Xác định hàm lượng cyanid trong thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ TÚ UYÊN
Mã sinh viên 1201689

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CYANID
TRONG THỦY SẢN BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI-2017


TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ TÚ UYÊN
MÃ SINH VIÊN 1201689

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CYANID
TRONG THUỶ SẢN BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Nguyên Hà
2. TS. Trần Cao Sơn
Nơi thực hiện:
Viện Kiểm nghiệm
an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng chân thành và sâu sắc tới
TS. Trần Nguyên Hà và TS. Trần Cao Sơn là những ngƣời thầy đã dìu dắt tôi từ
những ngày đầu tiên làm nghiên cứu khoa học và cũng là những ngƣời trực tiếp
định hƣớng, tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp này.
Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong Viện Kiểm nghiệm
an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, 65 Phạm Thận Duật - Hà Nội, đặc biệt là cán
bộ khoa Độc học - Dị nguyên đã tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ tôi trong thời gian
vừa qua.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, bộ môn, các phòng ban, các thầy cô
giáo và cán bộ nhân viên trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội - những ngƣời đã dạy bảo và
giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập tại trƣờng.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em
đã dành cho tôi những lời động viên quý báu trong suốt thời gian tôi hoàn thành
khoá luận này.
Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những tình cảm, sự quan tâm và
giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè đã dành cho tôi trong suốt thời gian học tập
và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 16 tháng 03 năm 2017
Sinh viên

Phan Thị Tú Uyên


MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH ................................................................................ 8
DANH MỤC BẢNG .............................................................................. 9

ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................ 1
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN ................................................................... 2
1.1 Thực trạng ô nhiễm môi trƣờng biển do nƣớc thải công nghiệp luyện
kim ...................................................................................................................... 2
1.2 Tổng quan về cyanid .................................................................................... 3
1.2.1 Các dạng tồn tại của cyanid ...................................................................... 3
1.2.2 Tính chất hóa học của cyanid.................................................................... 4
1.2.3 Nguồn phát sinh cyanid............................................................................. 5
1.2.4 Độc tính của cyanid................................................................................... 6
1.2.5 Ảnh hƣởng của cyanid đối với môi trƣờng biển ....................................... 7
1.3 Các phƣơng pháp xác định cyanid ............................................................... 8
1.3.1 Phƣơng pháp truyền thống ........................................................................ 8
1.3.2 Cảm biến sinh học ................................................................................... 10
1.3.3 Phƣơng pháp đo huỳnh quang................................................................. 11
1.3.4 Phƣơng pháp sắc ký................................................................................. 12
1.4 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................... 14
1.4.1 Nguyên tắc .............................................................................................. 14
1.4.2 Máy HPLC .............................................................................................. 15
CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 17
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................ 17


2.2 Nguyên vật liệu- trang thiết bị ................................................................... 17
2.2.1 Nguyên vật liệu ....................................................................................... 17
2.2.2 Dụng cụ ................................................................................................... 19
2.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 19
2.3.1 Khảo sát các điều kiện để xây dựng phƣơng pháp xác định cyanid
trong hải sản bằng HPLC ................................................................................ 19
2.3.2 Thẩm định phƣơng pháp đã xây dựng .................................................... 20
2.3.3 Ứng dụng phƣơng pháp .......................................................................... 20

2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................ 20
2.4.1 Phƣơng pháp thu thập và bảo quản mẫu ................................................. 20
2.4.2 Phƣơng pháp HPLC ................................................................................ 20
2.4.3 Phƣơng pháp xử lý mẫu .......................................................................... 21
2.4.4 Thẩm định phƣơng pháp ......................................................................... 22
2.4.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu....................................................................... 25
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................ 26
3.1. Khảo sát phƣơng pháp phân tích cyanid ................................................... 26
3.1.1. Thiết lập điều kiện sắc ký ...................................................................... 26
3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu ................................................................ 29
3.2 Thẩm định phƣơng pháp ............................................................................ 33
3.2.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc ........................................................................... 33
3.2.2 Tính thích hợp của hệ thống.................................................................... 34
3.2.3 Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn ........................................................ 35
3.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng ............................................. 35


3.2.5 Độ lặp lại và độ thu hồi ........................................................................... 37
3.3 Ứng dụng phƣơng pháp.............................................................................. 40
3.4 Bàn luận ...................................................................................................... 40
CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................ 41
4.1 Kết luận ...................................................................................................... 41
4.2 Kiến nghị .................................................................................................... 41


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AOAC

Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức (Association of
Official Analytical Communities)

APHA

Tổ chức sức khoẻ cộng đồng Mỹ (American Public Health
Association)

ATSRD

Hiệp hội về đăng kí các chất độc hại và bệnh dịch (Agency for
Toxic Substances and Disease Registry)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)

ATVSTP

An toàn vệ sinh thực phẩm

LCt50

Nồng độ sản phẩm và thời gian gây chết 50% nhóm cá thể tham gia
nghiên cứu (Lethal concentration-time, 50%)

LD50

Liều gây chết 50% cá thể tham gia nghiên cứu (Lethal Dose, 50%)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantification)

MeOH

Methanol

pKa

Hằng số điện ly acid

R

Hệ số hồi quy tuyến tính

RSD (%)

Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation)

SD

Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

TB

Trung bình

UV

Tử ngoại (Ultraviolet)

