Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc giảm glucose máu trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC MS MS

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN XUÂN HIẾU
1201208

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
MỘT SỐ THUỐC GIẢM GLUCOSE MÁU
TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM
ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN XUÂN HIẾU
1201208

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
MỘT SỐ THUỐC GIẢM GLUCOSE MÁU
TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM
ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn khoa học:
1. ThS. Ngô Quang Trung
2. NCS.ThS. Đào Thị Cẩm Minh

Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa phân tích- Độc chất
2.Viện công nghệ Dược phẩm quốc gia

HÀ NỘI 2017


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận
được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên, cùng bạn bè
và gia đình.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
đến:

ThS. Ngô Quang Trung
NCS.ThS. Đào Thị Cẩm Minh

đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu.
Em xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh và PGS.TS.
Phạm Thị Thanh Hà đã nhiệt tình giúp đỡ và cho em những lời khuyên bổ ích.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị kỹ thuật viên bộ môn
Hóa phân tích- Độc chất và các anh chị Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia đã nhiệt
tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian làm thực nghiệm tại
bộ môn, tại viện.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu cùng toàn thể
thầy cô các bộ môn trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ em
trong 5 năm học tại trường.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên,
quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.

Hà Nội, tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Xuân Hiếu


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ................................................................. 3
1.1.1. Tình trạng trộn trái phép thuốc tân dược vào chế phẩm đông dược ......... 3
1.1.2. Tổng quan về Metformin hydroclorid ...................................................... 4
1.1.3. Tổng quan về nhóm Sulfonylure ............................................................... 5
1.1.4. Một số nghiên cứu xác định thuốc tân dược giảm glucose máu trộn trái
phép trong chế phẩm đông dược, TPCN ............................................................. 8
1.2. Tổng quan về phương pháp dùng trong nghiên cứu .................................... 11
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ....................................................................... 11
1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ ............................................................................... 12
1.2.3. Một số ứng dụng của sắc ký lỏng khối phổ ............................................. 16

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……17
2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu ............................................................ 17
2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn .............................................................................. 17
2.1.2. Máy móc - trang thiết bị .......................................................................... 17
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 18
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 19

2.2.1. Thu thập mẫu .......................................................................................... 19
2.2.2. Xử lý mẫu ................................................................................................ 19
2.2.3. Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS........................... 19
2.2.4. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng ........................................... 20
2.3. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 20

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................. 21
3.1. Xây dựng phương pháp phân tích .................................................................. 21
3.1.1. Chuẩn bị các dung dịch phân tích ........................................................... 21
3.1.2. Khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc ký, khối phổ .............................. 21
3.1.3. Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu .............................................. 28
3.2. Thẩm định quy trình phân tích....................................................................... 34
3.2.1. Độ phù hợp của hệ thống......................................................................... 34
3.2.2. Độ đặc hiệu .............................................................................................. 35
3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .............................................. 38
3.2.4. Độ tuyến tính và khoảng xác định ........................................................... 39
3.2.5. Độ lặp lại ................................................................................................. 40
3.3. Ứng dụng quy trình phân tích ........................................................................ 41
3.4. Bàn luận ............................................................................................................ 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN

Acetonitril

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Asoociation of
Official Analyical Chemists)

MET

Metformin hydroclorid

GLIB

Glibenclamid

GLIC

Gliclazid

GLIM

Glimepirid

GLIP

Glipizid

ESI

Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liqid
chromatography)

HPTLC

Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin Layer
Chromatography)

LC – MS

Sắc ký lỏng khối phổ (Liqid chromatography –mass spectrometry)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

MeOH

Methanol

PA

Tinh khiết phân tích (Pure analysis)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

TB

Trung bình

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TPCN

Thực phẩm chức năng

SERS

Tán xạ Raman tăng cường bề mặt (Surface- enhanced Raman

spectroscopy)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

Trang

Bảng 1.1. Một số nghiên cứu xác định thuốc tân dược đái tháo đường
trộn trái phép trong đông dược trên thế giới

