Xác định đồng thời độc tố vi nấm t 2 và HT 2 trong ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc bằng sắc ký lỏng khối phổi

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO THU LIÊN
MÃ SINH VIÊN: 1201313

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ĐỘC TỐ VI
NẤM T-2 VÀ HT-2 TRONG NGŨ CỐC
VÀ SẢN PHẨM NGŨ CỐC BẰNG SẮC
KÍ LỎNG KHỐI PHỔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
ĐÀO THU LIÊN
MÃ SINH VIÊN: 1201313

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ĐỘC TỐ VI
NẤM T-2 VÀ HT-2 TRONG NGŨ CỐC
VÀ SẢN PHẨM NGŨ CỐC BẰNG SẮC
KÍ LỎNG KHỐI PHỔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. Trần Nguyên Hà
Th.S Nguyễn Thị Hà Bình
Nơi thực hiện:
Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin được gửi lời biết ơn sâu sắc nhất đến các thầy cô giáo
TS. Trần Nguyên Hà, TS. Trần Cao Sơn và Th.S Nguyễn Thị Hà Bình đã
luôn luôn tận tâm hướng dẫn, động viên và giúp đỡ em trong quá trình học tập
nghiên cứu cũng như hoàn thành khóa luận này.
Em xin được gửi lời cảm ơn tới toàn thể các anh chị đang công tác tại
Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã hết lòng quan tâm,
giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành được khóa luận này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo
Trường Đại học Dược Hà Nội đặc biệt là các thầy cô giáo bộ môn Hóa phân
tích – độc chất đã cùng với tri thức và tâm huyết, truyền đạt cho em những
kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, cảm ơn những
người bạn, người anh, chị, em – những người luôn ở bên, quan tâm, giúp đỡ
động viên em vượt qua khó khăn trong cuộc sống và học tập, là động lực để
em học tập, rèn luyện và nghiên cứu tại Trường Đại học Dược Hà Nội.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Đào Thu Liên

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i

MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ .................................................. viii
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 2
1.1. Tổng quan về T-2, HT-2 ....................................................................... 2
1.1.1. Khái quát chung ............................................................................. 2
1.1.2. Cấu trúc, tính chất hóa lý, độ ổn định ............................................ 3
1.1.3. Độc tính .......................................................................................... 4
1.1.4. Các quy định về hàm lượng của T-2, HT-2 ...................................... 7
1.2. Tổng quan phương pháp xác định T-2, HT-2....................................... 9
1.2.1. Phương pháp chiết – làm sạch T-2 và HT-2 .................................. 9
1.2.1.1. Phương pháp chiết T-2 và HT-2 .............................................. 9
1.2.1.2. Phương pháp làm sạch T-2 và HT-2 ...................................... 10
1.2.2. Phương pháp phân tích T-2 và HT-2 ........................................... 12
1.2.2.1. Các phương pháp phổ biến để xác định T-2 và HT-2 ........... 12
1.2.2.2. Tổng quan tóm lược về sắc ký lỏng khối phổ........................ 16
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 18
2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 18
2.2. Nguyên vật liệu – trang thiết bị .......................................................... 18
ii


2.2.1. Nguyên vật liệu ............................................................................... 18
2.2.1.1. Chất chuẩn ................................................................................ 18
2.2.1.2. Hóa chất và dung môi ............................................................... 18
2.2.2. Trang thiết bị ................................................................................... 19
2.2.2.1. Thiết bị ...................................................................................... 19
2.2.2.2. Dụng cụ ..................................................................................... 19

2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 19
2.3.1. Khảo sát các điều kiện xác định độc tố T-2, HT-2 bằng LC-MS/MS
................................................................................................................... 19
2.3.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ................................................... 20
2.3.3. Thẩm định phương pháp ................................................................. 20
2.3.4. Đánh giá hàm lượng độc tố T-2 và HT-2 trên một số đối tượng ngũ
cốc và sản phẩm ngũ cốc .......................................................................... 20
2.4. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 20
2.4.1. Phương pháp lấy mẫu ..................................................................... 20
2.4.2. Phương pháp xử lý mẫu .................................................................. 21
2.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) .............. 21
2.4.4. Phương pháp thẩm định .................................................................. 22
2.4.4.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc ............................................................. 22
2.4.4.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng................................... 22
2.4.4.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn .......................................... 23
2.4.4.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ............................................................ 23
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................. 24
iii


Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................... 25
3.1. Tối ưu hóa điều kiện tách và xác định độc tố T-2 và HT-2 bằng LCMS/MS ......................................................................................................... 25
3.1.1. Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ.................................................. 25
3.1.1.1. Lựa chọn ion mẹ và ion con ..................................................... 25
3.1.1.2. Tối ưu hóa các điều kiện MS .................................................... 27
3.1.2. Lựa chọn các điều kiện sắc ký lỏng ................................................ 28
3.1.2.1. Chọn pha tĩnh ............................................................................ 28
3.1.2.2. Khảo sát thành phần pha động.................................................. 29
3.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ......................................................... 31
3.2.1. Chọn quy trình xử lý mẫu ............................................................... 31

