Tổng hợp một số acid hydroxamic mang hợp phần 1 (triazol 4 YL) methylindolin 2 on hướng tác dụng kháng ung thư

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  -----

NGUYỄN MINH TUẤN
MSV: 1201669

TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID
HYDROXAMIC MANG HỢP PHẦN 1(TRIAZOL-4-YL)METHYLINDOLIN-2-ON
HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  -----

NGUYỄN MINH TUẤN
MSV: 1201669

TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID
HYDROXAMIC MANG HỢP PHẦN 1(TRIAZOL-4-YL)METHYLINDOLIN-2-ON
HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
NCS. Đỗ Thị Mai Dung

PGS.TS. Phan Thị Phương Dung
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được khoá luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ thầy
cô, bạn bè và một số tổ chức trong suốt quá thực hiện đề tài. Cho đến nay khi khoá
luận đã hoàn thiện, tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất
đến họ.
Đầu tiên từ tận đáy lòng mình, tôi xin phép được được gửi lời cảm ơn chân thành
và sâu sắc nhất tới GS.TS. Nguyễn Hải Nam, PGS.TS. Phan Thị Phương Dung
và NCS. Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội,
những người thầy đã tận tình dạy dỗ, hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt chặng đường
khó khăn khi thực hiện đề tài này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên
của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc,
phòng nghiên cứu cấu trúc - Đại học Quốc gia Seoul - Hàn Quốc đã giúp đỡ tạo điều
kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin được cảm ơn các anh chị, các bạn và các em cùng nghiên cứu tại bộ môn
Hoá Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, cũng như cảm ơn tập thể lớp M1K67 đã
giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài. Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn
đến anh Lê Văn Cường, em Nguyễn Văn Huân, em Mai Quang Hưng và bạn
Nguyễn Gia Anh Tuấn là những người bạn ở bên tôi lúc vui buồn đã giúp đỡ tôi rất
nhiều trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, người thân và bạn bè đã
quan tâm, động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những tình cảm và sự giúp đỡ mà người
thân và bạn bè đã dành tặng cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2017
Sinh viên
Nguyễn Minh Tuấn


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

2

1.1. Các hợp chất ức chế HDAC

2

1.1.1. Giới thiệu sơ lược về enzym HDAC

2

1.1.2. Phân loại các chất ức chế HDAC

3

1.1.3. Cấu trúc các chất ức chế HDAC

6

1.1.4. Liên quan cấu trúc tác dụng

7

1.2. Tác dụng kháng tế bào ung thư của khung triazol
1.2.1. Các hợp chất kháng tế bào ung thư mang khung triazol đã công bố

9
10

1.2.2. Vai trò của vòng triazol trong thiết kế công thức các chất ức chế HDAC 13
1.3. Các phương pháp tổng hợp khung 1,2,3-triazol bằng phản ứng Click

14

1.3.1. Tổng hợp vòng 1,2,3-triazol theo quy trình của Kolarovič

14

1.3.2. Tổng hợp vòng 1,2,3-triazol theo quy trình của Steven Lal

15

1.3.3. Tổng hợp vòng 1,2,3-triazol theo quy trình của Yan

16

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị

18
18

2.1.1. Hoá chất

18

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ

19


2.2. Nội dung nghiên cứu

19

2.2.1. Tổng hợp hóa học

19

2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các chất vừa tổng hợp được

20

2.3. Phương pháp nghiên cứu

20

2.3.1. Nghiên cứu docking

20

2.3.2. Tổng hợp hoá học

20

2.3.3. Xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được

20

2.3.4. Thử tác dụng sinh học

21

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

23

3.1. Nghiên cứu docking

23

3.2. Hoá học

24

3.2.1. Tổng hợp hoá học

24

3.2.2. Kiểm tra độ tinh khiết

33

3.2.3. Khẳng định cấu trúc

34

3.3. Thử hoạt tính sinh học

41

3.3.1. Thử tác dụng ức chế HDAC

41

3.3.2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

42

3.4. Bàn luận

43

3.4.1. Nghiên cứu docking

43

3.4.2. Tổng hợp hóa học

44

3.4.3. Khẳng định cấu trúc

47

3.4.4. Thử hoạt tính sinh học

51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

55

1.1. Về tổng hợp và khẳng định cấu trúc

55

1.2. Về hoạt tính sinh học

55

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
1

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance)

AsPC-1

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (Carbon Nuclear Magnetic
Resonance)
Dòng tế bào ung thư tuyến tuỵ

CTCL

U lympho T ở da

DCM

Dicloromethan

DMF

N,N-dimethylformamid

DMSO

Dimethyl sulfoxid

FBS

Huyết thanh bào thai bò (Fetal Bovine Serum)

FDA

Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug
Administration)

H

Hiệu suất phản ứng

HAT

Histon acetyltransferase

HDACi

Histon deacetylase inhibitors

HDAC

Histon deacetylase

HRMS

Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectrometry)

MS

Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

IC50

Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration)

IR

Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

MeCN

Acetonitril

MeOH

Methanol

PC-3

Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt

SAHA

Acid sulberoylanillid hydroxamic

SW620

Dòng tế bào ung thư đại tràng

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TCTH

Tiêu chuẩn tổng hợp

t-BuOH

tert-Butanol

THF

Tetrahydrofuran

13

C-NMR


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1.

