indomethacin là thuốc chống viêm không steroid (NSAID), dẫn xuất từ acid
indoacetic. Thuốc có tác dụng chống viêm, hạ sốt, giảm đau và chống kết tập tiểu
cầu [2].
Cơ chế tác dụng: chủ yếu thông qua ức chế enzym prostaglandin synthetase và
do đó ức chế tổng hợp prostaglandin, thromboxan và các sản phẩm khác của enzym
cyclooxygenase (COX). Tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu mất đi trong vòng 24 giờ
sau khi ngừng thuốc và thời gian chảy máu về mức ban đầu. Indomethacin ức chế
tổng hợp prostaglandin D2, E2 và I2 nên làm giảm tƣới máu tới thận [2].

9

1.2.2.6.
-

Chỉ định

Bệnh khớp do viêm nhƣ: viêm khớp dạng thấp, viêm cột sống dính khớp, hội
chứng Reiter.

-

Chỉ định tƣơng đối: điều trị tổn thƣơng xƣơng khớp trong các bệnh khác, tổn
thƣơng xƣơng khớp khi điều trị giai đoạn tăng viêm và đau các cơ do thấp,
nhƣng chỉ trong một thời gian ngắn.

-

Đau sau phẫu thuật.

-

Nhức đầu kiểu đau nửa đầu kịch phát kèm nhiều đợt đau hàng ngày ở vùng mắt,
trán và thái dƣơng ngày và đêm, kèm theo chảy nƣớc mắt, nƣớc mũi.

-

Cơn cấp bệnh gout.

-

Dùng trong sơ sinh: để đóng chứng còn ống động mạch ở trẻ đẻ non [2].

1.2.2.7.

Tác dụng không mong muốn

-

Toàn thân: nhức đầu, chóng mặt, mất ngủ, hạ kali, hạ glucose huyết.

-

Tiêu hóa: nôn, buồn nôn, đau vùng thƣợng vị, ỉa chảy, táo bón, chảy máu dạ
dày.

-

Thần kinh: trầm cảm, đau đầu đặc biệt là đau nhiều về buổi sáng kèm theo mạch
trán nổi lên, nôn và buồn nôn, run rẩy, co giật, chóng mặt [2].

1.2.2.8.
1.3.

Liều dùng: 25mg/lần, uống 2-3 lần/ngày, tối đa 150-200 mg/ngày [2].

Một số nghiên cứu xác định Piroxicam và Indomethacin trong nền mẫu

đông dƣợc

Qua một số tài liệu cho thấy đã có nhiều nghiên cứu xác định Piroxicam,
Indomethacin trong nền mẫu đông dƣợc trên thế giới và ở Việt Nam. Các nghiên
cứu đƣợc trình bày trong Bảng 1.1 và Bảng 1.2.


10

Bảng 1.1. Một số nghiên cứu xác định Piroxicam trong nền mẫu đông dƣợc
STT

Phƣơng pháp

1

TLC

Điều kiện phân tích

TLTK

 - Bản mỏng silica gel GF 254.

[32]

 - Dung môi triển khai: cloroform - methanol
(9:1).
 - Phát hiện vết: UV (254 nm).
 Với điều kiện này phát hiện đƣợc 4 chất là
Paracetamol,

Prednison,

mefenamic

và

Piroxicam. Piroxicam có Rf = 0,65
2

TLC

 - Bản mỏng silica gel GF 254.
-

[26]

- Dung môi khai triển: ethyl acetate : acid
acetic : nƣớc (100:22:26).

-

- Phát hiện vết: UV (254 nm) và thuốc thử
hiện màu Dragendorff.

3

UHPLC-MS-

- Cột XBridge BEH C18 (100 mm x 2,1 mm;

[29]

3,5 μm).
-

- Pha động: acetonitril/dung dịch acid formic
0.1% (tt/tt).

-

Với điều kiện này nghiên cứu đã xác định
đƣợc 12 loại thuốc tân dƣợc trộn trái phép
trong trà thảo dƣợc.

4

LC-MS/ TOF- - Cột C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm).
-

- Pha động: ACN : nƣớc (95:5,v/v).

-

- Nồng độ từ 50-500 µg/ml.

-

- LOD=10,4 µg/ml, LOQ=34,32 µg/ml.