8

Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

17

Bảng 2.2. Thành phần mẫu tự tạo

19

Bảng 3.1. Các thông số hoạt động của nguồn ion hóa

23

Bảng 3.2. Điều kiện khối phổ để phân mảnh 5 chất phân tích

24

Bảng 3.3. Điều kiện khảo sát pha động theo chế độ gradient

25

Bảng 3.4. Kết quá đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS

35

Bảng 3.5. LOD và LOQ của các chất phân tích

38

Bảng 3.6. Kết quả xây dựng đường chuẩn 5 chất phân tích

39

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp

40

Bảng 3.8. Kết quả hàm lượng glibenclamid trong các mẫu thử

41


DANH MỤC CÁC HÌNH

Tên hình

Trang

Hình 1.1. Sơ đồ hệ thống HPLC

12

Hình 1.2. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS

13

Hình 1.3. Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI

14

Hình 1.4. Tứ cực chập ba gập cong trong hệ máy Brucker

15

Hình 2.1. Hệ máy Brucker EVOQ Qube

18

Hình 3.1. Phổ đồ phân mảnh của 5 chất phân tích

23

Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát chế độ pha động

27

Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát quy trình chiết

31

Hình 3.4. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích

34

Hình 3.5. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp

37

Hình 3.6. Sắc ký đồ của các chất phân tích ở nồng độ LOQ

39

Hình 3.7. Sắc ký đồ các mẫu dương tính

43


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, đái tháo đường thực sự trở thành gánh nặng của xã
hội khi số người bị bệnh không ngừng gia tăng. Tại Việt Nam, theo điều tra quốc gia
về tỷ lệ đái tháo đường năm 2008, tỷ lệ mắc đái tháo đường type 2 tại các thành phố
lớn là 7-10%, tăng 300% trong vòng 10 năm, đây là một con số đáng báo động [11].
Đái tháo đường là bệnh mạn tính, người bệnh thường phải dùng thuốc suốt đời để
khống chế tăng đường huyết, vì đường huyết càng tăng cao, càng biến động thì
biến chứng nguy hiểm xuất hiện càng sớm và càng nặng. Do nghi ngại tác dụng
phụ của tân dược khi sử dụng kéo dài, hiện nay có xu hướng sử dụng đông dược,
thuốc có nguồn gốc từ thảo mộc trong điều trị và hỗ trợ điều trị đái tháo đường
do tính an toàn của nó khi sử dụng trong thời gian dài, khả năng kiểm soát đường
huyết tương đối tốt và giá thành rẻ.
Thuốc giả hiện là vấn nạn có quy mô toàn cầu. Ở Việt Nam, năm 20122013, thuốc giả, thuốc không đạt tiêu chuẩn chiếm 2-3% thị trường dược phẩm [3].
Không chỉ ở thị trường tân dược, các chế phẩm đông dược cũng thường được làm
giả do có lợi nhuận lớn và quản lý còn chưa chặt chẽ. Những năm gần đây hệ thống
kiểm nghiệm cũng như các cơ quan công an, quản lý thị trường và thanh tra đã
phát hiện khá nhiều thuốc đông dược, thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ
dược liệu trộn trái phép thuốc tân dược. Các tân dược trộn lẫn trong đông dược
gồm nhiều nhóm hợp chất khác nhau như thuốc chống viêm không steroid

(NSAIDs) [7,15], corticoid [10], thuốc ức chế phosphodiestarase-5 [9], thuốc đái
tháo đường [22,27]... Sử dụng các sản phẩm này kéo dài mà ko rõ nguồn gốc
thành phần rất nguy hiểm. Trong nước, đã có nhiều nghiên cứu phát hiện các tân
dược trộn trái phép trong đông dược, song với nhóm tân dược đái tháo đường
mới có một nghiên cứu [12] được công bố.
Trên thế giới, để xác định tân dược trộn trong các chế phẩm đông dược,
có thể sử dụng các phương pháp như TLC [22], HPTLC [18], TLC-SERS [20,29
], HPLC [22], LCMS/MS [21,23], HPTLC-SERS [12]… Trong đó, LC-MS/MS
là phương pháp có độ nhạy, độ chính xác cao, với khoảng nồng độ tuyến tính
rộng, thích hợp để phân tích chất cấm trộn trong mẫu đông dược có thành phần
phức tạp.
Để góp phần vào công tác kiểm nghiệm chất cấm trộn trong chế phẩm đông
dược, chúng tôi thực hiện đề tài “XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
MỘT SỐ THUỐC GIẢM GLUCOSE MÁU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ
PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS’’, với mục tiêu là:

1


1. Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc giảm glucose máu trộn trái phép
trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS.
2. Thẩm định phương pháp phân tích và ứng dụng phương pháp để xác định các
thuốc giảm glucose máu (nếu có) trộn trái phép trong một số mẫu chế phẩm
đông dược, thực phẩm chức năng (TPCN) lưu hành trên thị trường.