So sánh IC50 của các chất có vòng 1,2,3-triazol so với SAHA

Bảng 1.2.

Khảo sát hiệu suất phản ứng tổng hợp vòng 1,2,3-triazol đi từ
azid và alkyl bằng phản ứng Click, xúc tác [CuBr(PPh3)3] với

13

15

một số dung môi thông dụng
Bảng 1.3.

Khảo sát hiệu suất phản ứng tổng hợp vòng 1,2,3-triazol đi từ
azid và alkyl bằng phản ứng Click, xúc tác muối đồng với một số

16

dung môi thông dụng
Bảng 2.1.

Bảng liệt kê danh sách các hoá chất sử dụng trong đề tài

18

Bảng 2.2.

Quá trình thử độc tính tế bào

22

Bảng 3.1.

Kết quả docking của các dẫn chất VIa-f với HDAC2

23

Bảng 3.2.

Khảo sát thời gian phản ứng tạo II1

26

Bảng 3.3.

Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic

33

Bảng 3.4.

Giá trị Rf và nhiệt độ nóng

34

Bảng 3.5.

Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất VIa-f

35

Bảng 3.6.

Kết quả phân tích phổ MS của các dẫn chất VIa-f

36

chảy (tonc)

của các chất VIa-f

1

Bảng 3.7.

Kết quả phân tích phổ H-NMR của các dẫn chất VIa-f

37

Bảng 3.8.

Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các dẫn chất VIa-f

39

Bảng 3.9.

Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất VIa-f

41

Bảng 3.10. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư

42

Bảng 3.11. So sánh sự tương quan giữa năng lượng tương tác dự đoán với
tác dụng ức chế HDAC2

43


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1.

Vai trò của HAT và HDAC trong điều hoà biểu hiện của gen

2

Hình 1.2.

Một số acid hydroxamic ức chế HDAC

4

Hình 1.3.

Một số aminobenzamid ức chế HDAC

4

Hình 1.4.

Một số muối carboxylat ức chế HDAC

4

Hình 1.5.

Cấu trúc của depsipeptid

5

Hình 1.6.

Một số epoxyceton ức chế HDAC

5

Hình 1.7.

Cấu trúc của CHAP 31

6

Hình 1.8.

Mô hình mô tả cấu trúc chung của hợp chất ức chế HDAC tương

6

ứng với cấu trúc của SAHA
Hình 1.9.

Các dẫn chất amid ngược của SAHA

8

Hình 1.10.

Mô hình ZBG của Vanommeslaeghe

8

Hình 1.11.

Một số chất ức chế sốc nhiệt protein mang khung triazol

10

Hình 1.12.

Cấu trúc của combretastatin A-4 và chất 1

11

Hình 1.13.

Cấu trúc của một số thuốc ức chế aromatase mang khung triazol

11

Hình 1.14. Cấu trúc chung của chất 2

12

Hình 1.15.

Cấu trúc chung của chất 3

12

Hình 3.1.

Hình ảnh docking của dẫn chất VIc

24

Hình 3.2.

Phổ IR của chất VIa

48

Hình 3.3.

Phổ MS của chất VIc

48

Hình 3.4.

Phổ 1H-NMR của chất VIc

50

Hình 3.5.

Phổ 13C-NMR của chất VIa

51

Hình 3.6.

Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất

53

VIa-f trên các dòng tế bào SW620, PC-3 và AsPC-1


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 1.1.

Quy trình tổng hợp vòng 1,2,3-triazol của Kolarovič

14

Sơ đồ 1.2.

Quy trình tổng hợp vòng 1,2,3-triazol của Steven Lal

15

Sơ đồ 1.3.

Quy trình tổng hợp vòng 1,2,3-triazol của Yan

16

Sơ đồ 3.1.

Quy trình tổng hợp chung

24

Sơ đồ 3.2.

Quy trình tổng hợp chất II1

25

Sơ đồ 3.3.

Quy trình tổng hợp chất IVa

26

Sơ đồ 3.4.

Quy trình tổng hợp chất Va

28

Sơ đồ 3.5.

Quy trình tổng hợp chất VIa

30

Sơ đồ 3.6.

Cơ chế phản ứng tạo thành IVa-d

44

Sơ đồ 3.7.

Cơ chế phản ứng Click tạo thành Va-f

45

Sơ đồ 3.8.