3.2.2. Khảo sát dung môi chiết ................................................................. 32
3.2.3. Khảo sát dung môi chiết qua bước làm sạch .................................. 34
3.2.4. Đánh giá ảnh hưởng nền ................................................................. 36
3.3. Thẩm định phương pháp phân tích ....................................................... 38
3.3.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc ................................................................... 38
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ............. 40
3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ................................................ 42
3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ................................................................... 43
3.4. Kết quả xác định độc tố T-2 và HT-2 trong ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ
cốc ................................................................................................................ 45
3.5. Bàn luận ................................................................................................ 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 47
iv


Kết luận ........................................................................................................ 47
Kiến nghị ...................................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

v


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
AOAC
APCI
COMTAM
Panel
EFSA

ESI
FAO

GC
HPLC
JECFA
LC
LOAEL
LOD
LOQ
MS
NOAEL
R(%)
RSD(%)
SCF
SD
SPE
WHO

Tiếng anh

Tiếng việt

Association of Official
Analytical Communities
Atmospheric pressure
chemical ionization
The panel on contaminants
in the food chain
European food safety

authority
Electronspray ionization
Food and agriculture
organization of the united
nation
Gas chromatography
High performance liquid
chromatography
Joint Expert committee of
food additives
Liquid chromatography
Lowest observed adverse
affect level
Limit of detection
Limit of quantification
Mass spectrometry
No observed adverse affect
level
Recovery
Relative standard deviaton
Scientific committee for
food
Standard Deviation
Solid Phase Extraction
World health organization

Hiệp hội các nhà hóa phân tích
chính thức
Chế độ ion hóa hóa học ở áp suất
khí quyển

Hội đồng về chất ô nhiễm trong
chuỗi thực phẩm
Cơ quan an toàn thực phẩm Châu
Âu
Ion hóa phun điện tử
Tổ chức lương thực và nông
nghiệp Liên hiệp quốc

vi

Sắc ký khí
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Ủy ban chuyên gia Quốc tế về
phụ gia thực phẩm
Sắc ký lỏng
Mức tác hại thấp nhất quan sát
được
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Khối phổ
Mức tác hại không quan sát được
Hiệu suất thu hồi
Độ lệch chuẩn tương đối
Ủy ban khoa học về thực phẩm
Độ lệch chuẩn
Chiết pha rắn
Tổ chức y tế thế giới


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Tính chất hóa lý của T-2, HT-2 ........................................................ 4
Bảng 1.2. Giới hạn tối đa cho phép của Châu Âu đối với độc tố T-2 và HT-2
trong thực phẩm ................................................................................................ 7
Bảng 1.3. EFSA thống kê giá trị NOAELs và LOAELs của tổng hàm lượng T2 và HT-2 với chỉ số ước tính LB (giới hạn dưới), UB (giới hạn trên) của các
loài động vật khác nhau .................................................................................... 8
Bảng 1.4. Một số phương pháp chiết, làm sạch và phân tích T-2, HT-2 trong
các nền mẫu khác nhau ................................................................................... 13
Bảng 1.5. Một số những ưu nhược điểm của các phương pháp xác định T-2,
HT-2................................................................................................................. 14
Bảng 1.6. Một số phương pháp xác định T-2, HT-2 trong thực phẩm bằng LCMS/MS ............................................................................................................. 15
Bảng 2.1. Số điểm IP cho các kỹ thuật phân tích ........................................... 22
Bảng 3.1. Các điều kiện phân tích độc tố T-2 và HT-2 bằng ESI/MS/MS...... 25
Bảng 3.2. Các thông số tối ưu của MS để phân tích các độc tố T-2 và HT-2 28
Bảng 3.3. Khảo sát hệ dung môi pha động ..................................................... 29
Bảng 3.4. Chương trình gradient phân tích T-2, HT-2 ................................... 31
Bảng 3.5. Tỷ lệ ion của độc tố T-2 và HT-2 .................................................... 40
Bảng 3.6. LOD và LOQ của các độc tố T-2 và HT-2 ..................................... 41
Bảng 3.7. Đường chuẩn và hệ số tương quan tuyến tính của độc tố T-2 và
HT-2 trên nền mẫu ngô ................................................................................... 42
Bảng 3.8. Độ lặp lại và thu hồi của độc tố T-2 và HT-2 tại các nồng độ 50
µg/kg, 100 µg/kg, 200 µg/kg ........................................................................... 43
Bảng 3.9. Kết quả phân tích mẫu thực tế trên địa bàn Hà Nội ...................... 45

vii


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của T-2 (R1=OAc) và HT-2 (R1=OH). ............... 3
Hình 1.2. Mô hình hệ thống LC-MS/MS ......................................................... 16
Hình 1.3. Bộ phân tích khối ba tứ cực ............................................................ 17