QCVN

Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Sơ đồ nguyên lý máy HPLC
Hình 2.1 Bộ chƣng cất hồi lƣu cyanid
Hình 3.1 Sắc ký đồ của chƣơng trình gradient 1
Hình 3.2 Sắc ký đồ của chƣơng trình gradient 2
Hình 3.3 Sắc ký đồ theo chế độ dung môi đẳng dòng.
Hình 3.4 Kết quả khảo sát thể tích dung dịch MgCl2
Hình 3.5 Kết quả khảo sát thể tích CuSO4 thêm vào.
Hình 3.6 Khảo sát thời gian chƣng cất
Hình 3.7 Sơ đồ xử lý mẫu
Hình 3.8 Sắc đồ của cyanid trong mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn
Hình 3.9 Sắc ký đồ của mẫu cá thêm chuẩn tại nồng độ 0,02 µg/mL (tƣơng
ứng 0,1 mg/kg)
Hình 3.10 Sắc ký đồ của mẫu mực thêm chuẩn tại nồng độ 0,02 µg/mL
(tƣơng ứng 0,1 mg/kg)
Hình 3.11 Sắc ký đồ của mẫu tôm thêm chuẩn tại nồng độ 0,02 µg/mL
(tƣơng ứng 0,1 mg/kg)


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lƣợng cyanid tự do trong một số thực vật
Bảng 3.1 Chƣơng trình gradient 1
Bảng 3.2 Chƣơng trình gradient 2
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát lựa chọn acid
Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống

Bảng 3.5 Số liệu xây dựng đƣờng chuẩn cyanid
Bảng 3.6 Giá trị LOD và LOQ của phƣơng pháp với các nền mẫu khác
nhau
Bảng 3.7 Kết quả tính độ lặp lại và độ thu hồi của cá
Bảng 3.8 Kết quả tính độ lặp lại và độ thu hồi của mực
Bảng 3.9 Kết quả tính độ lặp lại và độ thu hồi của tôm


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ô nhiễm môi trƣờng biển đang là một trong những vấn đề nóng bỏng của
nhân loại. Trong năm 2016 Việt Nam cũng phải gánh chịu những tổn thất nặng nề
do ô nhiễm môi trƣờng biển gây ra mà nguyên nhân chính là nƣớc thải từ nhà máy
sản xuất gang thép. Nƣớc thải công nghiệp đặc biệt là các ngành công nghiệp nặng
nhƣ luyện kim, cơ khí thƣờng chứa nhiều hóa chất độc hại và dầu bôi trơn, do đó
thƣờng không đƣợc tái sử dụng mà qua xử lý rồi thải ra môi trƣờng. Nếu quá trình
xử lý đó không đảm bảo sẽ gây ra hậu quả nghiêm trọng về cả kinh tế lẫn môi
trƣờng.
Cyanid là hợp chất có độc tính cao đối với cả con ngƣời và các loài sinh vật
khác có mặt trong thành phần nƣớc thải từ công nghiệp luyện kim. Môi trƣờng sống
chứa một lƣợng cyanid vƣợt quá ngƣỡng cho phép làm thủy sản nhiễm độc. Nguồn
thực phẩm không đảm bảo này sẽ để lại những hậu quả đáng tiếc nếu đến tay ngƣời
tiêu dùng. Tuy nhiên trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam lại chƣa từng giám sát hàm
lƣợng cyanid trong thủy sản do đó chƣa có ngƣỡng giới hạn nồng độ cyanid trong
thủy sản. Ở Việt Nam chỉ có quy định về hàm lƣợng cyanid cho phép trong nƣớc ăn

uống là 0,07 mg/L (theo QCVN 6-1 Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia đối với nƣớc
khoáng thiên nhiên và nƣớc đóng chai) [3].
Do đó trong khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ, đề tài “Xác định hàm
lượng cyanid trong thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” đã đƣợc
thực hiện với các mục tiêu sau đây:
 Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp xác định hàm lƣợng cyanid trong thủy
sản.
 Ứng dụng phƣơng pháp trong việc xác định hàm lƣợng cyanid trong thủy sản
ở vùng biển một số tỉnh miền Trung.

1


CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1 Thực trạng ô nhiễm môi trƣờng biển do nƣớc thải công nghiệp luyện
kim
Trong công cuộc hiện đại hoá đất nƣớc không thể phủ nhận những giá trị mà
các ngành công nghiệp đặc biệt là các ngành công nghiệp nặng mang lại cho nền
kinh tế của một quốc gia. Ở Việt Nam, nhóm ngành này đóng vai trò then chốt
trong sự phát triển kinh tế. Tuy nhiên, hệ lụy mang lại từ ngành công nghiệp luyện
kim và gia công kim loại này là sự gia tăng áp lực về ô nhiễm môi trƣờng và sức
khỏe con ngƣời. Các vấn đề ô nhiễm có thể kể đến nhƣ ô nhiễm tiếng ồn, ô nhiễm
đất, ô nhiễm không khí và đặc biệt là ô nhiễm nguồn nƣớc.
Hiện nay có 2 kĩ thuật luyện cốc đƣợc dùng trong sản xuất thép là luyện cốc
ƣớt và luyện cốc khô.
 Luyện cốc ƣớt là công nghệ cũ chi phí thấp: dùng nƣớc để giảm nhiệt khi
than cốc từ lò luyện ra từ 1000oC về 200oC. Việc dùng nƣớc làm nguội than
gây ra nhiều phản ứng hóa học, sinh ra nhiều chất độc hại nhƣ cyanid,
phenol, NH3, CO theo nguồn nƣớc thải và khí thải ...


Luyện cốc khô là dùng khí N2 để làm nguội than cốc từ lò, việc này không
xảy ra các phản ứng hóa học và giảm sinh ra các chất độc hại theo nguồn
nƣớc thải. Nhƣ vậy chi phí xử lý chất thải của luyện cốc ƣớt sẽ cao hơn rất
nhiều so với luyện cốc khô, tuy nhiên luyên cốc khô cần khí N2 để làm nguội
nên có chi phí đầu tƣ ban đầu và chi phí vận hành cao hơn.
Khi sử dụng kĩ thuật luyện cốc ƣớt để sản xuất thép thành phần của nƣớc thải

thƣờng rất khó xử lý vì bao gồm nhiều hóa chất độc hại nhƣ phenol, cyanid,
amoniac, dầu, kim loại nặng và một số chất hữu cơ khác. Các hóa chất độc hại này
nếu không qua xử lý mà thải ra môi trƣờng sẽ dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng
cho môi trƣờng kéo theo đó là những ảnh hƣởng của kinh tế và xã hội [5], [6].