Cơ chế phản ứng tạo thành VIa-f

46

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong 20 năm trở lại đây, các thuốc làm chết tế bào ung thư “nhắm tới phân tử
đích” là một trong những hướng điều trị mà nhiều nhà khoa học hướng tới. Các mục
tiêu phân tử điển hình đang được nghiên cứu như: protein kinase (khóa thụ thể HER1,
HER2, Bcr-Abl…), histon deaceylase (HDAC), telomerase… Trong đó enzym HDAC
là một trong những mục tiêu phân tử rất được quan tâm hiện nay. Một số chất ức chế
enzym HDAC rất hữu hiệu đã được sử dụng trong việc điều trị ung thư như: SAHA
(Zolinza®) (tác nhân ức chế HDAC đầu tiên được FDA cấp phép trong điều trị u
lympho tế bào T dưới da). Không lâu sau romidepsin (Istodax®), belinostat
(Beleodaq®) và panobinostat (Farydax®) cũng đã được FDA lần lượt cấp phép sử dụng
trong điều trị ung thư.
Trên cơ sở cấu trúc của một số chất ức chế HDAC đã được công bố trên thế giới,
nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hoá Dược – trường Đại Học Dược Hà Nội đã tiến hành
thiết kế và tổng hợp, cũng như công bố các dãy chất với đích tác dụng là HDAC. Các
dẫn chất thu được cho thấy hoạt tính kháng tế bào ung thư rất tốt [2, 8, 28]. Đặc biệt
phải kể đến các acid hydroxamic được GS.TS. Nguyễn Hải Nam và nhóm nghiên cứu
thiết kế và tổng hợp mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol. Chúng có tác dụng ức chế
HDAC tốt hơn gấp nhiều lần so với SAHA [28]. Từ các nghiên này có thể thấy rằng
các hợp chất của acid hydroxamic hướng ức chế HDAC mang nhóm nhận diện bề mặt
là dị vòng thơm, sẽ cho hoạt tính in vitro rất khả quan. Tiếp tục hướng nghiên cứu này
chúng tôi tiếp tục thiết kế và tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic mang hợp phần
1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on và tiến hành đề tài “Tổng hợp một số acid
hydroxamic mang hợp phần 1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on hướng tác dụng
kháng ung thư” với 2 mục tiêu:
1. Tổng hợp N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H1,2,3-triazol-1-yl)butanamid và 5 dẫn chất.
2. Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất đã tổng hợp được.

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Các hợp chất ức chế HDAC
1.1.1. Giới thiệu sơ lược về enzym HDAC
Sự điều hoà biểu hiện của gen phụ thuộc vào các enzym: kinase, methyltransferase,
histon actyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) do sự tác động của chúng
lên phần đuôi histon của nhiễm sắc thể (NST) [16].

Hình 1.1. Vai trò của HAT và HDAC trong điều hoà biểu hiện của gen
Histon acetyltransferase (HAT) là nhóm các enzym acetyl hoá ε-NH2 của lysin
(đầu N) gây trung hoà điện tích dương trên lysin, làm giảm đi khả năng tương tác với
ADN (mang điện tích âm), tạo ra cấu trúc mở chromatin. Đây là enzym khởi đầu cho
quá trình phiên mã và dịch mã [25] (xem hình 1.1).
Histon deacetylase (HDAC) là các enzym có chức năng đối lập với HAT. Chúng
gây deacetyl hoá nhóm acetyl ở đầu N của lysin trên histon, làm cho nhiễm sắc thể đóng
xoắn và ức chế quá trình phiên mã [12] (xem hình 1.1).
Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng HDAC không chỉ liên quan đến cấu trúc
của chromatin và sự biểu hiện của gen mà sự biểu hiện quá mức của HDAC còn tác động
đến tiến trình ung thư, bao gồm sự hình thành của các khối u ác tính [41]. Chính vì vậy
ức chế HDAC trong điều trị một số bệnh ung thư như: ung thư biểu mô thận, ung thư
biểu mô vảy ở đầu và cổ, u trung biểu mô, u lympho tế bào B và T… đã đạt được hiệu
quả rất tốt.
Cấu trúc của HDAC
Việc xác định cấu trúc của phân tử HDAC là vô cùng quan trọng trong việc tìm hiểu
về cơ chế tác dụng và dựa trên cơ sở đó để thiết kế công thức cho các chất ức chế HDAC.
Sử dụng phương pháp kết tinh và chụp tia X đã giúp tìm ra cấu trúc tinh thể của các

