Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính và định lượng orcinol o β d glucosid trong thân rễ cây sâm cau

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TỪ MINH THẢO
MÃ SINH VIÊN: 1201553

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG
PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG
ORCINOL-O-β-D-GLUCOSID TRONG
THÂN RỄ CÂY SÂM CAU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TỪ MINH THẢO
MÃ SINH VIÊN: 1201553

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG
PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG
ORCINOL-O-β-D-GLUCOSID TRONG
THÂN RỄ CÂY SÂM CAU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. Ths. Nguyễn Thị Thùy Linh
2. Ts. Nguyễn Thị Phƣơng
Nơi thực hiện:
Khoa Hóa phân tích tiêu chuẩn –

Viện Dƣợc liệu

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Nguyễn Thị Thùy Linh
(Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội) và T.S
Nguyễn Thị Phƣơng (Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) là
những người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo em, luôn góp ý và giúp đỡ em, đưa
ra những ý kiến quý báu để hoàn thiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Dược liệu và PGS.T.S.
Phƣơng Thiện Thƣơng đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để
em hoàn thành khóa luận đúng hạn.
Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích –
Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đặc biệt là anh Nguyễn Đình Quân và chị
Hoàng Thị Tuyết – là những người đã luôn theo sát, hướng dẫn cho em trong
suốt quá trình thực hiện đề tài.
Sau cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã
luôn ở bên cạnh ủng hộ, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên
cứu và hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này!
Hà Nội, ngày 11 tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Từ Minh Thảo


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................ 2
1.1. Tổng quan về sâm cau .......................................................................... 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố .......................................................... 2
1.1.2. Thành phần hóa học .......................................................................... 3
1.1.3. Tác dụng dược lý .............................................................................. 7
1.2. Tổng quan về chất orcinol-O-β-D-glucosid ........................................ 9
1.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất ........................................................... 9
1.2.2. Tác dụng dược lý ............................................................................ 10
1.2.3. Các phương pháp định tính, định lượng OG .................................. 11
1.3. Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký lỏng ........................................... 12
1.3.1. Tổng quan về sắc ký lớp mỏng ....................................................... 12
1.3.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................................ 13
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 18
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu .............................................. 18
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 18
2.1.2. Nguyên vật liệu – trang thiết bị ...................................................... 18
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................... 19
2.2.1. Định tính OG bằng sắc ký lớp mỏng .............................................. 19


2.2.2. Định lượng OG bằng HPLC ........................................................... 19
2.2.3. Ứng dụng phương pháp để xác định OG trong mẫu sâm cau thực 20
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................... 20
2.3.1. Phương pháp xử lý sơ bộ mẫu thử .................................................. 20
2.3.2. Định tính OG bằng sắc ký lớp mỏng .............................................. 20
2.3.3. Định lượng OG bằng HPLC ........................................................... 21
2.3.4. Ứng dụng phương pháp để xác định OG trong mẫu thực .............. 26

CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................... 27
3.1. Định tính OG bằng TLC .................................................................... 27
3.1.1. Khảo sát thuốc thử phát hiện vết .................................................... 27
3.1.2. Khảo sát hệ dung môi pha động: .................................................... 29
3.2. Định lƣợng OG bằng HPLC .............................................................. 30
3.2.1. Lựa chọn bước sóng phân tích: ....................................................... 30
3.2.2. Khảo sát thành phần pha động ........................................................ 31
3.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu.......................................................... 33
3.2.4. Thẩm định phương pháp định lượng .............................................. 36
3.3. Ứng dụng phƣơng pháp để xác định OG trong mẫu thực .............. 42
3.3.1. Định tính OG bằng sắc ký lớp mỏng .............................................. 43
3.3.2. Định lượng OG bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................ 44
3.4. Bàn luận ............................................................................................... 46
3.4.1. Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu sâm cau ở Việt
Nam ........................................................................................................... 46
3.4.2. Xây dựng phương pháp định tính ................................................... 46