2


1.2 Tổng quan về cyanid
Acid cyanhydric (HCN) đƣợc phát hiện vào năm 1782 bởi một nhà hóa học
Thụy Điển, Carl Wilhelm Scheele. HCN và của các hợp chất đƣợc sử dụng trong
nhiều quá trình hóa học, bao gồm khử trùng, luyện sắt và thép, xi mạ điện,
quặng…Ngoài ra chúng cũng đƣợc sử dụng trong việc tổng hợp acrylonitrile trong
việc sản xuất các sợi acrylic, tổng hợp cao su, và nhựa [18].
Cyanid là thuật ngữ chung cho các hóa chất có chứa một nhóm cyano (liên
kết ba carbon và nitơ) xuất hiện tự nhiên hoặc đƣợc tạo ra bởi con ngƣời dƣới nhiều
hình thức khác nhau. Nồng độ cyanid thấp có mặt trong môi trƣờng hàng ngày nhƣ
chất ổn định trong muối ăn, một số loại thực vật nhƣ sắn, măng, mận và mơ [18].
1.2.1 Các dạng tồn tại của cyanid
Acid cyanhydric, thể khan là chất lỏng rất linh động, tỷ trọng d=0,696. Nhiệt
độ sôi ở 20ºC, đông đặc ở -14 ºC, không màu, có mùi hạnh nhân, vị rất đắng, hoà
tan rất dễ trong nƣớc và rƣợu, là một chất acid yếu có pK ở 25oC là 9,21. Hơi của

HCN có tỷ trọng d=0,968. Ở trong phòng kín, hơi HCN trở nên rất độc. Lợi dụng
tính chất này, trong chiến tranh các nhà quân sự đã sử dụng HCN làm chất độc giết
ngƣời trong phòng kín. Trong không khí, HCN bốc hơi và phân tán nhanh chóng,
làm cho nó ít độc hại hơn [18].
Các muối cyanid nhƣ NaCN, KCN là các muối tinh thể trắng, dễ bị phân huỷ
trong không khí bởi hơi nƣớc, carbon dioxid, lƣu huỳnh dioxid..., tan rất tốt trong
nƣớc tạo dung dịch trong suốt, ít tan trong rƣợu, tan trong dung dịch nƣớc rƣợu.
Dung dịch nƣớc của các muối này có tính kiềm mạnh [18].
Cyanogen clorid (CNCl) là chất khí, rất ít tan trong nƣớc, rất độc, độc hơn so
với CN- khi ở cùng nồng độ. CNCl thủy phân trong môi trƣờng kiềm tạo ra cyanat,
ở pH ≥12 phản ứng thủy phân xảy ra hoàn toàn [5], [18].
Thiocyanat (SCN-) là muối của acid thiocyanic, đƣợc hình thành khi sulfid,
carbon và nitrogen kết hợp với nhau. Các thiocyanat đƣợc tìm thấy trong nhiều thức
ăn và thực vật. Tuy nhiên, chúng đƣợc sinh ra chủ yếu từ những phản ứng giữa
cyanid tự do và sulfid. Phản ứng này xảy ra trong môi trƣờng (ví dụ nhƣ trong
3


những dòng chất thải có chứa cyanid) và trong cơ thể con ngƣời sau khi nuốt hoặc
hấp thụ cyanid [5].
Cyanid ở trạng thái tự do rất độc nhƣng khi nó liên kết bền trong phức thì sự
phân ly của phức quá nhỏ nên trong dung dịch nồng độ CN- không đủ để gây độc
[5].
1.2.2 Tính chất hóa học của cyanid
 Acid cyanhydric phản ứng với dung dịch kiềm tạo thành muối tƣơng ứng
[18].
HCN + NaOH → NaCN + H2O
HCN + KOH → KCN + H2O
2 HCN + Ca(OH)2 → Ca(CN)2 + 2 H2O
 Trong quá trình phản ứng với acid sulfuric đặc, acid cyanhydric bị phân huỷ

thành acid formic, acid formic tiếp tục xúc tác cho một phản ứng kết hợp của
acid cyanhydric và acid sulfuric (HCN:H2SO4). Hỗn hợp này có thể bị phân
huỷ thành carbon dioxid, lƣu huỳnh dioxid và amoniac.
HCN + H2SO4 → HCN•H2SO4
HCN•H2SO4 → SO2 + CO2 + NH3
 Các aldehyd, ceton cũng phản ứng đƣợc với HCN tạo thành cyanohydrin.
RCHO + HCN → RCH(OH)CN
(aldehyd)

(cyanohydrin)

RCOR’ + HCN → RC(OH)(CN)R’
(ceton)

(cyanohydrin)

 Ở dung dịch loãng 1/5000, trong 5 tháng HCN bị phân huỷ hết.
HCN + 2 H2O → HCOONH4
(amoni format)
2 HCN + 2H2S + O2 → 2 HCNS + 2H2O
(acid sulfocyanhydric)
 Các muối cyanid kim loại kiềm bị carbon dioxide trong không khí phân huỷ
tạo thành HCN.
4


2 NaCN + CO2 + H2O → 2 HCN + Na2CO3
Vì vậy phải bảo quản muối kim loại cyanid trong thùng kín, để ở chỗ mát.
 Các muối cyanid tan trong nƣớc dễ tạo phức với các ion trong dung dịch
thành phức không tan.