2


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

1.1.1. Tình trạng trộn trái phép thuốc tân dược vào chế phẩm đông dược
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có đến 80% của những người sống ở các
nước đang phát triển vẫn dựa chủ yếu vào các loại thuốc truyền thống để chăm sóc
sức khỏe của họ, nhất là ở châu Phi và châu Á. Ví dụ như dân số sử dụng thuốc đông
dược để điều trị ban đầu chiếm 90% dân số của Ethiopia, chiếm 75% dân số của Mali,
chiếm 70% ở Myannar, chiếm 70% ở Rawanda, chiếm 60% ở Tanzania, chiếm 60%
ở Uganda [22]. Trong nước, nhận thức được tính an toàn của các sản phẩm có nguồn
gốc từ tự nhiên nên nhu cầu về sản xuất và sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc thảo
dược ngày càng tăng. Mặt khác, nguồn tài nguyên cây thuốc dồi dào và nền y học cổ
truyền lâu đời của nước ta cũng là một trong những yếu tố thuận lợi cho thuốc có
nguồn gốc từ thảo dược ngày càng được lựa chọn để sử dụng. Hiện nay, các chế phẩm
có nguồn gốc từ thảo dược được phát triển theo nhiều hướng khác nhau như các bài
thuốc gia truyền được sản xuất tại các cơ sở sản xuất của các lương y, lương dược;
các chế phẩm thuốc đông dược, thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thảo dược.
Chế phẩm đông dược, TPCN điều trị đái tháo đường trong thành phần có chứa
dược liệu có khả năng ổn định đường huyết như giảo cổ lam, dây thìa canh… Có hơn
1000 loài cây được xác định có khả kiểm soát glucose máu và ít tác dụng phụ [26],
trong đó có nhiều cây đã được nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam như giảo cổ lam,
khổ qua, quế,…[16,24,25]. Thành phần công bố của các chế phẩm này rất phong phú,
có chế phẩm thành phần chỉ gồm 1 vị dược liệu, hoặc phối hợp nhiều vị dược liệu để
tăng tác dụng. Dạng bào chế của các chế phẩm này rất đa dạng: viên nang, viên nén,
trà túi lọc, hoàn cứng, hoàn mềm, thuốc tán… Một số chế phẩm không có số đăng
ký, được sản xuất nhỏ lẻ và bán như những bài thuốc gia truyền của các lương y,
lương dược. Người dân có thể dễ dàng mua các chế phẩm tại các nhà thuốc, siêu thị,
chợ thuốc hay thậm chí là trên mạng internet.
Cho rằng sản phẩm đông dược có nguồn gốc từ thiên nhiên, gần gũi nên không
độc hại, hiệu quả điều trị được lịch sử chứng minh, ít tác dụng phụ nên nhu cầu sử

3

dụng rất lớn, giá thành thường rẻ hơn tân dược. Bên cạnh đó, tâm lý nhiều người
muốn khỏi bệnh nhanh trong khi thuốc đông dược để có hiệu quả phải sử dụng dài
ngày, nên một số đối tượng trộn lẫn tân dược vào cho công dụng được đẩy nhanh
hơn. Điều này rất nguy hiểm vì khi dùng thuốc tân dược phải theo chỉ định của bác
sỹ, sử dụng theo liều lượng nhất định. Việc trộn tân dược vào đông dược có thể sẽ
gây nên quá liều. Tân dược có thể được tán thành bột, trộn vào đông dược rồi chế
thành thành phẩm ở dạng viên, dạng cao lỏng hay dạng thuốc phiến...Tinh vi hơn, tân
dược còn được trộn vào vỏ nang, lượng trộn được tính theo liều dùng của thuốc. Nhìn
bằng mắt thường, rất khó phát hiện các loại thuốc đông dược này có trộn thêm thuốc
tân dược. Hơn nữa, việc trộn các tân dược vào đông dược rất khó phát hiện, ngay cả
khi kiểm nghiệm, vì trong đông dược có rất nhiều thành phần, đòi hỏi phương tiện
kiểm nghiệm hiện đại và tốn nhiều chi phí. Kết quả kiểm tra chất lượng của hệ thống
kiểm nghiệm trong 5 năm gần đây cho thấy số mẫu thuốc đông dược và dược liệu
không đạt chất lượng mỗi năm chiếm khoảng 10% trên tổng số mẫu lấy kiểm tra, cao
hơn nhiều so với tân dược (khoảng 3%). Viện kiểm nghiệm đã phân tích kiểm tra 2
mẫu Supai 99 Tongkat Ali Plus do Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm gửi và một số nơi
khác, kết quả 7 trong số 12 mẫu có trộn trái phép chất chống rối loạn cương dương
nhóm ức chế phosphodiestarase-5 [8].
Một số nghiên cứu ở Trung Quốc [23,29], Ả Rập [21], Nhật Bản [22] và ngay
ở Việt Nam [12] đã phát hiện thuốc tân dược đái tháo đường trộn trái phép trong chế
phẩm đông dược, TPCN. Trong các nghiên cứu đó, phát hiện thuốc tân dược điều trị
đái tháo đường thường được trộn trái phép là Metformin và nhóm Sulfonylurea. Có
thể, do 2 nhóm thuốc này được sử dụng phổ biến, rộng rãi, tác dụng mạnh; giá thành
rẻ và ít tác dụng phụ trên hệ tiêu hóa hơn các nhóm tân dược điều trị đái tháo đường
còn lại nên thường được trộn trái phép. Nên chúng tôi chọn Metformin hydroclorid
và 1 số thuốc thông dụng trong nhóm Sulfonylure để xây dựng phương pháp xác định
các chất này trộn trong chế phẩm đông dược.
1.1.2. Tổng quan về Metformin hydroclorid (MET)