2


HDAC khác nhau, từ đó chỉ ra rằng các HDAC đều có trung tâm hoạt đồng gồm 2 phần

chính: ion Zn2+ và kênh enzym dạng túi hình ống [4].
 Ion Zn2+ là một coenzym của HDAC, được tìm thấy ở đáy của túi enzym. Trong
phân tử HDAC, ion Zn2+ có thể tạo 5 liên kết phối trí: 1 liên kết với với nguyên tử oxy
của nhóm acetyl-lysin ở đầu N của histon, có vai trò xúc tác tách loại acetyl và 4 liên
kết với các nguyên tử oxy, nitơ của các acid amin. Cơ chế ức chế HDAC của các acid
hydroxamic là tạo 2 liên kết phối trí với ion Zn2+, ngăn cản ion Zn2+ hình thành liên kết
phối trí với oxy của nhóm acetyl-lysin ở đầu N của histon để thực hiện vai trò
xúc tác [4].
 Kênh enzym có dạng túi hẹp hình ống, tạo ra nhiều liên kết Van der Waals với
cơ chất. Túi được tạo thành từ các acid amin thân lipid: phenylalanin, tyrosin, prolin,
histidin. Đáy túi có một vài phân tử nước làm nhiệm vụ vận chuyển nhóm acetyl trong
phản ứng deacetyl hoá, ngoài ra còn có vai trò tham gia tạo liên kết hydro khi không có
mặt nhóm -OH của tyrosin. Cấu trúc của túi vô cùng linh động có thể biến đổi sao cho
phù hợp với chiều dài của các cơ chất khác nhau. Chiều rộng của túi được giới hạn bởi
2 vòng thơm được tìm thấy ở cùng một vị trí ở nhiều HDAC khác nhau. Trên miệng túi
có một vài vòng xoắn protein tạo thành một cái vành nhỏ. Vành nhỏ trên miệng túi sẽ
tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của chất ức chế HDAC [4].
Phân loại các HDAC
 Có 18 loại HDAC đã được xác định và được chia thành 4 nhóm [12, 13]:
Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8.
Nhóm II: HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC9, HDAC10.
Nhóm III: Sirtuin (SIRT) 1-7.
Nhóm IV: HDAC11.
Trong đó nhóm III là các HDAC phụ thuộc NAD+ (nicotinamid adenin) còn nhóm
I, II, IV là các HDAC phụ thuộc Zn2+.
1.1.2. Phân loại các chất ức chế HDAC
Từ năm 1990, khi Yoshida lần đầu tiên tìm ra tác dụng ức chế HDAC của
trichostatin A (TSA) [34], đến nay trên thế giới các nhà khoa học đã tìm ra khoảng 6
nhóm hợp chất được phân loại dựa trên cấu trúc hoá học gồm [32, 39]:

3


(1) Các acid hydroxamic: Trichostatin A (TSA) là acid hydroxamic đầu tiên được
tìm thấy có tác dụng ức chế HDAC [9], cho đến nay TSA vẫn là một trong số rất ít
chất có tác dụng ức chế HDAC mạnh, nhưng do chi phí sản xuất TSA quá cao và hiệu
suất tổng hợp thấp, nên các nhà khoa học lại tiếp tục tìm kiếm thay thế. Hiện tại thì
FDA đã phê duyệt cho 3 dẫn chất hydroxamic có tác dụng ức chế trong điều trị ung
thư: SAHA (2006), belinostat (2014) và panobinostat (2015).

Hình 1.2. Một số acid hydroxamic ức chế HDAC
(2) Các aminobenzamid: Năm 1999, các dẫn chất benzamid có tác dụng ức chế
HDAC in vitro và in vivo được công bố bởi Suzuki và cộng sự. Trong đó có MS-275
có tác dụng ức chế HDAC1, HDAC2 và HDAC3 ở nồng độ μM. MGCD0103 là
benzamid thể hiện tác dụng ức chế chọn lọc trên HDAC nhóm I và IV, không có tác
dụng trên HDAC nhóm II [26].

Hình 1.3. Một số aminobenzamid ức chế HDAC
(3) Các muối carboxylat mạch ngắn: các muối butyrat, phenylbutyrat, acid valproat,
là các chất ức chế HDAC tương đối yếu (có tác dụng ở nồng độ mM) [20].

Hình 1.4. Một số muối carboxylat ức chế HDAC

4


(4) Các peptid vòng: depsipeptid, apicidin, và peptid chứa nhóm hydroxamic.
Trong đó depsipeptid đã được FDA cấp phép cho điều trị u lympho T ở da (CTCL)
tháng 11 năm 2009. Depsipeptid ở dạng tiền thuốc, khi vào tế bào được chuyển hoá
thành dạng chứa nhóm sulfhydryl hoạt động, có khả năng gắn Zn2+ ức chế HDAC, đặc

biệt là HDAC1 và HDAC2 [11].

Hình 1.5. Cấu trúc của depsipeptid
(5) Các epoxyceton: trapoxin B, HC-toxin và acid 2-amino-8-oxo-9,10epoxydecanoic (AOE), có khả năng hoạt động nhờ việc thay đổi vị trí hoạt động ái nhân
với nhóm epoxy và hình thành liên kết hydro với nhóm ceton. Việc loại trừ ceton, hay
thay ceton bằng alcol, làm mất hoạt động của những phân tử này. Sự phối hợp của peptid
vòng và epoxyceton dẫn đến ức chế hoạt động của HDAC ở nồng độ cỡ nM [7].

Hình 1.6. Một số epoxyceton ức chế HDAC
(6) Các phân tử lai: CHAP31 và CHAP50, có cấu trúc peptid vòng gắn với
hydroxamat no mạch thẳng, có cơ chế hoạt động có thể đảo chiều và khả năng ức chế
tương đối tốt, khoảng nồng độ hoạt động tối ưu trong khoảng 1-5 nM. Cầu nối tối ưu nhất
trong các nghiên cứu này đều có 5 nhóm methylen, giống như những mô tả trước đó của
các hydroxamat khác [7].