 Các hợp chất có nito tác dụng với các chất hữu cơ nhƣ acid malic, citric,
alkaloid, tanin cũng tạo nên HCN [13].
 Cyanid khi phản ứng với o-phtalaldehyd (OPA) và taurin ở pH = 9 tạo dẫn
chất có khả năng phát huỳnh quang [7], [8].
1.2.3 Nguồn phát sinh cyanid
Có hai nguồn phát sinh cyanid: trong thiên nhiên và do hoạt động sản xuất
của con ngƣời.
Trong tự nhiên, cyanid có thể đƣợc sản sinh ra bởi vi khuẩn, nấm hay một số
loài động, thực vật. Trong cơ thể của con ngƣời, cyanid có thể kết hợp với
hydroxocobalamin để hình thành vitamin B12 (cyanocobalamin) [6], [16], [21].
Bảng 1.1 Hàm lượng cyanid tự do trong một số thực vật
STT

Tên loài

Hàm lƣợng cyanid (CN- mg/100g mô)

1

Sắn

104

2

Mô cây dại

140- 370

3

Hạnh nhân

250

4

Đậu lima

100-300

5

Cao lanh

250

Bên cạnh thực vật, nấm và vi khuẩn cũng nhƣ côn trùng cũng là nguồn sinh
cyanid trong tự nhiên [16].
Tuy nhiên phần lớn lƣợng cyanid có trong nƣớc và đất xuất phát từ những
quá trình công nghiệp. Nguồn thải chính của cyanid vào trong nƣớc là từ các quá
trình khai thác mỏ, công nghiệp hoá chất hữu cơ, những công việc liên quan đến sắt
và thép, đặc biệt trong công nghiệp luyện thép. Trong công nghiệp thép, cyanid
đƣợc sử dụng nhƣ chất trợ dung hỗ trợ quá trình chảy của hỗn hợp, làm cứng, mạ

5


thép…. Nƣớc đƣợc dùng để làm nguội xỉ trong lò, do đó sẽ chứa nhiều chất hóa học
trong đó có cyanid [5], [20].

Những nguồn cyanid khác từ xuất phát từ xe cộ, chất đốt từ những nhà dân
trong thành phố và thuốc trừ sâu có chứa cyanid. Cyanid có trong những bãi chôn
lấp có thể làm nhiễm bẩn nguồn nƣớc ngầm.
Quá trình khai thác vàng cyanid đƣợc dùng để hòa tách vàng từ quặng. Nếu
quá trình khai thác đƣợc tiến hành theo quy trình khép kín có tái thu hồi cyanid sau
khi thu hồi vàng sẽ không gây ô nhiễm môi trƣờng. Tuy nhiên, thực tế tại các bãi
đào vàng những ngƣời làm vàng tự do lại không thực hiện khâu xử lý cyanid dƣ
thừa sau khi tách vàng ở trong bùn và nƣớc lọc. Vì vậy, lƣợng cyanid thải ra môi
trƣờng rất lớn [12].
Bên cạnh đó một lƣợng lớn cyanid trong nƣớc có nguồn gốc từ việc sử dụng
cyanid để đánh cá của ngƣ dân [15].
1.2.4 Độc tính của cyanid
Phơi nhiễm cyanid thƣờng xảy ra ở đƣờng tiêu hoá và đƣờng hô hấp, tuy
nhiên trong một số trƣờng hợp cyanid lỏng có thể xâm nhập vào cơ thể khi tiếp xúc
với mắt hoặc da. Sau khi xâm nhập vào cơ thể cyanid vào máu theo tuần hoàn đi
khắp các mô và cơ quan trong cơ thể [6], [13].
Trong tế bào cyanid gắn với enzym metalloenzym và làm bất hoạt enzym
này. Kết quả là làm bất hoạt enzym cytochrome oxidase (tại cytochrome a3), do đó
ức chế hô hấp tế bào ngay ở điều kiện đầy đủ oxy. Chuyển hoá tế bào chuyển từ
điều kiện hiếu khí sang kị khí và sinh ra acid acetic. Các mô và cơ quan có nhu cầu
oxy cao nhất (não và tim) là những ảnh hƣởng sâu sắc nhất của ngộ độc cyanid cấp
tính.
LCt50 của acid cyanhydric và cyanogen clorid do hít phải đã đƣợc ƣớc tính là
2500-5000 mg/phút/m3 cho acid cyanhydric và khoảng 11000 mg/phút/m3 cho
cyanogen clorid. LD50 cho acid cyanhydric đƣợc ƣớc tính là 1,1 mg/kg cho tiêm
tĩnh mạch và 100 mg/kg sau khi tiếp xúc với da. LD50 đƣờng uống cho natri và kali
cyanid là khoảng 100 và 200 mg/kg [13].
6