4


-

Công thức hoá học: C14H11N5.HCl

-

Khối lượng phân tử: M= 165,6

-

Tên khoa học: 1,1– dimethylbiguanid hydroclorid [6].

-

Tính chất: Tinh thể trắng, dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol, thực tế

không tan trong aceton và dicloromethan. Điểm chảy từ 222oC đến 226oC [6].
-

Liều dùng: Viên nén 500 mg: Bắt đầu uống 500 mg/lần, ngày 2 lần. Tăng liều

thêm một viên mỗi ngày, mỗi tuần tăng 1 lần, tới mức tối đa là 2,5 mg/ngày [4].
-

Tác dụng và cơ chế: Thuốc có tác dụng ức chế hấp thu glucose ở ruột, tăng

nhập glucose vào tế bào, kích thích phân huỷ và ức chế tái tạo glucose. Ngoài ra còn

làm giảm lipid máu [14].
-

Tác dụng không mong muốn : thường gặp là tình trạng tăng acid lactic gây

toan máu; miệng có vị kim loại, chán ăn, nôn, buồn nôn, ỉa chảy, đầy thượng vị, táo
bón, ợ nóng; ban, mày đay, cảm thụ với ánh sáng; giảm nồng độ vitamin B12. Ít gặp
hơn là các tác dụng không mong muốn trên huyết học như: loạn sản máu, thiếu máu
bất sản, thiếu máu tan huyết, suy tuỷ, giảm tiểu cầu, mất bạch cầu hạt [14].
1.1.3. Tổng quan nhóm Sulfonylure
Đa số nghiên cứu phát hiện tân dược đái tháo đường được trộn trái phép là
sulfonylurea thế hệ II. Sulfonylure thế hệ II bao gồm: Glibenclamid, Gliclazid,
Glimepirid, Glipizid… có tác dụng nhanh, mạnh.
- Cơ chế tác dụng: kích thích trực tiếp tế bào beta đảo Langerhan của tuyến tuỵ
tăng sản xuất insulin làm giảm nồng độ glucose trong máu. Làm tăng số lượng
receptor của insulin ở các tế bào, đặc biệt là các tế bào mỡ, hồng cầu, bạch cầu đơn
nhân, do đó làm tăng tác dụng của insulin. Ức chế nhẹ tác dụng của glucagon. Thuốc
không có tác dụng khi cơ thể không còn khả năng tiết insulin [14].

5


- Tác dụng không mong muốn: Hạ glucose huyết , rối loạn tiêu hoá, vàng da ứ
mật, mỏi cơ, viêm mạch dị ứng, chóng mặt, rối loạn tâm thần, ban da, rối loạn tạo
máu…[14].
1.1.3.1. Glibenclamid (GLIB)

- Công thức hóa học: C23H28ClN3O5S
- Khối lượng phân tử: M= 494,0
- Tên khoa học:1-[[4-[2-[(5-Chloro-2-methoxybenzoyl)amido]ethyl]sulfonyl]3-cyclohexylure [6].