3.4.3. Quy trình xử lý mẫu định lượng ..................................................... 47
3.4.4. Phương pháp định lượng................................................................. 48
3.4.5. Kết quả phân tích mẫu thân rễ sâm cau thực .................................. 48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học

Tên tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

Association of Official Analytical

Hiệp hội các nhà Hóa

Chemists

phân tích

DAD

Diod Array Detector

Detector mảng diod

DMSO

Dimethyl sulfoxide

EtOH

Ethanol

Ethanol

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng

chromatography

cao

AOAC

HPLC

Khối lượng/ khối lượng

kl/ kl
LOD

Limid of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limid of Qualification

Giới hạn định lượng

MeOH

Methanol

Methanol

MS

Mass Spectrometry

Phổ khối

OG

Orcinol glucoside

Orcinol glucosid

OM

Orcinol monohydrate

Orcinol monohydrat

RSD

Relative Standard Deviation

S/N

Signal/Noise

STT

Độ lệch chuẩn tương
đối
Tín hiệu/nhiễu đường
nền
Số thứ tự

TFA

Trifluoroacetic acid

Acid trifluoroacetic

TLC

Thin layer chromatography

Sắc ký bản mỏng

UV-VIS

Ultraviolet Visible

Phổ tử ngoại - khả kiến

v/v

Volume/volume

Thể tích/thể tích


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Các cực đại hấp thụ ......................................................................... 31
Bảng 3.2 Hàm lượng OG khi thay đổi phương pháp và thời gian chiết ......... 35
Bảng 3.3 Khảo sát số lần chiết ....................................................................... 35
Bảng 3.4 Khảo sát tính phù hợp hệ thống....................................................... 38
Bảng 3.5 Quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của OG .............................. 40
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại .............................................................. 41
Bảng 3.7 Kết quả độ thu hồi............................................................................ 42
Bảng 3.8 Kết quả định lượng OG trên một số mẫu thân rễ sâm cau thực ..... 45


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Phần trên mặt đất và thân rễ của cây sâm cau ................................. 2
Hình 3.1 Sắc ký đồ trước khi phun thuốc thử ................................................. 27
Hình 3.2 Khảo sát định tính trên 2 nhóm thuốc thử ....................................... 28
Hình 3.3 Khảo sát hệ dung môi TLC, quan sát ở ánh sáng thường ............... 29
Hình 3.4 Phổ hấp thụ UV của dung dịch OG trong MeOH............................ 30
Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha dộng......................................... 32
Hình 3.6 Khảo sát dung môi chiết................................................................... 34
Hình 3.7 Quy trình xử lý mẫu.......................................................................... 36
Hình 3.8 Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp ........................................ 37
Hình 3.9 Sắc ký đồ xác định LOQ, LOD......................................................... 39
Hình 3.10 Đường chuẩn của OG .................................................................... 40
Hình 3.11 Sắc ký đồ định tính OG trên các mẫu thân rễ sâm cau thực ......... 43
Hình 3.12 Sắc ký đồ phân tích mẫu thực ........................................................ 44

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sâm cau có tên khoa học là Curculigo orchioides Gaertn. thuộc họ Tỏi
voi lùn (Hypoxidaceae); bộ phận dùng làm thuốc là thân rễ. Sâm cau là một
trong những vị thuốc quý, các nghiên cứu đã công bố chỉ ra rất nhiều tác dụng
có lợi cho sức khỏe như: chống loãng xương; bảo vệ, chống độc cho gan; tăng
cường chức năng sinh lý; điều hòa miễn dịch; chống oxy hóa; kháng khuẩn;
chống tăng đường huyết…
Nhóm chất có hoạt tính sinh học chính trong loài C.orchioides là các
hợp chất phenolic glycosid và saponin. Orcinol-O-β-D-glucosid thuộc nhóm
hợp chất phenolic glycosid, có hàm lượng khá cao trong dược liệu sâm cau.
Chất này đã được chứng minh có tác dụng chống suy nhược, giảm căng thẳng
và chống oxy hóa, từ đó góp phần không nhỏ vào tác dụng điều trị của dược
liệu.
Hiện nay tại Việt Nam chưa có phương pháp để định tính nhanh các
hoạt chất chính trong dược liệu sâm cau cũng như xác định hàm lượng của
chúng, nên việc đánh giá chất lượng dược liệu sâm cau trên thị trường còn
gặp nhiều khó khăn, chất lượng của dược liệu chưa được đảm bảo. Việc phát
triển phương pháp phân tích hoạt chất chính nói chung và orcinol-O-β-Dglucosid nói riêng trong dược liệu sâm cau là vô cùng cần thiết. Xuất phát từ
nhu cầu thực tế, khóa luận “ Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp định tính
và định lƣợng orcinol-O-β-D-glucosid trong thân rễ cây sâm cau” được
thực hiện với các mục tiêu:
- Xây dựng phương pháp định tính nhanh và định lượng orcinol-O-β-Dglucosid trong thân rễ cây sâm cau.
- Áp dụng phương pháp phân tích trên các mẫu thân rễ cây sâm cau
thực.