Hình 3.1. Phổ khối MS của T-2 và HT-2 sau khi bắn phá ion ........................ 26
Hình 3.2. Sắc ký đồ của độc tố T-2 và HT-2 tại nồng độ chuẩn 100 ng/ml ... 30
Hình 3.3. Khảo sát ban đầu kỹ thuật chiết và làm sạch.................................. 32
Hình 3.4. Sắc ký đồ của độc tố T-2 và HT-2 với dung môi chiết là DM1 ...... 33
Hình 3.5. So sánh tỷ lệ dung môi chiết............................................................ 34
Hình 3.6. So sánh tỷ lệ dung môi chiết qua bước làm sạch ............................ 35
Hình 3.7. Sắc ký đồ của T-2 và HT-2 được chiết qua DM2 và được cho qua
cột MycoSep 227 ............................................................................................. 35
Hình 3.8. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu ngô đến tín hiệu của T-2, HT-2 36
Hình 3.9. Quy trình xử lý mẫu tối ưu .............................................................. 37
Hình 3.10. Sắc ký đồ độc tố T-2 ở mẫu trắng (đỗ), mẫu chuẩn trên dung môi
50 ng/mL và mẫu trắng (đỗ) thêm chuẩn 50 ng/mL dịch cuối........................ 38
Hình 3.11. Sắc ký đồ độc tố HT-2 ở mẫu trắng (đỗ), mẫu chuẩn trên dung môi
50 ng/mL và mẫu trắng (đỗ) thêm chuẩn 50 ng/mL dịch cuối........................ 39
Hình 3.12. Sắc đồ của độc tố T-2 và HT-2 tại LOD (3 µg/kg) ....................... 41
Hình 3.13. Đường chuẩn của T-2, HT-2 trên nền mẫu................................... 42
Hình 3.14. Sắc ký đồ độc tố T-2 trên các mẫu ngô và đỗ thêm chuẩn tại 50
µg/kg (n=6) ..................................................................................................... 44

viii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, với nền kinh tế ngày càng phát triển thì vấn đề an toàn vệ sinh
thực phẩm ngày càng nhận được sự quan tâm của xã hội và các cơ quan quản lý.
Thời tiết ẩm ướt và mát mẻ ở một số nước trên thế giới là điều kiện thuận lợi cho
sự sinh sản và phát triển của loại nấm Fusarium (một trong những loại nấm sản
sinh ra độc tố vi nấm gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người và
động vật) [20]. Chính vì vậy, các cơ quan quản lý ngày càng đưa ra các yêu cầu
giám sát gắt gao hơn.

T-2, HT-2 là hai trong nhiều độc tố vi nấm được tổng hợp từ những loại nấm
Fusarium khác nhau [5],[20]. T-2, HT-2 có mặt trong nhiều sản phẩm thức ăn
chăn nuôi, thực phẩm dành cho con người đặc biệt là trong ngũ cốc [37],[38]. Từ
năm 2005-2010 trên 22 nước châu Âu, ước tính có khoảng 20519 kết quả T-2,
HT-2 có trong thức ăn chăn nuôi và ngũ cốc chưa qua chế biến làm ảnh hưởng
trực tiếp đến sức khỏe của người tiêu dùng. Nhiều nước trên thế giới (trong đó
không có Việt Nam) đã đưa ra giá trị MLs (giới hạn tối đa) của T-2, HT-2 trong
thực phẩm cho con người và thức ăn chăn nuôi. Do đó việc xác định T-2, HT-2
là nhu cầu cần thiết nhằm kiểm soát hàm lượng của 2 chất này trong thực phẩm
cho con người và thức ăn cho chăn nuôi gia súc, gia cầm [20].
Từ những vấn đề cấp bách trên, về mặt chuyên môn cần có các phương pháp
phân tích đáng tin cậy với độ nhạy phù hợp để kiểm soát được lượng T-2, HT-2
có trong các mẫu thực phẩm cần giám sát. Xuất phát từ nhu cầu thực tế và những
đặc tính ưu việt của kỹ thuật LC-MS/MS trong phân tích, chúng tôi đã tiến hành
đề tài: “Xác định đồng thời độc tố vi nấm T-2 và HT-2 trong ngũ cốc và sản
phẩm ngũ cốc bằng sắc ký lỏng khối phổ” với 2 mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định T-2, HT-2 trong ngũ
cốc và sản phẩm từ ngũ cốc bằng LC-MS/MS.
2. Áp dụng phương pháp trên để xác định hàm lượng T-2, HT-2 trong
một số mẫu ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc trên thị trường Hà Nội.

1


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về T-2, HT-2
1.1.1. Khái quát chung
Nấm mốc là tên chung cho các loại nấm tạo ra những sợi nấm và các bào
tử. Các bào tử vô cùng nhỏ này rất nhẹ và phát tán trong không khí. Chúng là
một phần tự nhiên trong môi trường của chúng ta và có ở khắp mọi nơi trong

không khí. Độc tố vi nấm là độc tố được sinh ra bởi nấm mốc gồm nhiều
nhóm khác nhau trong đó một số nhóm hay gặp như: aflatoxin, ochratoxin,
trichothecen… [39],[40].
T-2, HT-2 là các độc tố vi nấm có cấu trúc sesquiterpen, thuộc nhóm A
của trichothecen [7],[20]. T-2, HT-2 được tổng hợp từ nhiều loại nấm
Fusarium khác nhau như: F. sporotrichoides, F. poae, F. equiseti, F.
acumninatum, cụ thể từ những chi Myrothecium, Cephalosporum,
Verticimonosporum, Trichoderma, Trichothecium, và Stachybotry. Dưới điều
kiện mát mẻ và ẩm ướt Fusarium phát triển, làm hại vụ mùa và có thể sản sinh
ra độc tố T-2, HT-2 [8],[13],[20]. Nồng độ của T-2, HT-2 được tìm thấy cao
nhất là ở trong ngũ cốc, đáng kể là trong yến mạch và trong những sản phẩm
được làm từ yến mạch. Mà những sản phẩm này được phân bố rộng rãi trong
thức ăn cho con người, và thức ăn chăn nuôi [5],[7],[35]. T-2 nhanh chóng
chuyển hóa một phần lớn thành các chất khác và HT-2 là một chất chuyển hóa
chính của T-2 [14],[15],[20].
T-2, HT-2 gây độc tới phần lớn các loài động vật cũng như đối với con
người. Lợn là loài động vật nhạy cảm nhất [9],[15]. Đối với động vật nhai lại,
thỏ và cá đồng, việc phơi nhiễm những chất này có ảnh hưởng nghiêm trọng
tới sức khỏe, còn đối với mèo thì chưa có dữ liệu cụ thể nào cho là T-2, HT-2
nguy hại tới sức khỏe [15],[20].