- Tính chất: Bột kết tinh trắng, không tan trong nước và ether, hơi tan trong
dicloromethan, khó tan trong methanol và ethanol 96%, tan trong các dung dịch kiềm
loãng. Nóng chảy ở 169oC đến 174oC [6].
- Liều dùng: Liều ban đầu từ 2,5- 5 mg mỗi ngày. Liều duy trì từ 1,25 - 10
mg/ngày. Liều tối đa là 15 mg/ngày [4].
1.1.3.2. Gliclazid (GLIC)

- Công thức hóa học: C15H21N3O3S
- Khối lượng phân tử: M= 323,4
- Tên khoa học: 1-(azabicyclo [3,3,0] oct-3-yl)-3-p-tolylsulfonylure [6]
- Tính chất: Bột kết tinh trắng hoặc hầu như trắng . Thực tế không tan trong
nước, dễ tan trong dicloromethan, hơi tan trong aceton, khó tan trong ethanol [6]

6


- Liều dùng: Có thể bắt đầu dùng với liều: 40 - 80 mg, thường dùng 80
mg/ngày và tối đa là 320 mg/ngày [4]
1.1.3.3 Glimepirid (GLIM)

- Công thức hóa học: C24H34N4O5S
- Khối lượng phân tử: M=490,6
- Tên khoa học: 1-[[4-[2-(3-Ethyl-4-methyl-2-oxo-3-pyrroline-1-carboxamido)ethyl] phenyl] sulphonyl]-3-trans-(4-methylcyclohexyl)urea [17].
- Tính chất: Bột trắng hoặc gần như trắng, không tan trong nước, tan trong
dimethylformamid, ít tan trong dicloromethan, rất ít tan trong methanol [17].
- Liều dùng: Khởi đầu 1-2mg /ngày. Duy trì 1-4mg/ ngày. Tối đa 8mg/ngày [4].
1.1.3.4 Glipizid (GLIP)

- Công thức hóa học: C21H27N5O4S
- Khối lượng phân tử: M= 445,5

- Tên khoa học:1-cyclohexyl-3-[[4-[2-[[(5-methylpyrazin-2-yl)carbonyl]amino]
ethyl] phenyl] sulphonyl] urea [17].
- Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, gần như không tan trong
nước, tan ít trong methylclorid, aceton, .... Thực tế không tan trong ethanol 96%. Hòa
tan tốt trong dung dịch kiềm [17]
- Liều dùng: Khởi đầu người lớn 5mg /ngày; người già hay người bệnh gan là
2,5 mg/ngày. Duy trì 15mg/ ngày [4]
1.1.4. Các nghiên cứu phát hiện tân dược đái tháo đường trộn trái phép trong
đông dược, TPCN

7


1.1.4.1. Trên thế giới
Hiện nay có nhiều phương pháp để xác định các tân dược trộn trong đông dược
như LC-MS/MS, HPTLC, SERS, HPLC…Các phương pháp phổ biến được tiến hành
định lượng thuốc tân dược đái tháo đường trộn trái phép trong đông dược, TPCN
tham khảo được tổng hợp trong bảng sau:
Bảng 1.1. Một số nghiên cứu xác định tân dược đái tháo đường trộn trong đông
dược trên thế giới.
Tài Nền mẫu
liệu
23

Viên nén
Viên nang
Thuốc viên
Thuốc hạt

27

Viên nén
Viên nang

Phương pháp,điều kiện phân tích
và một số kết quả
UPLC-MS/MS
Glibenclamid Điều kiện sắc ký
Metformin
- Cột C18 (50mm x 2,1mm, 1,7µm)
Rosiglitazon - Pha động: Aceonitril chứa 0,1% acid
Glimepirid
formic và nước chứa 0,1% acid formic
Phenformin
(gradient nồng độ).
Gliclazid
- Tốc độ dòng: 0,20 ml/phút
Chlorpropamid - Thể tích tiêm 10 µl
Nateglinid
Điều kiện MS
Mitiglinid
- Chế độ phát hiện MRM
Kết quả nghiên cứu
- LOQ: MET (2,15ng/ml), GLIB
(3,84ng/ml), GLIC (1,9ng/ml), GLIM
(10,9ng/ml), GLIP (4,00ng/ml).
- 14 mẫu trong 30 mẫu phát hiện trộn tân
dược đái tháo đường. Lượng GLIB được
trộn lẫn thay đổi từ 0,88- 6,78 mg/viên;
lượng MET thay đổi từ 4,33- 34,1 mg/viên

LC-MS-MS
Glibenclamid Điều kiện sắc ký
Gliclazid
- Cột Xterra MS C18 (150mm x 2,1mm,
Phenformin
5µm), tiền cột C18 (4mm x 3mm).
Glimepiride
- Pha động là hỗn hợp của acetonitril và
Metformin
dung dịch acid formic 0,05% trong nước
- Tỷ lệ pha động acetonitrile: nước= 60:40
- Tốc độ dòng 0,2 ml/phút
- Thể tích tiêm 10 µl
Điều kiện MS
-Nguồn ion hóa ESI(+)
-Chế độ phát hiện MRM
Kết quả nghiên cứu
Họat chất
phát hiện trộn

8


-LOQ: GLB (2ng/ml), GLIC (1,2ng/ml),
GLIM (3ng/ml), Phenformin (2ng/ml),
MET (5ng/ml).
- Trong 20 mẫu kiểm tra, phát hiện 5 mẫu
chứa GLIB, 3 mẫu chứa GLIC, 3 mẫu chứa
Phenformin và 2 mẫu chứa cả GLIM, MET.