[28]

11

Bảng 1.2. Một số nghiên cứu phát hiện Indomethacin trong nền mẫu đông dƣợc.
STT

Phƣơng pháp

1

LC-MS/MS

Điều kiện phân tích
- Cột C18 (100 × 2,1 mm, 1,7 µm).

TLTK
[18]

- Pha động: A (0,1% acid formic trong
nƣớc) và B (0,1% acid formic trong
acetonitrile).
- Tốc độ dòng 0,25 ml/phút.
- Thể tích tiêm: 5 µl.
2

HPTLC

-

- Bản mỏng silica gel GF 254.

-

- Dung môi khai triển: toluen : ethyl

[10]

acetate : acid acetic băng (5:2:0,1).
-

- Bƣớc sóng phát hiện: 254 nm, 366
nm.

3

HPLC

- Cột Nucleodur Sphinx RP (150 × 4,6

[31]

mm, 5µm).
- Pha động: A (acid acetic 0,1% và
nƣớc), B (acetonitril và acid acetic
0,1%).
- Detector (254 nm).
- Thể tích tiêm 5 µl.
- Tốc độ dòng 4,6 ml/phút.
4

LC-MS/MS

-

- Cột Superspher 100 RP-18 (125 mm
× 3 mm, 4 µm).

-

- Pha động: A (đệm amoni format pH
= 3 trong nƣớc) và B (acetonitril).

-

- Thể tích tiêm: 25 µl.

[11]


12

Tổng quan về phƣơng pháp dùng trong nghiên cứu

1.4.

1.4.1. Phƣơng pháp xử lí mẫu
Các thuốc đông dƣợc thƣờng là những thuốc có thành phần phức tạp, do đó để
phân tích các thuốc tân dƣợc trộn trái phép trong đông dƣợc thì việc xử lí mẫu, tách
chiết các chất cần quan tâm ra khỏi mẫu để định tính và định lƣợng là rất quan

trọng.
Haneef đã đƣa ra một số quy trình xử lý mẫu thuốc tân dƣợc chiết từ thuốc
đông dƣợc nhƣ sau:
-

Đối với dạng viên nén, viên nang, dung môi chiết hay sử dụng là methanol,

methanol : nƣớc (80:20), methanol : nƣớc : TFA (78:22:0,1), acetonitril : nƣớc
(1:1). Quy trình phân tích là đồng nhất mẫu, hòa trong 10ml dung dịch, siêu âm
trong khoảng 10 phút, ly tâm 20 phút, gạn dịch trong, pha loãng dịch sau đó tiến
hành phân tích [12].
-

Đối với dạng dung dịch, sử dụng dung môi chiết là methanol : nƣớc : TFA

(78:22:0.1). Quy trình tƣơng tự nhƣ với dạng thuốc rắn [12].
Theo Bogusz, quy trình xử lý mẫu đông dƣợc nhƣ sau: nghiền, làm đồng nhất
mẫu, hòa tan trong 10 ml methanol, ly tâm 3600 vòng trong 3 phút, gạn lấy 1 ml
dịch, tiếp tục ly tâm 1600 vòng trong 3 phút [11].
Đối với các chế phẩm trong thành phần có chứa đƣờng, mật ong hoặc chế
phẩm dạng dung dịch, sử dụng dicloromethan: isopropanol (9:1) để loại bớt
đƣờng [11].
Với chế phẩm đông dƣợc dạng viên nang: lấy 0,1 g bột chiết với 10 ml
methanol, siêu âm 10 phút, lọc, cô cắn, hòa tan cắn trong 1 ml methanol [26].
Tùy vào bản chất của chất cần phân tích mà ta lựa chọn dung môi chiết xuất,
xử lý mẫu cho phù hợp. Thông thƣờng lựa chọn dung môi chiết là methanol,
ethanol, dicloromethan, nƣớc. Có thể sử dụng 2 hay nhiều dung môi với tỉ lệ khác
nhau để đạt hiệu suất cao hơn.

13

1.4.2. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
1.4.2.1.