1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về sâm cau
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Tên khoa học: Curculigo orchioides Gaertn., Hypoxidaceae.
Tên gọi khác: Ngải cau, tiên mao, cỏ nốc lan. Họ Tỏi voi lùn.
Cây thảo, sống lâu năm cao 30 cm hoặc hơn. Thân rễ hình trụ dài, dạng
củ to bằng ngón tay út, có rễ bên nhỏ. Lá mọc tụ hợp thành túm từ thân rễ,
xếp nếp như lá cau, hình mũi mác hẹp, dài 20 – 30 cm, rộng 2,5 – 3cm, gốc
thuôn, đầu nhọn, hai mặt nhẵn gần như cùng màu, gân song song, bẹ lá to và
dài, cuống lá dài khoảng 10 cm. Hoa màu vàng, mọc thành từng cụm 3 – 5,
không cuống trên một trục ngắn, nằm trong bẹ lá. Quả nang, thuôn dài 12 –
15 mm, hạt 1 – 4 phình ở đầu [1], [6], [7]. Bộ phận dùng: Thân rễ.
Phân bố: ở Việt Nam: Hà Nội (Chùa Hương, Ba Vì), Ninh Bình, Đà
Nẵng, Kon Tum, Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu. Còn có ở các nơi khác trên
thế giới như: Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Campuchia, Nhật Bản, Thái Lan,
Philippines, Malaysia, Indonexia, Papua New Guinea [7].

Hình 1.1. Phần trên mặt đất và thân rễ của cây sâm cau

2


1.1.2. Thành phần hóa học
Các kết quả nghiên cứu trên thế giới đã công bố và cho biết thành phần
hóa học chính và có tác dụng dược lý trong dược liệu sâm cau bao gồm: Hợp
chất phenolic glycosid, hợp chất aliphatic hydroxy-keton, saponin,
flavonoid, alcaloid. Ngoài những hợp chất trên, trong thân rễ cây còn chứa
các thành phần hóa học khác như glycosid, steroid, polysaccharid, đường tự
do như glucose, mannose, xylose; acid glucuronic; nhựa; tanin; chất béo;
chất nhầy [28].

Trong nghiên cứu của tác giả Nguyễn Bích Ngọc (2015) về loài sâm
cau thu hái ở Kon Tum, Tây Nguyên, kết quả định tính cho thấy thân rễ sâm
cau chứa hợp chất phenolic, saponin, alcaloid, phytosterol, đường khử tự do,
chất béo [2].
1.1.2.1. Hợp chất phenolic glycosid
Năm 1983, Michinor Kubo và cộng sự đã phân lập được từ thân rễ sâm
cau một phenolic glucosid mới đặt tên là curculigoside A (1) [15]. Năm
2006, ngoài hai hợp chất cũ là curculigoside A (1) và curculigoside B (2),
Josep Valls và cộng sự đã phân lập được hai benzylbenzoat mới là
curculigoside C (3) và curculigoside D (4) [40].