29

Bột TPCN
thêm 1%
(kl/kl):
Meformin
Phenformin
Rosiglitazon
Pioglitazon

Phenformin
Metformin
Rosiglitazone
Pioglitazone

19

Viên nén
Viên nang
Thuốc viên
Thuốc hạt

Glibenclamid
Metformin
Phenformin
Rosiglitazon
Gliclazid
Glimepirid
Mitiglinid

TLC-SERS
Điều kiện TLC
- Bản mỏng Silicagel 60-F254 và HP
silicagel 60-F254
- Hệ dung môi khai triển Dicloromethan:
MeOH: Nước= 8: 2: 0,2, sau đó tiếp tục với
hệ Dicloromethan: cyclohexan: MeOH :
acid acetic= 8: 8: 0,5: 1,5.
- Bước sóng phát hiện TLC: 254 nm
Điều kiện SERS
- Nhỏ trực tiếp 6μl hỗn dịch keo bạc vào
mỗi điểm được đánh dấu trên tấm TLC.
- Phổ SERS cho mỗi điểm phân tách được
ghi bằng máy quang phổ Raman xách tay
(BWS415; B & W Tek, Mỹ): bước sóng
kích thích 785± 1nm, độ phân giải 5 cm-1,
ghi phổ từ 175- 3100 cm-1
LC-MS/MS
- Cột Agilent Zorbax SB C18 (50mm x
2,1mm, 1,8µm)
- Pha động MeOH : acetonitrile 0,01 theo
gradient
- Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút
- Thể tích tiêm: 0,4 l
RP-IPC
- Cột Diamonsil C18 (250mm x 4,4mm,
5µm)
- Pha động: Acetonitril và dung dịch chứa
1,0 mmol natri dodecyl sulfat và
triethylamin 0,1% (sử dụng acid phosphoric

điều chỉnh tới pH 3,75)
- Tốc độ dòng 0,8 ml/phút rửa giải theo
gradient
- Thể tích tiêm 20 µl
- Detector DAD, phát hiện ở UV 220 nm

9


22

Viên nén
Viên nang
Trà túi lọc
Thuốc hạt

28

Viên nang

TLC
Tolbutamid
- Pha động: n-butyl acetat có chứa 0,4 %
Acetohexamid acid formic
Chlorpropamid - Quan sát vết ở UV 254 nm
Gliclazid
- Thuốc thử phát hiện : Dragendoff, acid
Glibenclamid phosphomolybdic 10%/methanol, acid
Glimepirid
sulfuric 30%/methanol.

HPLC
- Cột Cadenza CD-C18 (75mm x 4,6 mm,
3µm)
- Pha động : acetonitril-đệm amoni acetat
theo gradient
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
- Thể tích tiêm: 10µl
- Bước sóng phát hiện: 230 nm, 247 nm
Rosiglitazon
Phenformin
Metformin
Pioglitazon
Sibutramin

SERS
- Sử dụng máy quang phổ Raman cầm tay
(i-Raman, BWTEK, USA)
- Bước sóng kích thích : 785 ± 1mm
- Ghi phổ từ 175- 3100 cm
- Độ phân giải phổ là 5cm , thời gian thu là
20s.
- Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua
(TEM)(JEM-2010, JEOL Ltd, Nhật Bản)
để thu được hình ảnh TEM.

1.1.4.2. Ở Việt Nam
Theo tài liệu chúng tôi thu thập được, nghiên cứu của Phạm Thị Tâm [12] sử
dụng phương pháp HPTLC để phát hiện và định lượng 2 loại thuốc chống đái tháo
đường tổng hợp Metformin và Glibenclamid trộn trái phép trong 41 mẫu chế phẩm
đông dược và thực phẩm chức năng. Các mẫu ở các dạng: viên nén, viên nang,

thuốc viên, thuốc tán, trà túi lọc. Chất phân tích trong mẫu thử được chiết siêu âm
bằng methanol (MeOH) và sắc ký với điều kiện: bản mỏng silica gel 60 F254, pha
động gồm n-butyl acetat - MeOH - acid formic (11: 2,5: 1,5), thể tích mẫu: 5µl,
quan sát vết ở UV 254 nm, bước sóng quét phổ để định lượng 230 nm. Kết quả, 41
mẫu âm tính với Metformin; Glibenclamid được tìm thấy từ 8 trong số 41 mẫu thu
thập được. Hàm lượng Glibenclamid được trộn lẫn thay đổi 0,18 mg/viên tới 2,21