Cyanogen clorid đƣợc sử dụng trong khai thác mỏ và kim loại do đó có thể
có mặt trong nƣớc thải công nghiệp. Do thành phần có clo nên cyanogen clorid gây
kích ứng mắt, đƣờng hô hấp và nhiễm độc phổi chậm mức độ tƣơng tự với clo hoặc
phosgene khí. Ở nồng độ cao (ví dụ, trong không gian kín), tác nhân này có thể gây
tử vong trong vòng 6-8 phút. LCt50 của cyanogen clorid ƣớc tính là 11000
mg/phút/m3 [13].
1.2.5 Ảnh hưởng của cyanid đối với môi trường biển
Nghiên cứu cho thấy cyanid không chỉ độc với con ngƣời mà còn tác động
không nhỏ với môi trƣờng đặc biệt là môi trƣờng biển. Nhiều nghiên cứu cho thấy
cyanid phá huỷ san hô, gây chết hầu nhƣ toàn bộ sinh vật biển khi tiếp xúc, số còn
lại bị ảnh hƣởng đến chức năng vận động gây mất cân bằng hệ sinh thái.
Năm 1958, nghiên cứu đã chỉ ra cyanid tác động lên hệ thần kinh của sinh vật
biển với liều lƣợng đủ cao có thể gây chết sinh vật. Sau đó tính chất này đã đƣợc sử
dụng trong việc đánh bắt cá phục vụ cho công nghiệp cá cảnh ở các nƣớc Đông
Nam Á tiêu biểu là Philippin. Lợi nhuận cùng với sự dễ dàng của việc mua hoá chất
này đã khiến cho đánh cá bằng cyanid trở nên cực kì phổ biến trong công nghiệp cá
cảnh thậm chí còn lan sang bắt các loại cá thƣơng phẩm nhƣ cá mú và xuất khẩu
sang các nƣớc khác trong khu vực. Sự bùng nổ của đánh cá bằng cyanid ở Philippin
những năm 60 đã để lại những hậu quả không thể khắc phục cho vùng biển của
quốc gia này. Vốn đƣợc biết đến là một quốc gia có tài nguyên biển vô cùng phong
phú nhƣng chỉ sau một thời gian đánh cá bằng cyanid bùng nổ, hàng năm hàng ngàn
hecta san hô đã bị tàn phá kéo theo đó là ảnh hƣởng không hề nhỏ đến hệ sinh vật
rặng san hô. Cyanid giết chết loài tảo cộng sinh Zooxanthallae trong các cụm san
hô, san hô thiếu dinh dƣỡng bị tẩy trắng trong khi cấu trúc lá vẫn còn nguyên vẹn.
Chất lƣợng sinh vật biển giảm mạnh. Cân bằng hệ sinh thái biển bị đảo lộn [15].
Ở Việt Nam theo thống kê sơ bộ cyanid đã gây thiệt hại khoảng 100 tấn hải sản
chết dạt vào bờ. Do không thể đánh bắt trong phạm vi từ bờ đến 20 hải lý, có tới
90% tàu lắp máy công suất thấp và gần 4.000 tàu không lắp máy đã phải nằm bờ.
Sản lƣợng khai thác ven bờ thiệt hại khoảng 1.600 tấn/tháng. Với hoạt động nuôi
7

trồng thủy sản, có 9 triệu tôm giống bị chết, hàng ngàn lồng nuôi cá cũng bị thiệt
hại. Hoạt động du lịch thì không chỉ gây thiệt hại cho doanh nghiệp ở 4 tỉnh miền
Trung vì theo Chính phủ, nhiều doanh nghiệp du lịch ở Hà Nội và thành phố Hồ
Chí Minh cũng bị thiệt hại khi khách dự định đến 4 tỉnh miền trung hủy tour, khiến
công suất sử dụng phòng tại bốn tỉnh trên mất 40-50%. Các rạn san hô, phù du sinh
vật chết tăng nguy cơ làm gián đoạn chuỗi thức ăn biển, khiến suy giảm đa dạng
sinh học và nguồn lợi thủy sản khu vực, ảnh hƣởng đến sinh kế lâu dài của dân.
1.3 Các phƣơng pháp xác định cyanid
1.3.1 Phương pháp truyền thống
Các phƣơng pháp đƣợc đƣa ra để xác định nồng độ cyanid trong nƣớc nhƣ
chuẩn độ, đo màu, điện cực chọn lọc ion … tuy nhiên những phƣơng pháp này đều
khó khăn khi áp dụng với các mẫu sinh học do trong kỹ thuật phân tích cyanid trong
thủy sản có nhiều yếu tố nhiễu ảnh hƣởng đến kết quả phép đo nhƣ các acid béo,
một số đƣờng khử, các hợp chất sulfat, các hợp chất chứa nito, độ đục…
Acid béo có thể bị lôi cuốn cùng trong quá trình chƣng cất gây ra ảnh hƣởng
đối với phép đo. Ảnh hƣởng của acid béo có thể đƣợc loại bỏ bằng cách acid hóa
mẫu. Tuy nhiên không nên chiết trong thời gian quá dài vì cyanid tiếp xúc với pH
thấp trong thời gian dài sẽ gây ảnh hƣởng đến quá trình phân ly của CNCác hợp chất lƣu huỳnh có khả năng phản ứng với HCN tạo thiocyanat là
một chất không độc. Do đó nếu không loại trừ ảnh hƣởng của sulfit sẽ gây ra sai số
đối với phép đo. Để loại trừ ảnh hƣởng của các hợp chất lƣu huỳnh trƣớc khi chƣng
cất mẫu thêm vào một lƣợng CuSO4 để tạo kết tủa CuS ngăn phản ứng tạo
thiocyanat.
Các hợp chất nitrat và nitrit trong quá trình chƣng cất có khả năng phản ứng
với các acid hữu cơ tạo thành cyanid gây ra sai số thừa. Để loại trừ ảnh hƣởng này
trƣớc khi chƣng cất thêm một lƣợng acid sulfamic để ngăn phản ứng trên xảy ra.
Các ảnh hƣởng của màu sắc và độ đục có thể loại trừ qua quá trình chƣng cất
[9], [10].
 Phương pháp chuẩn độ