2


1.1.2. Cấu trúc, tính chất hóa lý, độ ổn định
➢ Cấu trúc hóa học [7],[20],[43]:
T-2 và HT-2 là hai trong khoảng 180 trichothecen. Công thức cấu tạo của
các trichothechen có một số đặc điểm chung sau:
- Có vòng tetracyclic
- Có mặt các nhóm -OH, -OAc ở các vị trí thích hợp

- Được chia thành 4 nhóm (A-D) có cấu trúc hóa học khác nhau
- Có hệ thống vòng 12, 13 epoxy. Nhóm epoxid giữa C12 và C13 là nhóm
gây ra độc tính của trichothecen.
T-2 và HT-2 cũng có những đặc điểm chung như trên, tuy nhiên chúng
cũng có những đặc điểm riêng, cụ thể công thức như sau:

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của T-2 (R1=OAc) và HT-2 (R1=OH).
Công thức phân tử:
T-2: C24H34O9
HT-2: C22H32O8
Tên đầy đủ:
T-2: (3α,4β,8α)-12,13-epoxytrichothec-9-en-3,4,8,15-tetrol 4,15-diacetat 8-(3methylbutyrate).
HT-2: (3α,4β,8α)-12,13-epoxytrichothec-9-en-3,4,8,15-tetrol 15-acetate 8-(3methylbutyrate).
3


➢ Tính chất hóa lý [7],[20],[43]:
Với cấu trúc hóa học như trên nên T-2, HT-2 có những tính chất hóa lý
như sau:
Bảng 1.1. Tính chất hóa lý của T-2, HT-2
Tính chất hóa lý
Khối lượng phân tử

T-2

HT-2

466,5 g/mol

424,5 g/mol

Nhiệt độ nóng chảy

151-152ºC
[α]26D = +15º

Góc quay cực

- Tan tốt nhất trong một số dung môi hữu cơ:

Tính tan

methanol, ethanol, aceton, chloroform, ethyl acetat,
diethy ether và acetonitril
- Kém tan trong nước
Bay hơi

Là những hợp chất khó bay hơi

Các nhóm epoxide ở vị trí C12, 13 có khả năng chống lại tấn công ái nhân
➢ Độ ổn định [7],[20],[43]
- Ổn định trong pH acid và pH trung tính.
- Ổn định trong acetonitril và dưới áp suất chân không ít nhất là 24 tháng
ở nhiệt độ 25°C.
- T-2 và HT-2 không ổn định trong ethyl acetate ở nhiệt độ lạnh.
- Trong dung dịch nước, cả T-2 và HT-2 ổn định trong một phạm vi pH
sinh lý (7,35-7,45) với thời gian bán hủy ước tính tương ứng là 3,9 và
8,5 năm.
1.1.3. Độc tính
➢ Động học

4


Theo JECFA (FAO/WHO/2001) chưa có thông tin nào về động học của
T-2, HT-2 trên người, mà chỉ có thông tin cụ thể về động học của T-2, HT-2
trên động vật thí nghiệm cụ thể là chuột [20].
• Hấp thu
Ở loài gặm nhấm T-2 được hấp thu nhanh khi qua đường tiêu hóa và
đường hô hấp. Hàm lượng phóng xạ trong huyết tương sau khi uống độc tố
HT-2 đối với chuột đạt đỉnh điểm sau 30 phút. T-2 được chuyển hóa nhanh
chóng và đào thải qua phân và nước tiểu [14],[42].
• Phân bố
Sau khi uống độc tố T-2, T-2 được phân bố nhanh chóng đến gan, thận và
các cơ quan khác mà không có bất kỳ sự tích lũy riêng. T-2 cũng có thể đi qua
được hàng rào nhau thai [14],[42].
• Chuyển hóa
T-2 được chuyển hóa chủ yếu ở ruột và ở gan. Ở loài gặm nhấm T-2 được
chuyển hóa nhanh chóng thành một loạt các hợp chất khác nhau, một trong
những chất chuyển hóa chính là HT-2. Quá trình chuyển hóa của T-2 bao gồm
các quá trình deacetyl, acetyl hóa, hydroxy hóa, de-epoxy và kết hợp với
glucuronide, trong đó quá trình de-epoxy làm giảm độc tính của T-2 [14],[42].
• Thải trừ
T-2 và các chất chuyển hóa của nó được bài tiết qua nước tiểu và mật,
nhưng tỷ lệ qua nước tiểu và phân phụ thuộc vào từng loài. Độc tố T-2 nhanh
chóng được đào thải qua phân và nước tiểu với tỷ lệ 4-5:1 ở chuột nhắt và
chuột cống [14],[42].
➢ Độc tính
Có rất nhiều thông tin, dữ liệu về độc tính của T-2 trên người cũng như
động vật [20]:

- T-2 ức chế quá trình tổng hợp protein, ARN và ADN [9].
5


- Gần đây có dữ liệu chỉ ra rằng T-2 gây ra hiện tượng apoptosis là hiện
tượng tế bào tự chết. T-2 còn gây hoại tử tế bào cũng như peoxy hóa lipid ảnh
hưởng đến tính nguyên vẹn của màng tế bào [10].
- T-2 gây độc trên gan, độc trên tủy xương, làm giảm sản xuất và phát triển
các tế bào máu [9].
- Các cuộc điều tra đã công bố cho thấy lợn là một trong những động vật
nhạy cảm nhất đối với ảnh hưởng của độc tố T-2, đặc biệt là chỉ với liều 29
µg/kg cân nặng/ngày có thể gây ảnh hưởng đến huyết học và miễn dịch ở lợn
[15].
- Theo đánh giá của SCF năm 2001, không có bằng chứng nào cho thấy
các tác động độc hại khác trên da, trên sinh sản, phát triển và trên thần kinh
xuất hiện ở liều thấp hơn liều gây ảnh hưởng đến huyết học và miễn dịch ở
lợn [15].
- Mặc dù mèo cũng rất nhạy cảm với T-2, nhưng chúng có khả năng
chuyển hóa T-2 thành dạng kết hợp glucuronide phân cực dễ dàng thải trừ qua
nước tiểu. Quá trình chuyển hóa ở mèo khác với quá trình chuyển hóa ở
người, nên những cơ sở cho mèo là ko thích hợp để áp dụng trong việc đánh
giá nguy cơ của T-2 đối với người [15].
- SCF đã đưa ra ảnh hưởng tích cực của độc tố T-2 gây ung thư trong
invitro và invivo đối với loài gặp nhấm, thông thường gây đột biến nhiễm sắc
thể, ảnh hưởng này xảy ra chủ yếu ở nồng độ gây ức chế tổng hợp protein và
ADN [34].
Tính đến thời điểm hiện nay, có rất ít thông tin về độc tính riêng của HT2 trên người và trên động vật. Tuy nhiên, có một vài dữ liệu chỉ ra rằng độc tố
T-2 và HT-2 gây ra những ảnh hưởng bất lợi tương tự nhau [5].

6

1.1.4. Các quy định về hàm lượng của T-2, HT-2
Theo COMTAM Panel qui định về tổng hàm lượng của T-2 và HT-2 như
sau:
➢ Đối với con người [20]
• Trẻ từ 12 tháng đến 36 tháng có giới hạn trên và dưới 12-43 ng/kg cân
nặng/ngày đối với người có khả năng tiêu thụ trung bình.
• Người trưởng thành: người có khả năng tiêu thụ trung bình có giới hạn
trên và dưới 3,4-18 ng/kg cân nặng/ngày. Người có khả năng tiêu thụ
cao có giới hạn trên và dưới 7,2-39 ng/kg cân nặng/ngày.
• Người già: Hàm lượng quy định thấp hơn so với người trưởng thành.
➢ Đối với động vật
Trong các loài động vật giới hạn trên (UB) của tổng hàm lượng T-2 và
HT-2 trong thức ăn cho dê là cao nhất 3,3 µg/kg cân nặng/ngày, thấp nhất là
thức ăn cho cá 0,19 µg/kg cân nặng/ngày.
Hiện tại, Việt Nam chưa đưa ra quy định giới hạn tối đa cho phép của độc
tố T-2 và HT-2 trong thực phẩm. Theo EC 1881/2006 giới hạn tối đa cho
phép của T-2 và HT-2 đã được thiết lập (bảng 1.2) và EFSA đã thống kê giá
trị NOAELs và LOAELs của tổng hàm lượng T-2 và HT-2 với chỉ số ước tính
LB (giới hạn dưới), UB (giới hạn trên) của các loài động vật khác nhau theo
bảng 1.3.
Bảng 1.2. Giới hạn tối đa cho phép của Châu Âu đối với độc tố T-2 và HT-2
trong thực phẩm
Sản phẩm thực phẩm
Ngũ cốc (làm thực phẩm)

Tổng T-2 và HT-2 (µg/kg)
Yến mạch: 200
Ngô: 100

Loại khác: 50
25
15

Bánh từ ngũ cốc
Sản phẩm ngũ cốc cho trẻ nhỏ
7


Bảng 1.3. EFSA thống kê giá trị NOAELs và LOAELs của tổng hàm lượng T2 và HT-2 với chỉ số ước tính LB (giới hạn dưới), UB (giới hạn trên) của các
loài động vật khác nhau [20]
Loại
động vật

NOAEL
LOAEL
(µg/kg cân (µg/kg cân
nặng/ngày) nặng/ngày)