10


mg/viên, lượng này tính theo liều dùng với 1 số mẫu là từ 1,8 mg/liều đến 2,21
mg/liều.
Vũ Ngọc Thắng và cộng sự [13] đã xây dựng phương pháp HPLC định
lượng đồng thời 6 thuốc hóa dược điều trị tiểu đường (rosiglitazon, piogliazon,
glibenclamid, glimepirid, glipizid, gliclazid) trên nền mẫu viên nang cứng bào
chế từ dược liệu có tác dụng hạ đường huyết kiểm tra không có chất nghiên cứu
với cột C18, pha động là dung dịch đệm triethylamin điều chỉnh về pH 3,4 bằng
acid phosphoric, phát hiện ở bước sóng 230 nm. Nghiên cứu này mới dừng lại
ở phần thẩm định phương pháp.
Phương pháp HPTLC có ưu điểm có thể rà soát nhanh với số lượng mẫu lớn,
xử lý mẫu đơn giản. Tuy nhiên do nền mẫu đông dược rất phức tạp, thành phần đa
dạng (biết đầy đủ thành phần- thuốc đông dược, chỉ biết thành phần chính- thực
phẩm chức năng), các thành phần trong dược liệu đi vào có thể xảy ra hiện tượng
âm tính giả HPTLC và hiện tượng dương tính giả TLC. Vì vậy chúng tôi lựa chọn
phương pháp hiện đại LC-MS/MS có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, khoảng nồng độ
tuyến tính rộng để tiến hành xác định chính xác các tân dược đái tháo đường trộn
trong đông dược.

1.2. Tổng quan về phương pháp dùng trong nghiên cứu
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.2.1.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động
lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion,
loại cỡ, ái lực… tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [1].
1.2.1.2. Nguyên tắc
Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và được cho qua cột bằng một dòng
chất lỏng liên tục (pha động). Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua

11


cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất tan với
pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển qua cột khác nhau, các thành phần của
mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng.
Cấu tạo hệ thống HPLC:

Hình 1.1. Cấu tạo hệ thống HPLC
(1). Bình chứa pha động
(2). Bơm cao áp
(3). Bộ phận tiêm mẫu
(4). Cột sắc ký
(5). Đầu dò (detector)
(6). Hệ thống thu nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu, điều khiển hệ thống
1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ
 Khái niệm
Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách
các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance
liquid chromatography – HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận
khối phổ (Mass spectrometry – MS).

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp phân tích
dụng cụ quan trọng trong phân tích thành phần và cấu trúc các chất. Phương pháp này
nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử cửa chất
đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện
trường hoặc từ trường nhất định.

12


Hình 1.2. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS
Trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển
sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hóa bằng các phương pháp thích hợp. Các
ion tạo thành được đưa vào đo trong bộ phân tích khối của máy khối phổ. Tùy theo
loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm
(-). Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được
dùng phổ biến hơn.
 Thiết bị khối phổ
- Bộ nạp mẫu: Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết bị khối
phổ. Có hai phương pháp nạp mẫu chính, tùy thuộc vào trạng thái vật lý của chất cần
phân tích:
+ Nạp mẫu dạng khí: Áp dụng đối với các chất khí, chất lỏng dễ bay hơi bằng cách
tiêm mẫu hoặc kết nối với hệ sắc ký khí (GC-MS), sắc ký lỏng (LC-MS).
+ Nạp mẫu trực tiếp: Áp dụng với các chất rắn, tinh thể…
Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký.
- Bộ nguồn ion hóa: Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử
mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion,
các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao. Ion phân tử và các
mảnh ion là các phần tử có khối lượng từ đó người ta tính được số khối z=m/e
(khối lượng ion/điện tích).
So với các kỹ thuật ion hóa đòi hỏi áp suất thấp như bắn phá nguyên tử nhanh

với dòng liên tục (Continuous Flow- Fast Atom Bombardment CF-FAB) hay tia
nhiệt (Thermospray- TS), kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric
Pressure Ionization- API) có ưu điểm hơn. Ngoài ra, API ion hóa mềm (soft