5


Hình 1.7. Cấu trúc của CHAP 31
1.1.3. Cấu trúc các chất ức chế HDAC
Cấu trúc chung của một hợp chất ức chế HDAC có 3 phần chính [10] (hình 1.8):

Hình 1.8. Mô hình mô tả cấu trúc chung của hợp chất ức chế HDAC tương ứng với
cấu trúc của SAHA
Phần 1: Nhóm nhận diện bề mặt (SRG) hay còn gọi là nhóm khóa hoạt động
(cap group): thường là các peptid vòng hoặc vòng thơm, có vai trò tham gia vào
quá trình nhận diện bề mặt amino acid.
Phần 2: Vùng cầu nối (linker) sẽ thường sử dụng các nhóm sơ nước gồm: các
hydrocarbon thân dầu mạch thẳng hay vòng, no hoặc không no có vai trò trong việc
tạo liên kết Van der Waals với kênh enzym.

Phần 3: Nhóm kết thúc gắn kẽm (ZBG) có thể là các acid hydroxamic, nhóm
o-aminoanilin của benzamid, các thiol… Nhóm này có vai trò gắn với kẽm tại đáy của
túi enzym.

6


Một số nghiên cứu cho thấy các chất ức chế HDAC thuộc nhóm acid hydroxamic
còn có thể có thêm nhóm liên kết (connecting unit) có nhiệm vụ kết nối nhóm nhận diện
bề mặt với vùng cầu nối sơ nước như nhóm amid ở SAHA [12].
1.1.4. Liên quan cấu trúc tác dụng
1.1.4.1. Ảnh hưởng của nhóm nhận diện bề mặt
Dựa trên cấu trúc phân tử của SAHA được Cục vệ sinh an toàn Thực phẩm và
Dược phẩm của Mỹ (FDA) cấp phép lưu hành để điều trị ung thư, Julave và cộng sự
đã nhận định rằng: Việc có mặt nhóm phenyl ở vùng nhận diện bề mặt sẽ làm tăng
hoạt tính của dẫn chất. Nếu thêm một nhóm thế thân nước trên phần cầu nối gần nhóm
phenyl cũng sẽ làm tăng hoạt tính nhưng nếu có mặt một nhóm thế thân nước ngay sát
nhóm acid hydroxamic sẽ gây ảnh hưởng ngược lại. Trong nghiên cứu cũng cho thấy,
nếu thêm vào các nhóm thế có mật độ electron cao như phenyl ở vùng khoá hoạt động
sẽ làm hoạt tính tăng lên [18].
Năm 2005, Guo cùng cộng sự đã tiến hành một khảo sát về hoạt tính ức chế của dãy
hợp chất indol amin đối với HDAC1 và nhận định rằng: Khi ở vùng miệng túi nhóm
indol amin sẽ tạo liên kết với protein bề mặt, qua việc hình thành liên kết hydro giữa
-COO- của Asp99 và nhóm -NH- amid của phối tử và của nhân indol. Một số nhóm thế
ở vị trí gần vòng indol tạo ra liên kết hydro, như nhóm -NH- amid sẽ làm cải thiện hoạt
tính ức chế HDAC. Khi thêm vào một nhóm thế có kích thước không gian lớn vào vị trí
số 4 trên vòng indol, ví dụ như -OCH3 sẽ làm tăng cao hoạt tính hơn so với không có
nhóm thế [14].
Những hợp chất không có nhóm khoá hoạt động sơ nước cho hoạt tính yếu [36].
1.1.4.2. Ảnh hưởng của vùng cầu nối

Yếu tố 1: Ảnh hưởng của chiều dài cầu nối
Vùng hoạt động của HDAC có dạng túi kỵ nước, độ dài từ 4 C đến 6 C, kích thước
hẹp. Ở đáy túi là ion Zn2+ vì vậy chiều dài của cầu nối đóng vai trò quan trọng trong
tác dụng ức chế chọn lọc của HDACi. Chiều dài phù hợp sẽ đưa nhóm khoá hoạt động
đến gắn với Zn2+ và ở vị trí phù hợp để tạo liên kết với acid amin bề mặt. Các chất ức
chế HDAC nếu có vùng cầu nối dài từ 4-6 C cho hoạt tính HDAC tốt hơn [15].
Năm 2009, Andrianov và cộng sự đã thiết kế và tổng hợp khoảng 40 dẫn chất amid
ngược (AH8) của SAHA (hình 1.9) [3].

7


Hình 1.9. Các dẫn chất amid ngược của SAHA
Trong khoảng 40 dẫn chất có những chất có hoạt tính ức chế tương tự như HDAC
nhưng có những chất tác dụng còn mạnh hơn SAHA. Từ kết quả nghiên cứu và kết
quả thống kê cho thấy các chất có cầu nối 5-6 C thì cho hoạt tính tốt hơn.
Yếu tố 2: Ảnh hưởng của mạch thẳng và mạch vòng
Di Micco và nhóm nghiên cứu của ông đã chứng minh được trong kênh enzym của
HDAC có hai nhóm phenylalanin tham gia vào quá trình acetyl hóa lysin của histon.
Nhóm đã nghiên cứu docking nhiều hợp chất có cầu nối mạch thẳng và cầu nối vòng
thơm để xác định cấu trúc cầu nối phù hợp tạo tương tác với hai nhóm phenylalanin
trong HDAC. Kết quả cho thấy các HDACi có cầu nối vòng thơm cho ái lực mạnh với
đích, do vòng thơm tạo liên kết π-π với hai nhóm phenylalanin [6].
1.1.4.3. Ảnh hưởng của nhóm kết thúc gắn kẽm
Nghiên cứu của Vanommeslaegh đã chỉ ra cấu trúc của nhóm kết thúc gắn kẽm
gồm 5 phần chính (hình 1.10) [37].