Động vật
nhai lại :
Bò sữa
Bê
Cừu
Dê

-

300
-

Lợn
Lợn con

-

29

-

120
40
48

100

-

13

-

Gia cầm
Gà mái
đẻ
Gà lấy
thịt
Gà tây
Thỏ
Động vật

nuôi:
Mèo
Chó
Ngựa
Cá đồng

Loại
động vật
Động vật
nhai lại :
Bò sữa
Bê
Thịt bò
Cừu non
Sữa dê
Dê
Lợn
Lợn con
Lợn
trưởng
thành
Gia cầm
Gà mái đẻ
Gà lấy thịt
Gà tây

Thỏ
Động vật
nuôi:
Mèo

Chó
Ngựa
Cá đồng

8

LB
UB
(µg/kg
(µg/kg cân
cân nặng/
nặng/
ngày)
ngày)

0,16
0,06
0,26
2,7
0,91

1,7
0,11
0,51
3,3
1,2

0,27
0,28

1,3
0,87

0,49
0,95
0,27

1,6
1,8
0,95

0,98

1,7

0,2
0,23
1,1
0,09

0,34
0,38
1,2
0,19


1.2.

Tổng quan phương pháp xác định T-2, HT-2

1.2.1. Phương pháp chiết – làm sạch T-2 và HT-2
Mẫu trước khi được đem đi phân tích và phát hiện bằng detector phù hợp
sẽ được chiết và làm sạch bằng những phương pháp thích hợp.
1.2.1.1. Phương pháp chiết T-2 và HT-2
Mục đích của quy trình chiết là đưa được tối đa lượng chất cần phân tích
từ nền mẫu ngũ cốc vào dung môi để thích hợp làm các bước tiếp theo. Hợp
chất sẽ được phân bố ở pha lỏng và được đưa ra khỏi pha rắn của nền mẫu
[5]. Hiệu quả quy trình chiết sẽ được đánh giá bởi hiệu suất thu hồi. Hầu hết
các phương pháp được sử dụng cho việc xác định T-2 và HT-2 phải qua bước
chiết và làm sạch thích hợp trừ phương pháp ELISA, có thể không yêu cầu
phải qua bước làm sạch. Những bước này vô cùng quan trọng vì nó ảnh
hưởng đến lựa chọn quy trình xác định hai chất này. Việc lựa chọn phương
pháp chiết phụ thuộc vào cấu trúc của độc tố cần phân tích, còn việc lựa chọn
dung môi chiết phụ thuộc vào nền mẫu [11].
Theo những nghiên cứu trước đây, dung môi chiết hay dùng nhất thường
là hỗn hợp methanol/nước và acetonitril/nước; aceton và ethyl acetat/
acetonitril/nước thường ít dùng hơn. Tỷ lệ hỗn hợp dung môi chiết
acetonitril/nước thường dùng trong những nghiên cứu gần đây là 84/16
[20],[40]. Mặc dù T-2, HT-2 không tan trong nước, nhưng nước làm các hạt
trương nở, giúp giải phóng ra T-2 và HT-2, như vậy cải thiện được hiệu quả
chiết. Trong quá trình chiết thường sử dụng nước khử ion hoặc nước cất làm
tăng độ phân cực, làm các chất gây trở ngại không bị chiết theo, dẫn đến kết
quả tin cậy và chính xác hơn. Do đó, tối ưu hóa dung môi để cải thiện độ thu
hồi của những phương pháp này trong các nghiên cứu là vấn đề khá quan
trọng [40].

9


Sử dụng những kỹ thuật cơ học đa dạng như lắc, trộn để mẫu và dung

môi chiết được trộn lẫn. Trong suốt quy trình chiết phải kiểm soát những kỹ
thuật này. Nhìn chung, lắc khoảng 60-90 phút, trộn với tốc độ trung bình
khoảng 3-5 phút, trộn với tốc độ cao (sử dụng máy trộn Ultra Turrax) trộn
khoảng 1 phút. Sau đó dung môi chiết thường được lọc qua màng lọc
cellulose trước khi chuyển sang bước tiếp theo [5].
1.2.1.2. Phương pháp làm sạch T-2 và HT-2
Bước làm sạch là yêu cầu chung cho nhiều phương pháp phân tích. Hơn
nữa, để cải thiện khả năng xác nhận của phương pháp phân tích, bước làm
sạch lại càng trở nên cần thiết hơn. Hiện nay có nhiều phương pháp làm sạch
khác nhau, trong số đó có một số phương pháp hay sử dụng như: sử dụng cột
chiết pha rắn, cột đa nhóm chức, cột ái lực miễn dịch hay dùng phương pháp
QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) [40].
Hiện nay, phương pháp chiết pha rắn là phương pháp làm sạch phổ biến.
Cột SPE thường có nền là silica xốp, bề mặt của nó sẽ hấp thu chọn lọc chất
phân tích và cả tạp chấp khác. Mẫu sau chiết sau đó cho qua cột SPE, chất
phân tích sẽ được giữ lại trong cột, các tạp bẩn sẽ được qua cột bằng dung
môi rửa tạp. Sau đó chất phân tích được đi qua khỏi cột bằng dung môi rửa
giải. Phần lớn các trường hợp dung môi rửa giải sẽ được bốc hơi tới khô và
được hòa tan trong một dung môi cụ thể khác hoặc đệm phụ thuộc vào công
nghệ phân tích đang sử dụng [32]. Tuy nhiên mặt hạn chế việc sử dụng cột
SPE là T-2 và HT-2 có độ phân cực và khả năng hòa tan khác nhau, nên nếu
sử dụng phương pháp này có thể ảnh hưởng đến độ thu hồi của 2 chất không
ổn định và thấp [36].
Gần đây, để khắc phục hạn chế trên người ta thường sử dụng cột
MycoSep để làm sạch dịch chiết [5],[40]. Ngoài ra dùng cột MycoSep còn
làm giảm chi phí, thực hiện nhanh hơn và đơn giản hơn dùng cột chiết pha
10