Hợp chất

R1

R2

R3

Tài liệu

Curculigosid A (1)

OCH3

H

OH

[2], [28], [49]

Curculigosid B (2)

OH

H

OH

[28], [49]

Curculigosid C (3)

OCH3

OH

OH

[17]

Curculigosid D (4)

OCH3

OH

H

[40], [49]

3


Trong nghiên cứu của Dall’Acqua (2009) đã phân lập và xác định được
cấu trúc hai hợp chất: curculigoside E (5) và orchioside D – đồng phân quang
học của crassifoside B (một hợp chất phenolic được tìm thấy trong thân rễ
loài Curculigo crassifolia) (6) [18].
Garg cùng cộng sự (1989) đã tìm ra hợp chất phenolic glycosid mới đặt
tên là corchioside A (7) [19]. Nghiên cứu của Zuo A.X. (2010) công bố phân
lập được các hợp chất phenolic glycosid là orcinoside A, B, C [50].

Hợp chất

R1

R2

R3

R4

Orcinoside A (8)

OH

CH3

O-Glc

CH3

Orcinoside B (9)

OH

CH3

CH3

O-Glc

Orcinoside C (10)

CH3

OH

CH3

O-Glc

Bên cạnh đó, nhiều hợp chất chlorophenolic glycosid đã được các nhà
khoa học Trung Quốc phân lập và xác định cấu trúc:

Khung chlorophenolic
Curculigine AI có khung chung là chlorophenolic, khác nhau ở gốc
đường tự do R1 với các nhóm R2, R3, R4 là các nhóm thế đơn giản (-CH3, OCH3, -OH, -Cl) [16], [49].

4

STT Hợp chất

R1

R2

R3

1

Curculigine G (11)

OCH3

Cl

H

2

Orcinoside H (12)

OCH3

H

H

3

Orcinol glucoside (13)

OH

H

H

4

Orcinol glucoside B (14)

OH

H

COCH3

Tài liệu

[44]

Hợp chất khác: Acid 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic (16) [45]

Acid 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic (16)
1.1.2.2. Hợp chất aliphatic hydroxy-keton
Các hợp chất aliphatic hydroxy-keton đã phân lập được:
STT

Hợp chất

Tài liệu

1

3-(2-methoxypropyl)-4-methylnonacosan-2-on (17)

[31]

2

4-acetyl-2-methoxy-5-methyltriacontan (18)

[29]

3

27-hydroxytriacontan-6-on (19)

[32]

4

23-hydroxytriacontan-2-on (20)

[32]

5

21-hydroxytetracontan-20-on (21)

[31]

6

Acid 4-methylheptadecanoic (22)

[31]

1.1.2.3. Hợp chất saponin
Năm 1992, nhóm nghiên cứu của Xu Junping và Xu Rensheng đã phân
lập được các saponin thuộc nhóm cycloartan trong thân rễ cây sâm cau. Các
hợp chất saponin ban đầu được xác định cấu trúc là curculigenin A, B, C
[48]. Sau đó 13 curculigosaponin được tìm ra và được ký hiệu từ A đến M,
5


trong đó curculigosaponin A  J đều mang khung chung của curculigenin
A; curculigosaponin K  M có phần genin là curculigenin B [46], [47].
Misra Triguna N., Singh Ram S. (1990) đã phân lập được curculigol từ
thân rễ loài C. orchioides Gaertn. Cấu trúc của hợp chất này được xác định
là: 24-methylcycloart-7-en-3β,20-diol.

Curculigenin B (24)

Curculigenin A (23)

Curculigenin C (25)

24-methylcycloart-7-en-3β,20-diol [6], [33]

1.1.2.4. Các hợp chất khác
Năm 1976, nhóm nghiêm cứu của Tiwari và Mirsa đã tìm ra hai hợp
chất flavonoid trong thân rễ cây sâm cau [39] là: 5,7-dimethoxmyricetin-3O-α-L-xylopyranosyl-(4-1)-β-D-glucopyranoside (26) và 3',4',5'-trimthoxy6,7-methylene dioxyflavone (27).
Rao và cộng sự (1978) phân lập được 1 alcaloid duy nhất là lycorin
(28) [38]. Ngoài ra đã phân lập được các hợp chất chứa nitơ từ thân rễ cây
sâm cau như: N,N,N’,N’-tetramethylsuccinamid (29), methyl-N-acetyl-N-