8


Phƣơng pháp này đƣợc phát hiện và công bố lần đầu tiên vào năm 1950 bởi
nhà khoa học Liebig. Năm 1963 phƣơng pháp này đƣợc hai nhà khoa học Bark và
Higson báo cáo lại. Trong đó, ion CN- trong dung dịch đƣợc chuẩn độ với lƣợng dƣ
AgNO3 tạo phức Ag[Ag(CN)2]. Trong bình chuẩn độ có thêm một lƣợng nhỏ thuốc
thử p- dimethylaminobenzalrhodanme, khi CN- phản ứng hết Ag+ dƣ sẽ phản ứng
với thuốc thử p- dimethylaminobenzalrhodanme. Dung dịch trong bình chuẩn độ
chuyển từ vàng sang đỏ. Phƣơng pháp chuẩn độ đƣợc dùng để phát hiện cyanid khi
nồng độ ion cyanid lớn hơn 1ppm (>3,85*10-5M). Tuy nhiên khi sử dụng phƣơng
pháp chuẩn độ để xác định lƣợng cyanid trong dung dịch thì một yêu cầu bắt buộc
phải đƣợc đáp ứng là trong dung dịch không đƣợc phép có mặt phức chất của
cyanid và kim loại [15].
 Phương pháp so màu dựa trên phản ứng của König
Phƣơng pháp so màu đƣợc sử dụng để phát hiện một lƣợng nhỏ ion CNtrong mẫu dựa trên phản ứng tổng hợp của nhà khoa học König xây dựng năm
1904-1905. Trong phản ứng König, cyanogen clorid hoặc cyanogen bromid đƣợc
cho phản ứng với pyridin và một amin thơm tạo ra một phẩm nhuộm. Dựa trên
nguyên tắc đó Aldridge đã xây dựng một phƣơng pháp xác định ion CN- bằng cách
tạo phẩm nhuộm rồi đo màu từ đó xác định nồng độ ion CN-. Aldridge cho ion CNphản ứng với một lƣợng dƣ Br2, sau phản ứng này thu hồi Br2 dƣ bằng dung dịch
acid asenic, cyanobromid đƣợc cho phản ứng với hỗn hợp pyridin-benzidin. Hỗn
hợp phản ứng sẽ có màu cam và chuyển sang màu đỏ trong vòng 6 phút, màu đỏ
bền trong vòng 6-24 phút ở 20oC. Tuy nhiên phƣơng pháp này có nhƣợc điểm là sử
dụng nhiều hoá chất độc hại nhƣ benzidine - một chất đƣợc cho là có khả năng gây
ung thƣ.
Một phƣơng pháp tƣơng tự phát triển dựa trên phản ứng màu của König là
phƣơng pháp của Epstein (1947), phƣơng pháp này sử dụng tác nhân oxy hoá CNthành cyanogen clorid là Cloramin-T. Cyanogen clorid sau đó phản ứng với pyridin
gồm cả pyrazolon cho sản phẩm có màu xanh đo đƣợc ở bƣớc sóng 630nm. Phƣơng
pháp này có thể sử dụng đƣợc trong môi trƣờng acid, trung tính hoặc hơi kiềm. Một

9


đề xuất khác cho phƣơng pháp này đƣợc đƣa ra bởi APHA (APHA,1985; Burtisand
Ashwood, 1994) là thay thế hỗn hợp pyridine - pyrazolon bằng hỗn hợp bền hơn là
pyridine - acid barbituric.
Phƣơng pháp so màu thích hợp để phát hiện cyanid trong khoảng 0,1-1 ppm
(3,8*10-6 – 3,8*10-5 M) [15].
 Phương pháp điện cực chọn lọc ion
Đây là một phƣơng pháp tƣơng đối phổ biến vì đáp ứng nhanh và có độ nhạy
cao. Phƣơng pháp này hoạt động trên cơ sở của màng chọn lọc ion. Điện cực chọn
lọc ion (ISEs) là ứng dụng của máy đo điện thế. Khi đo, giá trị điện thế của dung
dịch phụ thuộc vào hoạt độ một ion chính do đó có thể xác định sự có mặt của một
ion chọn lọc khi có mặt các ion khác.
Trong số các điện cực halogen màng điện cực bạc iodid hoặc sự phối hợp
của điện cực bạc iodid và điện cực bạc sulfid thƣờng đƣợc sử dụng để làm điện cực
chọn lọc cyanid. Điện cực đáp ứng sơ cấp giải phóng ion I- theo phƣơng trình (1),
(2), quá trình trao đổi ion xảy ra trên bề mặt điện cực.
2CN- + AgI ↔ Ag(CN)-2 + I-

(1)

CN- + AgI ↔ AgCN + I-

(2)

Nếu điện cực chỉ đáp ứng với sự phân ly của ion CN- thì pH dung dịch chỉ
phụ thuộc vào sự phân ly của HCN. Từ đó xác định nồng độ CN-. Phƣơng pháp này
có thể sử dụng để xác định nồng độ của CN- khi có mặt phức chất cyanid - kim loại.
Khả năng phát hiện ion CN- nằm trong khoảng nồng độ từ 10-5-10-1M (0,26-2600

ppm). Tuy nhiên hầu hết các điện cực chọn lọc cyanid đều không chỉ đáp ứng với
duy nhất ion CN- mà còn đáp ứng với các ion khác nhƣ S2-, Cl-, Br-, Ag+…do đó tạo
ra yếu tố gây nhiễu cho quá trình đo [15].
1.3.2 Cảm biến sinh học
Cảm biến sinh học là thiết bị sử dụng các tác nhân sinh học nhƣ enzym hoặc
kháng thể… để nhận biết hoặc định lƣợng các chất hoá học. Cảm biến sinh học có
thể là cảm biến vi khuẩn hoặc cảm biến dựa trên emzyme.