Nguyên tắc

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) (Thin Layer Chromatography) là một kỹ thuật phân
tích dùng để tách các chất trong hỗn hợp.
Phƣơng pháp SKLM bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng chất hấp phụ đƣợc
phủ trên một mặt phẳng trơ, pha động là chất lỏng gồm một hay nhiều dung môi
phối hợp với nhau, pha động chuyển động qua pha tĩnh dƣới tác dụng của lực mao
dẫn [1].
Các chất phân tích di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc theo bản chất
của chúng, đƣợc tách riêng và ở các vị trí khác nhau của bản mỏng. Sự tách các chất
khác nhau dựa trên tính chất phân cực của các thành phần trong dung dịch phân
tích. Cơ chế có thể là phân bố, hấp phụ, trao đổi ion, sàng lọc phân tử… hoặc phối
hợp nhiều cơ chế [1].
Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lƣu
giữ Rf. Trị số Rf đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của các chất phân
tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:
Rf = dR / dM
Trong đó: dR: khoảng cách từ điểm xuất phát từ tâm đến vết phân tích (cm).
dM: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (cm).
Rf: có giá trị dao động giữa 0 và 1.
1.4.2.2.

Pha tĩnh

Pha tĩnh của SKLM là các hạt có kích thƣớc 10 – 30 µm đƣợc rải đều và kết

dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vuông. Bản
mỏng có sẵn trên thị trƣờng có kích thƣớc khác nhau thƣờng 5 ÷ 20 cm, nhiều khi
có đƣa thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất
phân tích. Chất hấp phụ thƣờng dùng nhất là silica gel [1].


14

Bảng 1.3. Một số chất thƣờng dùng làm pha tĩnh cho SKLM
Pha tĩnh

Cơ chế sắc ký

Ứng dụng phân tích

Silica

Hấp thụ

Acid amin, hydrocarbon, alcaloid, vitamin

Dẫn chất siloxan

Phân bố

Các chất ít phân cực

Cellulose

Phân bố

Acid amin, carbohydrat, nucleotid

Alumina

Hấp thụ

Hydrocarbon, alcaloid, chất màu thực
phẩm, lipid

Cát biển

Phân bố

Đƣờng, acid béo

Cellulose trao

Trao đổi ion

Acid nucleic, nucleotid, ion kim loại,

đổi ion

halogenid

Gel sephadex

Loại cỡ

Polymer, protein, phức kim loại

Trong những chất làm pha tĩnh kể trên, phổ biến nhất là Silica (SiO2) và
Alumia (Al2O3) [1].
1.4.2.3.

Pha động

Pha động thay đổi tùy thuộc vào cơ chế sắc ký, có thể sử dụng một hoặc hỗn
hợp nhiều dung môi với tỷ lệ thích hợp. Tùy thuộc vào tính chất phân cực và ái lực
với pha tĩnh, ta lựa chọn dung môi phù hợp làm pha động khai triển. Muốn tách các
chất không hoặc ít phân cực phải dùng chất hấp phụ hoạt năng cao và dung môi
khai triển ít phân cực và ngƣợc lại.
Tuy nhiên, lựa chọn tối ƣu hóa sắc ký thƣờng dựa chủ yếu vào kinh nghiệm.
Sau đây là một số gợi ý chung nhất khi chọn pha động cho SKLM :
-

Dung môi cần có độ tinh khiết cao.

-

Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số Rf nằm trong khoảng 0,2 – 0,8
đạt độ phân giải cực trị.

-

Chất phân tích dạng ion hay phân cực đƣợc rửa giải tốt bằng dung môi phân cực
nhƣ hỗn hợp n-butanol – nƣớc. Thêm lƣợng nhỏ acid acetic hoặc amoniac vào
nƣớc sẽ làm tăng độ tan của base hoặc acid tƣơng ứng.

-

Khi dùng silica gel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha
động sẽ quyết định tốc độ di chuyển các chất phân tích và trị số Rf của chúng.


15

Nếu thêm một lƣợng nhỏ dung môi ít phân cực nhƣ ether ethylic vào dung môi
không phân cực nhƣ methylbenzen thì sẽ làm tăng đáng kể trị số Rf [1].
1.4.2.4.