6


hydroxycarbamat (30), 3-acetyl-5-carbomethoxy-2,4,4,6-tetrahydro-1,2,3,5,6oxatetrazin (31).
Dịch chiết dầu từ thân rễ loài C. orchioides chứa nhiều acid béo gồm:
palmitic (32), oleic (33), linoleic (34), arachidic (35) và behenic acid (36)
[30]. Có 3 hợp chất steroid tìm được từ thân rễ C.orchioides là: sitosterol
(37) , stigmasterol (38) , yuccagenin (39) [28].
1.1.3. Tác dụng dược lý
1.1.3.1. Tác dụng chống oxy hóa
Nghiên cứu cho thấy dịch chiết methanol của thân rễ Curculigo
orchioide có hiệu quả rất tốt trong việc dọn các gốc tự do nhóm superoxid,
có tác dụng trung bình đối với các gốc tự do DPPH, nitric oxid và có tác
dụng ức chế quá trình peroxid lipid [11]. Theo Wu và cộng sự, các hợp chất
phenolic
glycosid là yếu tố chính tạo nên tác dụng chống oxy hóa của C. orchioides
[45].
1.1.3.2. Tác dụng chống loãng xương
Các thử nghiệm in vivo và in vitro đã chứng minh dịch chiết từ thân rễ
C. orchioides có tác dụng chống loãng xương. Cao ethanol nói chung và hợp

chất phenolic glycosid nói riêng kích thích sự tăng sinh nguyên bào xương
tạo cốt bào, thúc đẩy hoạt động của ALP, đồng thời làm giảm vùng tế bào
hủy xương tại hố tiêu xương [13].
1.1.3.3. Tác dụng bảo vệ, chống độc cho gan
Nhóm tác giả Rao và cộng sự (1996) cho rằng C. orchioides có tác
dụng chống viêm và bảo vệ gan là do sâm cau có tác dụng đối kháng với
một số chất gây độc cho gan như rifampicin [36], [37]. Thêm vào đó,

7


curculigenin A và curculigol đã được nghiên cứu và sàng lọc thấy chúng đối
kháng với độc tính trên gan của thioacetamid và galactosomin [15].
1.1.3.4. Tác dụng điều hòa miễn dịch
Nhóm nghiên cứu của Lakshmi và cộng sự đã quan sát thấy tác dụng
điều hòa miễn dịch rõ rệt của phân đoạn giàu glycosid tinh khiết trong cao
ethylacetat [25]. Các phenolic làm tăng hàm lượng kháng thể dịch thể [10].
Curculigosaponin kích thích sự tăng sinh của tế bào lympho lách trên chuột
nhắt trắng nhưng không có ảnh hưởng rõ rệt đến kháng thể [24], [49].
1.1.3.5. Hoạt tính tăng cường chức năng sinh lý
Cao ethanol của thân rễ C.orchioides có tác dụng kích thích sinh dục
đáng kể ở thỏ đực, làm tăng lượng glycogen, tăng độ ẩm ở tử cung của chuột
cái trưởng thành, tăng nồng độ hormon FSH, LH và hormon testosteron trên
chuột cống; tác dụng làm tăng số lần, tăng tần suất giao phối trên động vật
[42].
Điều này đã gợi ý cho các nhà nghiên cứu có thể dùng thân rễ sâm cau
như một vị thuốc để điều trị chứng rối loạn cương dương [14], [49].
1.1.3.6. Tác dụng ổn định tế bào mast, kháng histamin và chống hen
Dịch chiết cồn có tác dụng ức chế đáng kể quá trình mất hạt của tế bào
mast trên các tế bào mast thuộc màng bụng chuột đơn độc và cả trên chuột bị