rắn. Những cột này bao gồm những chất hấp thụ khác nhau (ví dụ: than chì,

nhựa trao đổi ion,…). Thường sử dụng 3 loại cột MycoSep để làm sạch:
MycoSep/MultiSep 227 Trich, MycoSep/MultiSep 225 Trich và MycoSep
113 Trich. Dựa vào loại mẫu phân tích, lượng dịch chiết mà ta có thể chọn
loại cột MycoSep phù hợp. MycoSep/MultiSep 227 Trich được dùng trong
trường hợp mẫu phức tạp, MycoSep/MultiSep 225 Trich được dùng cho nền
mẫu là các hạt, các mẫu đơn giản, MycoSep 113 Trich được dùng trong
trường hợp quá trình phân tích yêu cầu lượng dịch chiết ít. Như vậy trong 3
loại cột, để làm sạch độc tố T-2 và HT-2 dùng loại cột MycoSep/MultiSep
227 Trich [5].
Phương pháp làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch (IAC) cũng là 1 trong
những phương pháp hay dùng hiện nay. Cơ chế của phương pháp này là:
kháng thể gắn với chất bổ trợ để tạo liên kết đặc trưng với chất phân tích,
trong khi tạp bẩn của mẫu đi qua cột, sau đó chất phân tích ra khỏi cột nhờ
một dung môi làm biến tính kháng thể [36]. Hiện nay đã có một vài loại cột ái
lực miễn dịch thương mại để làm sạch mẫu dùng để phân tích độc tố T-2 và
HT-2. Sử dụng cột ái lực miễn dịch đạt hiệu quả cao trong việc loại bỏ tạp
bẩn nên độ thu hồi và chọn lọc cao, hơn nữa còn thích hợp trong trường hợp
phân tích nhiều chất trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, dùng phương pháp
này có thể gây phản ứng chéo giữa chất phân tích với những trichothecen
khác, thành phần nền mẫu và chất bổ trợ pha rắn. Giá thành của cột chiết pha
rắn dùng cho T-2 và HT-2 cao hơn so với cột SPE [32].
Gần đây, ngoài sử dụng các phương pháp làm sạch trên, phương pháp
QuEChERS cũng là công nghệ rất hay được sử dụng, phương pháp này là sự
tích hợp giữa bước chiết và làm sạch. Quy trình chiết T-2 và HT-2 dễ dàng,
rẻ, nhanh, hiệu quả và an toàn. Dịch chiết được làm sạch bằng cách sử dụng
C18. Phương pháp này có thể tạo được độ thu hồi từ 60%-135% và độ lặp lại
11


tốt từ 9-21% nhưng một vài nghiên cứu cho rằng độ thu hồi của phương pháp

này thấp hơn so với SPE do ảnh hưởng của nền mẫu cao [5].
Mỗi phương pháp có những mặt thuận lợi và hạn chế riêng. Tuy nhiên,
qua các nghiên cứu các phương pháp làm sạch độc tố T-2 và HT-2 thích hợp
nhất là phương pháp chiết bằng cột đa nhóm chức cụ thể là cột MycoSep 227
cho hiệu quả cao, đơn giản và phù hợp với điều kiện kinh tế.
1.2.2. Phương pháp phân tích T-2 và HT-2
1.2.2.1. Các phương pháp phổ biến để xác định T-2 và HT-2
Việc phân tích hai độc tố T-2, HT-2 trong ngũ cốc và những sản phẩm từ
ngũ cốc ngày càng được quan tâm và được nghiên cứu sâu rộng [20]. Vì thế
lựa chọn phương pháp có độ tin cậy, độ chính xác và độ nhạy cao đối với việc
xác định T-2, HT-2 là vấn đề khá quan trọng. Có rất nhiều phương pháp để
xác định 2 chất này. Hiện nay, người ta thường sử dụng 2 phương pháp sau để
xác định T-2, HT-2 [21],[25]:
- Phương pháp sắc ký gồm sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng (LC) với các
detector khác nhau.
- Phương pháp miễn dịch học.
Bảng 1.4 giới thiệu tóm tắt một số phương pháp chiết, làm sạch và phân
tích T-2 và HT-2 trong các nền mẫu khác nhau:

12


Bảng 1.4. Một số phương pháp chiết, làm sạch và phân tích T-2, HT-2 trong
các nền mẫu khác nhau
Nền mẫu

Dung
môi
chiết

Làm
sạch

Gạo, lúa
mì, yến
mạch

MeOH- Cột ái
H2O
lực
miễn
dịch

Ngũ cốc
lên men
rượu

ACNH2O

Lúa mì,
ngô, lúa
mạch

Cột ái
lực
miễn
dịch,
cột đa
nhóm
chức

MeOH- Cột ái
H2O
lực
miễn
dịch
MeOH- Cột ái
H2O
lực
miễn
dịch

Phương Chất
pháp
phân
phân
tích
tích
GC-ECD T-2,
HT-2

GCDON,
ECD,
T-2,
GC- MS, HT-2
LC-DAD

HPLCFLD

T-2,
HT-2

Kết quả

LOD: 1,7-2,3
µg/kg
LOQ: 5,4-6,6
µg/kg
R(%): 71-116
LOQ: 0,1-1,4
µg/kg
R(%): 70-130