13


ionization), không phá vỡ cấu trúc hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối
phổ của ion phân tử. Với API, có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử
để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích.
Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC-MS: Ion hóa phun
điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI), Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển
(Atmospheric Pressure Chemical Ionization – APCI), Ion hóa bằng photon tại áp suất
khí quyển (Atmospheric Pressure Photonization – APPI).
Kiểu Ion hóa phun điện tử (ESI) được thực hiện ở áp suất khí quyển. Các mẫu
thử trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một ống mao quản mà ở đầu ống
này có một điện thế có thể lên đến 5000V. Đồng thời, các dung dịch mẫu này được
phun sương dưới tác động của một dòng khí. Kết quả là tạo ra các hạt mang điện tích
và được gia tốc đến điện cực. Kỹ thuật này phù hợp cho các chất phân cực, không
bền với nhiệt và nghiên cứu các phân tử sinh học có khối lượng tới 100 000 Da.

Hình 1.3. Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI
Ngoài ra, còn có nguồn ion hóa đa phương thức (MMI, Multimode ionization)
có thể vận hành, thao tác ở hai chế độ ion hóa ESI và APCI.
- Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Sau khi được tạo thành thì các ion sẽ được
gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và từ trường để đi
đến bộ phận phát hiện.
Một số bộ phân tích khối thường dùng: Tứ cực (Quadrupole), Bẫy ion (Ion trap),
Ống đo thời gian bay (Time-of-flight tube)

14


Trong đó, bộ phân tích khối Tứ cực (Quadrupole): có 4 thanh tích điện đặt song
song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau. Các ion phù hợp với tần số quét sẽ đi
thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực.

Hình 1.4. Tứ cực chập ba gập cong trong hệ máy Brucker
Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2,
Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ. Tứ cực Q1, Q3 làm nhiệm vụ phân tích
khối, tứ cực Q2 là ngăn để cho các ion va chạm, tạo ra các ion mảnh nhỏ hơn, khí
dùng cho va chạm thường là khí argon. Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này được
gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thường được dùng để khẳng định cấu trúc các chất
hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành phần.
- Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch đại
thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
- Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)
Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô và phần
mềm kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính toán, xử lý, báo
cáo, xuất dữ liệu thô vừa thu được. Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ
bao gồm :
+ Quét toàn phổ (SCAN)
Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho
khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường dùng
để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối
phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ
Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thường được sử dụng để xác định
ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất

15

+ SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring)
Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2 kỹ
thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.
 SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh
ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát
hiện.
 MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên
các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM
thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ
nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm)
thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ
3 và đưa vào đàu dò để phát hiện.
1.2.3. Một số ứng dụng của sắc ký lỏng khối phổ
Đặc tính nổi bật của LC-MS là tính chọn lọc và độ nhạy cao. Vì vậy mà khối
phổ thường được sử dụng để xác định siêu vết trong mẫu có thành phần phức tạp
như định tính, định lượng thuốc và các dạng chuyển hóa trong dịch sinh học, định
lượng dư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo quản, chất cấm trong các mẫu thực phẩm,mỹ
phẩm, dược liệu, đông dược, thủy hải sản và môi trường. Ngoài ra phương pháp khối
phổ còn có thể được sử dụng để xác định mức độ tinh khiết của chất chuẩn hoặc mẫu
chuẩn cần phân tích.

16


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn

Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu
STT

Nguyên vật liệu

Tiêu chuẩn

Nguồn gốc

Chất chuẩn
1

Metformin.HCl

Chuẩn QG

2

Glibenclamid

Chuẩn QG

3

Gliclazid

Chuẩn QG

4

Glimepirid

Chuẩn QG

5

Glipizid

Chuẩn QG

Chuẩn VKNTTW
SKS: ĐC15010 , HL: 99,99%
Độ ẩm : 0,04%
Chuẩn VKNTTW
SKS: 0103129, HL: 100,10% (HPLC),
99,70% (UV- VIS)
Độ ẩm: 0,09%
Chuẩn VKNTTW
SKS: WS.0215187.01, HL: 99,53%
Chuẩn VKNTTW
SKS: 0115320.01, HL: 99,49%
Chuẩn VKNTTW
SKS: 0107207, HL: 99,17%,
Độ ẩm: 0,10%

Dung môi, hóa chất
6

Methanol

HPLC

Merck - Đức

7

Acetonitril

HPLC

Merck - Đức

8

Acid formic

PA

Merck - Đức

9

Ether dầu hỏa

AR

Trung Quốc

10

Methanol

AR

Trung Quốc

11

Nước cất

Tinh khiết

2.1.2. Máy móc - trang thiết bị
-

Máy sắc ký lỏng khối phổ Brucker EVOQ Qube, (Mỹ)

17