quá mẫn do phơi nhiễm với hợp chất 48/80 [41]. Các nghiên cứu sâu hơn chỉ
ra rằng cao cồn của thân rễ C.orchioides có thể có tác dụng trong điều trị hen
[35].
1.1.3.7. Tác dụng khác
Dịch chiết dầu của thân rễ sâm cau có tác dụng kháng với các chủng vi
khuẩn Bacillus anthracis, B.subtilis, Salmonella pullorum, S.newport,
Staphylococcus aureus và một số chủng nấm [23]. Dịch chiết nước của C.
8


orchioides có tác dụng kháng một số chủng tụ cầu Gram (+) như: S.aureus,
S.epidermidis; các chủng Gram (-) như: E.coli, Pseudomonas aeruginosa,
S.typhimurium [34].
Cả cao nước và cao ethanol đều có tác dụng chống tăng đường huyết
trong điều kiện bình thường và trong điều kiện tăng đường huyết do alloxan
trên chuột [14].
Curculigoside làm tăng sự biểu hiện protein procolagen typ 1 và giảm
biểu hiện protein MMP-1 của các nguyên bào sợi da người, do vậy
curculigoside có thể hữu ích trong điều trị lão hóa da [26].
Một số nghiên cứu khác cho thấy sâm cau có thể được sử dụng như một
sản phẩm tự nhiên điều trị chứng giảm thính lực do tiếng ồn ở chuột [22].
1.2. Tổng quan về chất orcinol-O-β-D-glucosid
1.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất

Công thức cấu tạo: C13H18O7
- Tên khoa học (IUPAC): (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(hydroxymethyl)-6-(3hydroxy-5-methylphenoxy)oxane-3,4,5-triol.
- Tên gọi khác: 3-Hydroxy-5-methylphenyl β-D-glucopyranosid.
- Tính chất:
+ Trọng lượng phân tử: 286,28 g/mol.
+ Điểm sôi: 570.6±50.0 °C ở 760 mmHg.

+ Bột trắng ở nhiệt độ phòng; tan trong dung môi: hỗn hợp MeOH –
H2O, DMSO, MeOH nóng; khó tan trong dung môi: ether dầu hỏa,
chloroform.
9


+ Thuộc nhóm hợp chất phenolic glycosid, thể hiện tính chất hóa học
của nhóm OH phenol: pKa = 9,8; phản ứng với dung dịch FeCl3 tạo phức màu
tím; tác dụng với các chất oxy hóa tạo các hợp chất quinon có màu...
1.2.2. Tác dụng dược lý
Các kết quả đã công bố chỉ ra rằng orcinol-O-β-D-glucosid có tác dụng
chống suy nhược, giảm căng thẳng và chống oxy hóa.
1.2.2.1. Tác dụng chống suy nhược
Nghiên cứu của Jin-Fang Ge và các cộng sự (2014) trên mô hình chuột
suy nhược do bị căng thẳng trường diễn mức độ trung bình không đoán
trước trong 3 tuần liên tiếp (CUMS) cho kết quả: ocinol glucosid (OG) cải
thiện hành vi trầm cảm trên chuột CUMS bằng cách giảm tính hoạt động
mạnh của trục HPA và tăng biểu hiện của BDNF và ERK 1/ 2 phosphoryl
hóa ở vùng dưới đồi [20].
1.2.2.2. Tác dụng giảm căng thẳng
Năm 2014, Xiaohong Wang và các cộng sự đã làm một nghiên cứu về
tác dụng giảm căng thẳng trên chuột. Kết quả cho thấy: orcinol glucosid
(OG) và orcinol monohydrat (OM) là các tác nhân giảm căng thẳng không
gây hiệu ứng an thần, trên cơ sở đó có thể hướng đến khả năng cao dùng
chất này để điều trị chứng căng thẳng [43].
1.2.2.3. Tác dụng chống oxy hóa
Năm 2013, Xiu Liu và cộng sự đã chứng minh được tác dụng chống
oxy hóa của orcinol glucosid trong thân rễ loài C.orchioides [27].