Tài liệu
tham
khảo

[24]

[11]

LOD: 3-5
µg/kg
R(%): 70-103

[41]

Ngũ cốc,
HPLCT-2,
LOQ: 8 µg/kg
ngũ cốc

FLD
HT-2 R(%): 74-120
ăn sáng,
[36]
thực
phẩm cho
trẻ sơ sinh
Lúa
MeOH- Không ELISA
T-2,
LOQ: 25
mạch,
H2O
HT-2 µg/kg
ngô, đậu
[29]
nành, lúa
mỳ
Mỗi kỹ thuật phân tính đều có những ưu nhược điểm nhất định. Ưu
nhược điểm của một số kỹ thuật ứng dụng trong phân tích T-2 và HT-2 được
tóm tắt trong bảng 1.5.

13


Bảng 1.5. Một số những ưu nhược điểm của các phương pháp xác định T-2,
HT-2 [39]
Phương
Ưu điểm
pháp

GC
Độ nhạy cao
Có thể chạy mẫu tự động

HPLC

LCMS
(/MS)

ELISA

Nhược điểm

Độ nhạy tốt
Độ đặc hiệu cao
Độ lặp lại tốt
Thời gian phân tích ngắn
Có thể tự động chạy mẫu
Phương pháp này phổ biến
trong các phòng thí nghiệm
Độ nhạy cao
Độ đặc hiệu cao
Cung cấp xác nhận
Có thể chạy mẫu tự động
Không yêu cầu dẫn xuất
Có thể không cần phải làm
sạch
Độ nhạy tốt
Thích hợp cho việc sàng lọc
Có thể phân tích nhiều mẫu

Không yêu cầu làm sạch
Thiết bị không đắt
Phương pháp sẵn có

Yêu cầu phải có dẫn xuất
Có sự ảnh hưởng của nền mẫu
Đáp ứng nhiễu
Độ lặp lại kém
Thiết bị đắt
Để thực hiện phương pháp này cần
những người có tay nghề cao
Có thể yêu cầu dẫn xuất
Yêu cầu phải làm sạch
Thiết bị đắt
Để thực hiện phương pháp này cần
những người có tay nghề cao

Để phân tích định lượng cần nội
chuẩn hoặc xây dựng đường chuẩn
trên nền mẫu
Thiết bị rất đắt
Để thực hiện phương pháp này cần
những người có tay nghề cao

Mất thời gian nuôi cấy vi khuẩn
Bán định lượng
Có thể gây phản ứng chéo
Vấn đề về nền mẫu
Có thể gây âm tính/ dương tính giả
Thường yêu cầu làm thêm phương

pháp xác nhận LC
Kỹ thuật LC-MS và LC-MS/MS với những ưu điểm nổi trội hơn các

phương pháp khác:
14


- Có độ nhạy cao, đặc biệt là sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)
rất phù hợp để phân tích các mẫu có hàm lượng độc tố ở mức thấp.
- Có khả năng tách các chất dựa theo m/z, do đó cùng với khả năng tách
các chất nhờ LC thì phương pháp này có khả năng phân tích đồng thời nhiều
chất trong cùng một lần chạy.
- Có tính chọn lọc cao, với khả năng xác định các chất dựa vào khối lượng
và cấu tạo của chất nên rất đặc trưng cho từng chất.
- Có khả năng phân tích được những chất không thể phân tích bằng sắc ký
khí, như các chất kém bay hơi, các chất không bền nhiệt.
Vì vậy kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để xác định T-2, HT-2 trong
các nền mẫu thực phẩm khác nhau. Bảng 1.6 giới thiệu một số phương pháp
xác định T-2, HT-2 trong thực phẩm bằng LC-MS/MS.
Bảng 1.6. Một số phương pháp xác định T-2, HT-2 trong thực phẩm bằng LCMS/MS
Nền
mẫu

Lúa
mì,
ngô
Ngô,
lúa
mạch
Ngô,

lúa
mì,
ngũ
cốc
Ngũ
cốc,
ngô,

Phương
Chất
pháp
phân
phân
tích
tích
(CH3)2CO- Không LCT-2,
AcOH-H2O
APPIHT-2
MS/MS
Dung môi
chiết

ACN-H2O

PBS-buffer

QuEChES
ASE

Làm

sạch

Cột đa
nhóm
chức
Cột ái
lực
miễn
dịch

LCAPCIMS/MS
LCAPCIMS/MS

Không LC-ESIMS/MS

15

T-2

T-2,
HT-2

T-2,
HT-2

Kết quả

LOD: 5-7
µg/kg
LOQ: 9-11

µg/kg
LOQ: 2-4
µg/kg
R(%): 99-100
LOD: 0,4-0,5
µg/kg
R(%): 61-97

LOQ: 5-125
µg/kg
R(%): 65-117

Tài
liệu
tham
khảo
[12]

[22]

[23]

[16]