10


Sử dụng cảm biến sinh học để phát hiện hoặc định lƣợng cyanid đƣợc phát
triển dựa vào các sinh vật có khả năng thoái hoá cyanid.
Mặc dù cyanid là một chất cực độc đối với con ngƣời và hầu hết sinh vật tuy
nhiên có những loại vi sinh vật có khả năng chuyển cyanid thành chất không độc
hoặc ít độc hơn nhờ có hệ thống enzym phân giải độc đáo. Cảm biến vi khuẩn đƣợc
tạo thành trên cơ sở những vi sinh vật có khả năng phân giải cyanid. Mặt khác, một
loại cảm biến vi khuẩn khá còn đƣợc phát triển dựa trên sự ức chế cytochrome
oxydase trong chuỗi hô hấp tế bào do đó làm giảm sự tiêu thụ oxy của một số vi
khuẩn hiếu khí. Đo lƣờng sự giảm tiêu thụ oxy bằng một điện cực sẽ có đƣợc thông
tin về cyanid trong mẫu. Giới hạn xác định đƣợc cyanid của phƣơng pháp này là 0,8
ppm (3,04*10-5 M). Bên cạnh các cảm biến vi khuẩn hệ thống cảm biến sinh học
còn gồm các cảm biến enzym, bao gồm các enzym ức chế và các enzym thoái hoá
cyanid.
Ƣu điểm của phƣơng pháp này là đáp ứng nhanh, nhạy, tín hiệu ổn định,
không gây ô nhiễm môi trƣờng, giá thành phù hợp và tiện sử dụng. Tuy nhiên
nhƣợc điểm lớn của phƣơng pháp này là độ chọn lọc không cao. Trên thực tế đây
không phải là biện pháp lý tƣởng để xác định cyanid do số lƣợng enzym ức chế hay
thoái hóa cyanid là không nhiều. Điện cực theo dõi tín hiệu sự tiêu thụ oxy chỉ hoạt
động trong thời gian ngắn (7 ngày) do sự bất hoạt enzym. Các cảm biến sinh học

dựa trên enzym phân giải cyanid có độ nhạy kém cho tất cả các loại detector. Cảm
biến dựa trên vi khuẩn có độ chọn lọc kém và dễ bị ảnh hƣởng bởi môi trƣờng dinh
dƣỡng [15].
1.3.3 Phương pháp đo huỳnh quang
Nguyên lý chung: dựa trên phản ứng của tạo chất phát huỳnh quang của
cyanid khi phản ứng với taurin và o-phtalaldehyd (OPA) ở pH = 9.
Trong phƣơng pháp này cyanid đƣợc cho phản ứng với taurin và OPA với tỉ
lệ đề xuất 500 µL dung dịch mẫu cùng 100 µL dung dịch OPA 1,5 mM 100 µL
dung dịch taurin 3 mM và 800 µL 2- propanol vào bình thủy tinh 1,5 mL.

11


Trong dung dịch đệm borat – phosphat (pH =9) cyanid tạo chất có khả năng
phát huỳnh quang khi phản ứng với OPA và amin thơm, huỳnh quang có λex = 330 345 nm, λem = 370 – 380 nm. Taurin đƣợc chọn là amin thơm vì cho huỳnh quang
có độ chọn lọc cao và phản ứng tạo huỳnh quang xảy ra hoàn toàn ở nhiệt độ phòng.
Diaminoethan cho huỳnh quang mạnh gấp 7 lần so với taurin tuy nhiên phản ứng
tạo huỳnh quang xảy ra rất chậm ở nhiệt độ phòng. Cho thêm vào hỗn hợp dung
dịch β-cyclodextrin hoặc một dung môi hữu cơ nhƣ 2-propanol, dioxan, aceton…sẽ
kích hoạt hỗn hợp phản ứng khiến phản ứng xảy ra nhanh hơn. Trong số trên thì 2propanol là dung môi cho kết quả tối ƣu nhất.
Phân tích mẫu đã chuẩn bị với máy quang phổ huỳnh quang ở λex = 340 nm,
λem = 370 nm.
Kết quả: ion CN- đƣợc phát hiện khi có mặt các ion khác nhƣ clorid, sulfid,
iodid, nitrat… [7].
Phổ huỳnh quang có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, cƣờng độ huỳnh
quang chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố khác nhƣ nhiệt độ, độ nhớt dung môi, độ
tinh khiết của dung môi. Sự có mặt của tiểu phân keo có thể gây nên sự tán xạ ánh
sáng làm ảnh hƣởng tới sự phát huỳnh quang. Ngoài ra sự có mặt của oxy hòa tan
trong dung dịch làm giảm mạnh cƣờng độ huỳnh quang.
1.3.4 Phương pháp sắc ký

Từ 1974, sắc ký khí đã đƣợc sử dụng để phát hiện cyanid tuy nhiên phƣơng
pháp này không trở nên phổ biến vì độ nhạy kém. Để cải thiện độ nhạy phƣơng
pháp ngƣời ta oxy hoá cyanid thành cyanogen bằng Cloramin- T. Tuy có cải thiện
đƣợc độ nhạy nhƣng sắc ký khí vẫn không phải là lựa chọn hàng đầu do có nhiều
phƣơng pháp khác ƣu việt hơn [15].
Hiện nay để phát hiện cyanid ngƣời ta dung một số kỹ thuật khác nhƣ sắc ký
lỏng hiệu năng cao, sắc ký ion với detector phát hiện ion, detector UV-VIS, detector
huỳnh quang, detector dẫn điện…là những phƣơng pháp tối ƣu hơn đƣợc dùng để
phát hiện cyanid [15].