Ứng dụng

SKLM đƣợc sử dụng phổ biến để nghiên cứu, sàng lọc trong phòng thí nghiệm hóa
học, hóa sinh hoặc lâm sàng với 3 mục đích sau:
a) Định tính
Thƣờng dựa vào trị số Rf và màu sắc vết của mẫu thử và chất chuẩn chạy sắc
ký trong cùng điều kiện, đôi khi do sắc ký liên tục không xác định đƣợc tuyến dung
môi pha động dùng hệ số lƣu giữ tƣơng đối Rf để đặc trƣng cho chât phân tích :
Rr =
dR,x: đƣờng đi của chất phân tích (cm)
dR,c: đƣờng đi của chất chuẩn (cm)
Rr càng gần 1 chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất.
b) Thử tinh khiết
SKLM dùng để kiểm tra mức độ tinh khiết của các hợp chất thể hiện ở các vết
lạ trên sắc ký đồ. Khi khai triển dung dịch mẫu với các hệ dung môi khác nhau
không phát hiện vết lạ ngoài vết chính, ta có thể kết luận chất chiết xuất là tinh khiết
[1].
c) Định lƣợng

Bằng cách chính xác hóa lƣợng mẫu đƣa lên bản mỏng có thể áp dụng SKLM
để định lƣợng, có 2 cách để định lƣợng các chất trong vết sắc ký [1]:
-

Định lƣợng sau khi tách các chất ra khỏi bản mỏng: Tách chiết chất phân tích
trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp. Sau khi làm sạch dịch chiết, định
lƣợng chất phân tích bằng một kỹ thuật thích hợp (phổ hấp thụ, huỳnh quang,
cực phổ…). Phƣơng pháp này hiện nay ít dùng vì nhiều trở ngại, mất thời gian.

-

Định lƣợng trực tiếp lên bản mỏng:

Đo diện tích hay cƣờng độ màu của vết sắc ký, hiện nay dùng 2 kỹ thuật:
 Densitometer: chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cƣờng độ hấp thụ hoặc
huỳnh quang.


16

 Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số: Quét bản mỏng với hệ thống phân tích
hình ảnh, nhất là camera kỹ thuật số có độ phân giải cao thể thu nhận hình ảnh
của vết sắc ký. Xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính.
1.4.2.5.

Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng

a) Ƣu điểm
-

Chi phí thiết bị đơn giản, không đòi hỏi nhiều thao tác quá khó nhƣ nhiều
phƣơng pháp khác mà vẫn cho độ chính xác có thể chấp nhận đƣợc.

-

Phát hiện đƣợc tất cả các chất kể cả những chất không di chuyển theo pha động
(nằm ở vị trí xuất phát).

-

Thực hiện tách dễ dàng các mẫu có nhiều thành phần: có thể thực hiện sắc ký
đồng thời 10 – 20 mẫu hoặc hơn, so sánh trực tiếp mẫu thử với mẫu chuẩn.

b) Nhƣợc điểm
-

Độ lặp lại của Rf thấp do thành phần pha động thay đổi khi tiến hành sắc ký đối
với dung môi dễ bay hơi.

-

Tăng giãn rộng pic do khuếch tán vì tốc độ dòng pha động thay đổi.


17

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
a) Hóa chất:

Cloroform, n-hexan, ethyl acetate, acid acetic băng, n-propanol, amoniac 25%,
ethanol, dicloromethan, methanol của Trung Quốc.
b) Chất chuẩn:
-

Piroxicam (99,21%): số lô SX: QT 017081114 do Viện kiểm nghiệm thuốc
Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.

-

Indomethacin (98,51%): số lô SX: QT077 040414 do Viện kiểm nghiệm thuốc
Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.

-

Paracetamol do Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng cung cấp.

-

Diclofenac Natri, Meloxicam, Ibuprofen, Aspirin (Viện kiểm nghiệm thuốc
Thành phố Hồ Chí Minh).

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
-

Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC CAMAG, CAT No 027.6200
(Thụy Sỹ).

-

Bản mỏng silica gel GF 254 của Merck (Đức).

-

Cân phân tích Mettler Toledo (d=0,1 mg) (Thụy Sỹ).

-

Máy ly tâm PLC-012 (Đài Loan).

-

Tủ sấy Wiseven WOF-105 (Hàn Quốc).

-

Máy siêu âm D-78224 Singen/Htw (Đức).

-

Máy lắc xoáy LABINCO BV L46.

-

Các dụng cụ thủy tinh.

2.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Dựa vào tình hình chế phẩm đông dƣợc bị trộn trái phép Piroxicam và
Indomethacin, đặc điểm của Piroxicam và Indomethacin, chọn các chế phẩm đông
dƣợc có công dụng chữa thấp khớp, chữa gout, giảm đau.