10

1.2.3. Các phương pháp định tính, định lượng OG
Hiện nay các tài liệu dược điển: Việt Nam, Trung Quốc, Hong Kong,
chúng tôi nhận thấy chưa có tài liệu nào công bố bổ sung phương pháp định
tính và định lượng chất OG trong dược liệu sâm cau.
Trên thế giới đã có một số nghiên cứu định lượng các hợp chất
phenolic glycosid trong đó có OG:
* Phương pháp 1: HPLC – DAD [12]
- Xử lý mẫu: hòa tan trong MeOH, siêu âm, ly tâm
- Chất đối chiếu: Hỗn hợp 4 chất: OG; orcinol; acid 2,6-dimethoxybenzoic;
curculigosid.
- Điều kiện sắc ký:
+ Pha tĩnh: cột Alltima C18 ODS.
+ Pha động: Acetonitril (0,02% TFA) : H2O (0,05% TFA).
+ Detector: DAD.
- Kết quả: phép phân tích với OG
+ Thời gian lưu: 11,375 phút.
+ Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 13,463x – 44,257; R2 =0,9991.
+ LOD = 1,25 µg/ml, LOQ = 5,10 µg/ml.
+ Độ lặp lại trung bình = 1,73 mg/g, RSD = 2,40%.
+ Độ thu hồi trung bình = 102,82%, RSD = 2,66%.
* Phương pháp 2: UHPLC – ESI-Q-TOF/MS [21]
- Xử lý mẫu: chiết với EtOH dưới áp suất giảm ở 60oC.
- Chất đối chiếu: Hỗn hợp các chất phân lập được từ thân rễ cây sâm cau,
bao gồm các chất:
+ 5-hydroxymethylfurfural.
+ 2-hydroxy-5-(2-hydroxyethyl)phenyl-β-D-glucopyranosid.
+ anacardosid.
11

+ OG.
+ orcinol-1-O-β-D-apiofuranosyl-(1 → 6)-β-D-glucopyranosid.
+ 2,6-dimethoxybenzoic acid.
+ curculigosid.
+ curculigine A.
- Điều kiện sắc ký:
+ Pha tĩnh: cột Waters UHPLC Acquity HSS T3.
+ Pha động: Acetonitril: H2O (0,1% acid fomic).
+ Detector: MS-Q-TOF.
- Kết quả: phép phân tích với OG
+ Thời gian lưu: 4,633 phút
+ Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0032x - 60,632; R = 0,9993.
+ LOD = 0,25 μg. ml-1, LOQ = 0,5μg. ml-1.
+ Độ lặp lại có RSD = 1,78%.
+ Độ thu hồi trung bình: 104,8%, RSD = 1,6%.
Từ kết quả các nghiên cứu trên chúng tôi nhận định OG là một trong
những hợp chất chính trong thân rễ cây sâm cau, tuy nhiên tại thời điểm hiện
tại chưa có phương pháp phân tích riêng OG trong dược liệu quý này. Vì vậy
chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp định tính nhanh OG bằng sắc ký
lớp mỏng và định lượng OG bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao để tạo tiền đề
hướng tới đánh giá chất lượng sâm cau như việc phát hiện nhanh và chính xác
dược liệu giả, dược liệu kém chất lượng trên thị trường.
1.3. Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký lỏng
1.3.1. Tổng quan về sắc ký lớp mỏng
Quá trình tách bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên một
lớp mỏng gồm các hạt kích thước đồng nhất được kết dính trên một giá đỡ

12

bằng nhôm, thủy tinh hoặc chất dẻo. Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh. Các hạt
trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp thụ, trao
đổi ion… Pha động là hỗn hợp dung môi.
Loại bản mỏng có chất hấp phụ có thêm bột bó (thạch cao ngậm 1,5
H2O) là chất kết dính, có ký hiệu chữ G, nếu được trộn thêm chất chỉ thị
huỳnh quang ký hiệu chữ F (ví dụ: silica gel GF254).
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất là hệ số lưu giữ
Rf. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất
phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động.