12


 Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao detector phát hiện huỳnh quang đã đƣợc
sử dụng để phát hiện cyanid trong nƣớc tiểu [8].
Chuẩn bị mẫu: 20 mL nƣớc tiểu đƣợc cho vào một chén sứ chứa 100 µL
NaOH 4M. Sau khi ly tâm ở 1000*g trong 15 phút, lấy 500 µL dung dịch này đƣợc
pha loãng thành 10 mL với nƣớc và sử dụng cho phản ứng sinh huỳnh quang.
Phản ứng phát sinh huỳnh quang: lấy 500 µL dung dịch mẫu hoặc dung dịch
cyanid đã pha loãng trong một ống nghiệm màu nâu 1,5 mL có nắp thủy tinh. Thêm
100 µL dung dịch taurin 30 mM và 100 µL dung dịch 2,3- naphtalenaldehyd 2 mM
trong đệm borat-phosphat (pH = 9). Hỗn hợp đƣợc để yên trong 2 giờ ở nhiệt độ
phòng.
Điều kiện sắc ký:
-

Pha tĩnh: cột sắc ký pha đảo RP18 và tiền cột bảo vệ tƣơng ứng

-

Pha động: đệm K3PO4 0,05M (pH =6,8): MeOH = 52: 48

-

Thể tích tiêm mẫu: 20 µL

-

Tốc độ dòng 1 mL/phút

-

Detector huỳnh quang hoạt động ở bƣớc sóng kích thích và bƣớc sóng phát
xạ lần lƣợt là 418 nm và 480 nm.
Phép thử với mẫu trắng đƣợc thực hiện theo cách tƣơng tự, sử dụng nƣớc

thay cho mẫu nƣớc tiểu hoặc cyanid chuẩn.
Kết quả: xuất hiện đỉnh huỳnh quang của cyanid ở thời gian lƣu 13 phút ở
điều kiện sắc ký đƣợc chọn.
 Kỹ thuật sắc ký ion sử dụng detector huỳnh quang và detector UV-VIS phát
hiện cyanid trong máu
Chuẩn bị mẫu: 0,1 mL máu đƣợc cho vào một chén sứ chứa 0,5 mL nƣớc và
2 mL methanol. Sau khi ly tâm ở 1600*g trong 10 phút. Dung dịch này đƣợc đem đi
dẫn xuất huỳnh quang với NDA và taurin để ở nhiệt độ phòng 30 phút rồi khai triển
sắc ký.
Điều kiện sắc ký:
-

Pha tĩnh: cột sắc ký trao đổi ion TSK-gel

13


-

Pha động: đệm phosphat (pH =6,1): MeOH = 1:1

-

Thể tích tiêm mẫu: 20 µL

-

Tốc độ dòng 1 mL/phút

-

Detector huỳnh quang hoạt động ở bƣớc sóng kích thích và bƣớc sóng phát
xạ lần lƣợt là 418 nm và 480 nm.
Phƣơng pháp này có giới hạn phát hiện cho cyanid là 3,8 pmol/mL và của

thiocyanat là 86 pmol/mL. Tín hiệu cyanid đƣợc phát hiện ở thời gian lƣu 11,2 phút,
của thiocyanate ở 7,8 phút.
Đây là phƣơng pháp có độ nhạy cao, có thể phát hiện đƣợc cyanid và
thiocyanat trong máu. Tuy nhiên, với phƣơng pháp xử lý mẫu này sẽ gặp khó khăn
với mẫu thủy sản do ở mẫu thủy sản cyanid không tồn tại hoàn toàn ở dạng hòa tan
nhƣ trong mẫu máu [19].
1.4 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.4.1 Nguyên tắc
Mẫu phân tích đƣợc hòa tan trong một pha động. Pha tĩnh đƣợc nhồi vào cột

tách theo một kĩ thuật nhất định.
Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với
tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tƣơng tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan. Yếu
tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là tổng các tƣơng tác:
-

Tƣơng tác giữa chất phân tích và pha tĩnh (F1).

-

Tƣơng tác giữa chất phân tích và pha động (F2).

-

Tƣơng tác giữa pha tĩnh và pha động (F3).
Tƣơng tác F1 và F2 đóng vai trò quyết định quá trình tách của các chất.
Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của của quá trình sắc ký. Nếu pha tĩnh

là chất hấp thụ thì ta có sắc ký hấp thụ pha thƣờng hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất
lỏng thì ta có sắc ký phân bố [1], [2].

14


1.4.2 Máy HPLC
Máy HPLC gồm một hệ thống cấp dung môi, bơm, bộ tiêm mẫu, buồng cột
chứa cột sắc ký, detector, và hệ thống thu nhận và xử lý số liệu.

Hình 1.1 Sơ đồ nguyên lý máy HPLC
Trong đó detector là bộ phận phát hiện chất phân tích và đo các tín hiệu sinh

ra khi có chất ra khỏi cột.
-

Yêu cầu:
+ Có vùng tuyến tính rộng giữa nồng độ chất cần phân tích và cƣờng độ đáp

ứng của detector.
+ Có đáp ứng kém hoặc không có đáp ứng với dung môi pha mẫu, pha động.
+ Cho đáp ứng nhanh, ổn định, dễ đo đạc.
-

Hiện tại, thiết bị HPLC thƣơng mại có rất nhiều loại detector đa dạng để đáp
ứng các nhu cầu phân tích khác nhau, ví dụ nhƣ: detector hấp thụ UV-VIS,
detector huỳnh quang, detector chỉ số khúc xạ, detector tán xạ bay hơi,
detector điện hóa, detector khối phổ.
Nghiên cứu này sử dụng detector huỳnh quang do chất nghiên cứu có khả

năng tạo dẫn chất phát huỳnh quang. Đây là loại detector có độ nhạy rất cao vì bức
xạ phát ra đƣợc đo trên nền tối. Tuy nhiên detector huỳnh quang không phổ biến
nhƣ detector UV- VIS vì trên thực tế không nhiều chất có khả năng phát huỳnh
quang hay tạo đƣợc dẫn chất phát huỳnh quang.

15


Detector huỳnh quang đƣợc sử dụng cho cả chất có khả năng phát huỳnh
quang và chất có khả năng tạo ra dẫn chất phát huỳnh quang khi phản ứng với thuốc
thử.
Độ chọn lọc của việc phát huỳnh quang đƣợc tạo ra dựa trên hai bƣớc sóng là
bƣớc sóng kích thích và bƣớc sóng phát xạ và đặc biệt là chất phân tích phải có cấu

trúc nhất định để có khả năng phát huỳnh quang [1], [2].

16