Hình 1.10. Mô hình ZBG của Vanommeslaegh

8

- Phần A: mang đôi electron tự do, có thể tạo liên kết hydro với hydro trong nhóm
OH của tyrosin, đồng thời tạo phức chelat với ion Zn2+. Mặt khác A cũng có thể chứa
hydro (để nhận điện tử từ oxy trong nhóm phenol của tyrosin, tạo liên kết hydro).
- Phần B: nối với vùng cầu nối, do đó B phải tạo ra tối thiểu 3 liên kết.
- Phần C: chứa hydro linh động, hình thành liên kết hydro với His132.
- Phần D: có vai trò nhường proton cho His131, hình thành liên kết tĩnh điện với
His131 và tạo chelat mạnh với Zn2+.
- Phần L: vùng cầu nối.
Nghiên cứu của Kalyaanamoorthy chỉ ra rằng dạng acid của acid hydroxamic ức
chế các HDAC1 tốt hơn so với dạng muối của acid hydroxamic (hydroxamat) vì tạo
được nhiều liên kết hydro hơn [19].
1.1.4.4. Một số yếu tố khác ảnh hưởng tới hoạt tính của các HDACi
Nếu năng lượng solvat hóa của phân tử tăng lên sẽ làm cho hoạt tính ức chế HDAC
giảm xuống [42].
Nhóm phân tử có tính thân dầu sẽ làm tăng khả năng ức chế, nhưng nếu kích thước phân
tử quá lớn lại làm giảm hoạt tính. Phân tử quá thân dầu hoặc những phân tử chứa nhiều
vòng 6 cạnh thì hoạt tính sẽ không quá cao, do có ảnh hưởng của hiệu ứng không gian. Độ
thân nước - thân dầu nên ở mức cân bằng để tạo ra hoạt tính ức chế HDAC6 [22].
Khi phân tử có xu hướng cầu hóa để đạt đươc trạng thái bền vững, sẽ làm thu nhỏ
diện tích vùng cho dung môi thâm nhập, do các nhóm thân nước bị che khuất. Phân tử
có cấu trúc càng mở thì sẽ có hoạt tính càng cao [38].
Cấu trúc gấp khúc là điều kiện tiên quyết cho tác dụng ức chế chọn lọc HDAC nhóm
2, phân tử có dạng thẳng sẽ cho tác dụng ức chế chọn lọc trên HDAC nhóm 1 [31].
1.2. Tác dụng kháng tế bào ung thư của khung triazol
Sự biến đổi cấu trúc hoá học của các loại thuốc chống ung thư hiện nay rất đa dạng,
thuận tiện để tạo ra nhiều tác nhân chống ung thư mới. Vòng triazol với nhiều tác dụng
sinh học cũng đã được đưa vào cấu trúc hoá học của một số lượng lớn các hợp chất
chống ung thư, trong đó có nhiều hợp chất đã tổng hợp cho thấy hoạt tính rất cao.

9


1.2.1. Các hợp chất kháng tế bào ung thư mang khung triazol đã công bố
Theo các tài liệu tham khảo được, các hợp chất mang vòng triazol có thể gây độc
nhiều dòng tế bào ung thư thử nghiệm theo nhiều cơ chế khác nhau như: ức chế sốc
nhiệt protein (heat shock protein), ức chế sự trùng hợp vi ống (microtubule
polymerization), ức chế men thơm hoá (aromatase), ức chế HDAC và một số cơ chế
khác [44].
1.2.1.1. Các chất ức chế sốc nhiệt protein mang khung triazol
Sốc nhiệt protein đã được chứng minh, là một trong những đích có giá trị và hấp
dẫn với các nhà khoa học trong công cuộc tìm ra các tác nhân chống ung thư, do sự đa
dạng của chúng trong các tế bào khối u. Kết quả cho thấy sự kết hợp với vòng triazol
sẽ làm tăng cường hoạt động kháng tế bào ung thư [44].
Một số hoạt chất dưới đây có khả năng ức chế tế bào ung thư mang khung triazol
theo cơ chế ức chế sốc nhiệt protein (xem hình 1.11).