Trong đó: dR, dM tương ứng là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm
vết phân tích và đến mức dung môi pha động (tính bằng cm).
1.3.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.3.2.1. Khái niệm chung
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở
của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh là các hạt chứa trong cột nhờ
dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao. Có 4 kỹ thuật HPLC cơ
bản: Sắc ký phân bố, hấp phụ, trao đổi ion và rây phân tử (loại cỡ).
* Dựa theo độ phân cực của pha động và pha tĩnh để phân loại sắc ký:
- Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động là dung môi ít phân
cực hơn. Chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên. Khi tăng độ phân cực
của pha động, thời gian lưu giảm dần.
- Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực
hơn.Chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên. Khi tăng độ phân cực của pha
động thì thời gian lưu tăng dần.

13

Trong phạm vi khóa luận này chúng tôi xin trình bày về sắc ký phân bố
pha đảo.
1.3.2.2. Một số thông số đặc trưng trong phân tích pic của HPLC
* Thời gian lưu tR:
Là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector.
Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, tR của mỗi chất là hằng định. Vì vậy
có thể dùng tR để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lưu càng lớn, chất tan càng bị lưu giữ mạnh, thời gian phân
tích kéo dài. Nếu tR quá nhỏ thì khả năng tách kém.
* Hệ số dung lượng k’:

Trong đó

tR, tM tương ứng là thời gian lưu của chất cần phân tích và

của chất không được lưu giữ.
Cần chọn cột, pha động sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu 1* Hệ số chọn lọc α:
Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng
hệ số chọn lọc α:
( R )B
( R )A

0
0

Quy ước: chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α > 1.
Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0
* Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N:

Hiệu lực cột được đo bằng thông số số đĩa lý thuyết N của cột:
( )
Trong đó

(

)

W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic

14


W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic
* Hệ số kéo đuôi As:

Trong đó

W: chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic.
a: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic

đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
Yêu cầu: As nằm trong khoảng 0,8 – 1,5.
* Hệ số bất đối AF
Để đánh giá tính bất đối xứng của pic người ta dùng hệ số bất đối:

Trong đó: b là nửa chiều rộng sau pic đo ở chiều cao bằng 1/10 chiều
cao pic, a là nửa chiều rộng trước pic đo ở chiều cao bằng 1/10 chiều cao pic.
* Độ phân giải RS: là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một
cột sắc ký (ví dụ A và B)

( )

Trong đó

( )

t(R)A; t(R)B: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B).
WA; WB: độ rộng pic đo ở các đáy pic

Yêu cầu: RS >1; giá trị tối ưu RS = 1,5.
1.3.2.3. Các phương pháp định lượng bằng HPLC
Nguyên tắc: nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện
tích pic. Có 4 phương pháp thường được sử dụng trong sắc ký: Phương pháp
chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn và phương
pháp chuẩn hóa diện tích. Trong phạm vi khóa luận này, tôi xin trình bày chi
tiết về phương pháp chuẩn ngoại.

15


Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó
cả mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. So
sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao)
pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ các chất cần phân tích trong mẫu thử.
Có 2 phương pháp là chuẩn hóa 1 điểm và chuẩn hóa nhiều điểm.
- Chuẩn hóa 1 điểm: Chọn nồng độ mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẫu thử.
Tính nồng độ mẫu thử theo công thức:

Trong đó

CX, CS tương ứng là nồng độ mẫu thử và mẫu chuẩn.
SX, SS tương ứng là diện tích của pic mẫu thử và mẫu

chuẩn.
- Chuẩn hóa nhiều điểm:
+ Chuẩn bị một dãy chuẩn với nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký.
Các đáp ứng thu được là các diện tích (hoặc chiều cao) của pic ở mỗi điểm
chuẩn.
+ Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích pic (hoặc chiều cao)
với nồng độ của chất chuẩn.
+ Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của
chất thử bằng cách: Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ
giữa diện tích (hoặc chiều cao) của pic với nồng độ của chất cần xác định.
Trong đó

y là diện tích pic
a là giao điểm của đường chuẩn với trục tung
b là độ dốc của đường chuẩn
CX là nồng độ của chất thử

16