Hình 1.11. Một số chất ức chế sốc nhiệt protein mang khung triazol
1.2.1.2. Các chất ức chế trùng hợp vi ống mang khung triazol
Combretastatin A-4 là một hợp chất thuộc nhóm phenol tự nhiên có khả năng ức
chế trùng hợp vi ống nhưng không thể hiện được hiệu quả trong cơ thể do độ hấp thu
kém, độ hoà tan thấp và quan trọng nhất là do hiện tượng đồng phân hoá chuyển từ
dạng cis sang dạng trans không có hoạt tính. Do vậy trong một nghiên cứu gần đây,
nhóm etylenic trong combretastatin A-4 được thay bằng vòng 1,2,3-triazol, thu được
hợp chất 1 có hoạt tính mạnh hơn hẳn so với combretastatin A-4 do làm mất khả năng
đồng phân hoá [44].

10

Combretastatin A-4

1

Hình 1.12. Cấu trúc của combretastatin A-4 và chất 1
1.2.1.3. Các chất ức chế men thơm hoá mang khung triazol
Các thuốc chống ung thư như letrozol, anastrozol và vorozol đều là các hợp chất
mang khung triazol có khả năng ức chế aromatase được sử dụng trong điều trị ung thư
lâm sàng. Nghiên cứu cho thấy vai trò của vòng triazol khi liên kết với hem của
aromatase là thiết yếu cho hoạt tính kháng tế bào ung thư [44].

Hình 1.13. Cấu trúc của một số thuốc ức chế aromatase mang khung triazol
1.2.1.4. Các chất ức chế HDAC mang khung triazol
Như chúng ta đã biết, acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) là một chất có vai
trò quan trọng trong điều trị ung thư. Việc thiết kế thêm vòng 1,2,3-triazol vào nhóm
nhận diện bề mặt của SAHA có thể tạo ra các hợp chất với hoạt tính ức chế tế bào ung
thư mạnh hơn SAHA.
Ví dụ, trong nghiên cứu của Zhou năm 2012, hợp chất 2a mang khung 1,2,3-triazol
đã thể hiện khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tuỵ (MiaPaca2) trên in vitro với giá trị IC50 = 0,02 mM. Hợp chất 2b cũng cho thấy khả năng ức chế
tế bào ung thư biểu mô tuyến tuỵ (HupT3) (IC50 = 0,05 mM) mạnh hơn SAHA (IC50
= 0,8 mM) 16 lần [44].

11


2
Hình 1.14. Cấu trúc chung của chất 2
Một ví dụ khác là nghiên cứu của Nahrwold năm 2010 đã chỉ ra sự tương đương
hoạt tính sinh học giữa vòng 1,2,3-triazol với liên kết amid. Để chứng minh điều này,

nhóm nghiên cứu của ông đã tiến hành thay thế nhóm amid trong phân tử của
cryptophycin-52 (3a) bằng vòng 1,2,3-triazol để thu được hợp chất 3b. Kết quả thu được
là hợp chất 3b có IC50 = 0,0032 μM xấp xỉ giá trị IC50 của cryptophycin-52 [27].

3
Hình 1.15. Cấu trúc chung của chất 3
Năm 2008, nghiên cứu của Chen và cộng sự cho thấy tác dụng ức chế tế bào
DU-145 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt) của các dẫn chất hydroxamic mang khung
1,2,3-triazol mạnh hơn nhiều lần so với SAHA, kết quả được trình bày ở bảng 1.1 [5].

12


Bảng 1.1. So sánh IC50 của các chất có vòng 1,2,3-triazol so với SAHA
Aryltriazolylhydroxamat

IC50
(nM)

9,6

1,8

2,3

2,1

65,0

Từ các kết quả nghiên cứu trên có thể thấy rằng, vai trò đáng kể của vòng triazol

trong việc tương tác với đích tác dụng, làm tăng hiệu quả điều trị ở nhiều nhóm hợp
chất chống ung thư khác nhau.
1.2.2. Vai trò của vòng triazol trong thiết kế công thức các chất ức chế HDAC
Theo nghiên cứu của Chen năm 2008, vòng triazol có hai vai trò chính [5]:
- Tạo điều kiện để nhóm hoạt động bề mặt liên kết mạnh hơn với đầu N ở phía
ngoài (túi enzym) tại vị trí hoạt động của HDAC2.
- Đóng vai trò là nhóm đẳng cấu điện tử sinh học của amid (bio-isosteric).
Theo một nghiên cứu khác, Pirali và các cộng sự đã làm rõ vai trò của vòng triazol bằng
việc thay thế nhóm amid trong công thức của SAHA bằng hợp phần này. Nghiên cứu này
cho thấy vòng triazol có vai trò là nhóm đẳng cấu điện tử sinh học của nhóm amid trong
phân tử SAHA (vòng triazol không làm thay đổi đáng kể cấu trúc hoá học nhưng lại có thể

13


tăng cường được tính chất sinh học và sự bền vững hoá học) [30]. Về mặt hoá học, nhóm
amid dễ biến đổi và kém bền hơn so với vòng triazol. Ngoài ra phản ứng tổng hợp amid
khó khăn hơn phản ứng Click tổng hợp vòng triazol.
Từ những kết quả nghiên cứu trên, cho thấy việc thêm khung triazol vào thiết kế
công thức sẽ tạo thuận lợi hơn cho quá trình tổng hợp, tạo ra các hợp chất bền hơn về
mặt vật lý và vẫn có hiệu lực ức chế HDAC tốt.
1.3. Các phương pháp tổng hợp khung 1,2,3-triazol bằng phản ứng Click
1.3.1. Tổng hợp vòng 1,2,3-triazol theo quy trình của Kolarovič
Kolarovič cùng cộng sự đã đưa ra quy trình tổng hợp (sơ đồ 1.1) [21].

Sơ đồ 1.1. Quy trình tổng hợp vòng 1,2,3-triazol của Kolarovič
Nguyên liệu đầu đi từ các acid alk-2-ynoic và aryl iodid được hoà tan trong hỗn
hợp dung môi DMSO/H2O, ở nhiệt độ khoảng 65oC trong vòng 24 h. Phản ứng dựa
trên việc nối sản phẩm decarboxyl của acid alk-2-ynoic với một azid tạo ra vòng 1,2,3triazol nhờ xúc tác Cu(I) (được khử từ CuSO4 với natri ascorbat). Phản ứng trên đây
bao gồm ba bước, không có các quá trình xử lý trung gian, sản phẩm tạo ra có độ tinh

khiết và hiệu suất cao.
Bước 1: Cu(I) xúc tác cho quá trình decarboxyl hoá acid alkynoic tạo ra sản phẩm
là một alkyn đầu mạch.

Bước 2: Thực hiện phản ứng thế ái nhân giữa một dẫn xuất halogen với azid là
NaN3 để tạo ra sản phẩm là hợp chất có dạng R2-N3.

14


Bước 3: Thực hiện phản ứng đóng vòng Click giữa hai sản phẩm của bước 1 và
bước 2 để tạo thành khung 1,2,3-triazol.

1.3.2. Tổng hợp vòng 1,2,3-triazol theo quy trình của Steven Lal

Sơ đồ 1.2. Quy trình tổng hợp vòng 1,2,3-triazol của Steven Lal
Steven Lal cùng cộng sự đã tiến hành thực hiện các thử nghiệm để tìm ra ưu nhược
điểm của xúc tác [CuBr(PPh3)3]. Bắt đầu đi từ azid và một alk-1-yn bằng phản ứng
đóng vòng với xúc tác Cu(I) được cung cấp từ phức [CuBr(PPh3)3]. Sản phẩm có độ
tinh khiết cao, dễ tinh chế, phản ứng này diễn ra ngay ở nhiệt độ thường, có thể tiến
hành trong nhiều loại dung môi khác nhau. Kết quả thu được ở bảng 1.2 [23].
Bảng 1.2. Khảo sát hiệu suất phản ứng tổng hợp vòng 1,2,3-triazol đi từ azid và
alkyl bằng phản ứng Click, xúc tác [CuBr(PPh3)3] với một số dung môi thông dụng
Hiệu suất

STT

Dung môi

[Cu](mol%)

Thời gian (giờ)

1

Nước/t-BuOH

5

2

> 95

2

Aceton

5

6

> 95

3

Ethanol

5

8

70

4

MeCN

5

6

> 95

5

DMSO

5

3

> 95

6

Nước

5

2

> 95

15

(%)


Từ bảng 1.2 cho thấy, khi sử dụng các dung môi phân cực đa phần đều cho hiệu
suất cao và thời gian phản ứng rút ngắn, ngoại trừ ethanol. Đáng chú ý nhất là kết quả
thử nghiệm với dung môi nước, một dung môi thông dụng, không độc hại, chỉ cần tiến
hành trong khoảng thời gian ngắn ( 2 h) nhưng hiệu suất rất cao (> 95%).
1.3.3. Tổng hợp vòng 1,2,3-triazol theo quy trình của Yan

Sơ đồ 1.3. Quy trình tổng hợp vòng 1,2,3-triazol của Yan
Yan và cộng sự đã tiến hành tối ưu hoá phản ứng đóng vòng 1,2,3-triazol với xúc tác
được khảo sát là các loại muối đồng I và II. Tất cả các phản ứng đều được thực hiện với
2,0 mmol triethylamin; 1,2 mmol diethylamin; 1,2 mmol propargyl bromid; 1,0 mmol azid
và 10% mol chất xúc tác tại nhiệt độ phòng. Kết quả khảo sát thể hiện ở bảng 1.3 [43].
Bảng 1.3. Khảo sát hiệu suất phản ứng tổng hợp vòng 1,2,3-triazol đi từ azid và
alkyl bằng phản ứng Click, xúc tác muối đồng với một số dung môi thông dụng
STT

Xúc tác

Thời gian

Hiệu suất

(giờ)

(%)

Dung môi

1

CuSO4

H2O-t-BuOH (1:1)

13

70

2

CuSO4

H2O

14

40

3

CuSO4

H2O-THF (1:1)

14

61

4

CuBr

H2O

10

84

5

CuCN

H2O

10

80

6

CuI

H2O

10

88

7

CuI

H2O-THF(1:1)

10

89

8

CuI

H2O-DMF(1:1)

10

85

9

CuI

THF

10

86

16