Đánh giá khả năng bảo vệ vi sinh vật của vi nang calci alginat bao chitosan

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ KIM LANH
MÃ SINH VIÊN: 1201306

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO VỆ VI
SINH VẬT CỦA VI NANG CALCI ALGINAT BAO CHITOSAN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ KIM LANH
MÃ SINH VIÊN: 1201306

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO VỆ VI
SINH VẬT CỦA VI NANG CALCI ALGINAT BAO CHITOSAN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Đàm Thanh Xuân
2. DS. Nguyễn Thị Ngọc
Nơi thực hiện
Bộ môn Công nghiệp dược

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại tổ Vi sinh - Bộ môn Công
nghiệp Dược. Trong thời gian thực hiện khóa luận, em đã nhận được rất nhiều sự
quan tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình.
Với tất cả sự kính trọng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới cô
giáo TS. Đàm Thanh Xuân đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện từ
những ngày đầu đến khi em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn DS. Nguyễn Thị Ngọc đã đóng góp nhiều ý kiến
quý báu, luôn động viên và tận tình giúp đỡ em thực hiện đề tài này.
Đồng thời, em cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo,
các anh chị kĩ thuật viên trong Bộ môn Công Nghiệp Dược trong suốt quá trình làm
đề tài nghiên cứu và thực hiện tại bộ môn.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên giúp
đỡ em rất nhiều trong quá trình học tập và trong cuộc sống.
Em xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Bùi Thị Kim Lanh


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1.

1.1

TỔNG QUAN .................................................................................2

Đại cương về probiotic ..................................................................................2

1.1.1

Khái niệm probiotic ................................................................................2

1.1.2

Các chủng probiotic phổ biến .................................................................2

1.1.3

Các thế hệ bào chế của chế phẩm probiotic ............................................3

1.2

Loài Lactobacillus acidophilus .....................................................................4

1.2.1

Đặc điểm hình thái và điều kiện nuôi cấy...............................................4

1.2.2

Tác dụng của L. acidophilus đối với sức khỏe .......................................4

1.3

Tổng quan về dạng bào chế vi nang và vi nang hóa probiotic ......................5

1.3.1

Khái niệm ................................................................................................5

1.3.2

Cấu tạo, thành phẩn, đặc điểm ................................................................5

1.3.3

Vi nang hóa probiotic .............................................................................6

1.4

Một số thành phần sử dụng trong vi nang probiotic ......................................8

1.4.1

Alginat ....................................................................................................8

1.4.2

Tinh bột .................................................................................................10

1.4.3

Chitosan ................................................................................................10

1.5

Một số nghiên cứu về vi nang calci alginat bao chitosan ............................12


CHƯƠNG 2.
2.1

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............14

Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị ...............................................................14

2.1.1

Chủng vi sinh vật ..................................................................................14

2.1.2

Nguyên vật liệu, hóa chất .....................................................................14

2.1.3

Thiết bị và dụng cụ ...............................................................................14

2.1.4

Một số môi trường sử dụng ..................................................................15

2.1.5

Một số dung dịch sử dụng.....................................................................15

2.2

Nội dung nghiên cứu ...................................................................................16

2.2.1

Tạo vi nang calci - alginat bao chitosan theo 2 phương pháp ..............16

2.2.2

Đánh giá khả năng bảo vệ vi sinh vật của vi nang alginat - tinh bột -

chitosan trong dịch tiêu hóa mô phỏng .............................................................16
2.3

Phương pháp nghiên cứu .............................................................................16

2.3.1

Phương pháp tiệt khuẩn ........................................................................16

2.3.2

Phương pháp nhân giống ......................................................................17

2.3.3

Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào ...........................................17

2.3.4

Phương pháp tạo các vi nang placebo ..................................................17

2.3.5

Phương pháp tạo các loại vi nang Alg-TB và Alg-TB-Chi chứa

Lactobacillus acidophilus .................................................................................18
2.3.6

Phương pháp đông khô .........................................................................19

2.3.7

Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV ................20

2.3.8

Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ L. acidophilus trong môi

trường acid pH 3,0 ............................................................................................21
2.3.9

Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng L. acidophilus trong môi

trường đệm phosphat pH 6,8 .............................................................................22

2.3.10

Phương pháp đo hàm ẩm ...................................................................22


Phương pháp chụp ảnh cấu trúc vi nang bằng kính hiển vi điện tử

2.3.11

quét (SEM) ........................................................................................................22
2.3.12

Phương pháp xác định kích thước vi nang ........................................23

2.3.13

Phương pháp xử lí kết quả .................................................................23

CHƯƠNG 3.
3.1

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .........................24

Tạo vi nang calci - alginat bao chitosan theo 2 phương pháp .....................24

3.1.1

Tạo vi nang placebo calci alginat bao chitosan với tá dược bảo vệ tinh

bột

...............................................................................................................24

3.1.2

Khảo sát mật độ L. acidophilus của các vi nang alginat - tinh bột -

chitosan sau đông khô .......................................................................................29
3.2

Đánh giá khả năng bảo vệ vi sinh vật của vi nang alginat - tinh bột -

chitosan trong dịch tiêu hóa mô phỏng .................................................................31
3.2.1

Khả năng bảo vệ VSV trong môi trường pH 3,0 ..................................31

3.2.2

Khả năng giải phóng VSV trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 ....34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Alg

: Alginat

ATCC

: Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ (American Type Culture
Collection)

B. bifidum

: Bifidobacterium bifidum

CFU

: Số đơn vị khuẩn lạc (Colony - Forming Units)

Chi

: Chitosan

DĐVN IV

: Dược điển Việt Nam IV

FAO

: Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food
and Agriculture Organization of the United Nations)

kl/tt

: Khối lượng/thể tích

L. acidophilus

: Lactobacillus acidophilus

L. casei

: Lactobacillus casei

L. plantarum

: Lactobacillus plantarum

LAB

: Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacterium)

MRS

: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Sharpe)

MT

: Môi trường

TB

: Tinh bột

VK

: Vi khuẩn

VSV

: Vi sinh vật

WHO

: Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization)


DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng

STT

Trang

1.

Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất sử dụng

14

2.

Bảng 2.2: Các máy móc dùng trong nghiên cứu

14

3.

4.

5.

6.

Bảng 3.1: Đường kính vi nang placebo calci alginat có tinh bột trước
đông khô
Bảng 3.2: Mật độ L. acidophilus và hàm ẩm các vi nang sau đông
khô
Bảng 3.3: Số lượng L. acidophilus trong các mẫu vi nang sau khi ủ
2h ở pH 3,0
Bảng 3.4: Khả năng giải phóng L. acidophilus trong môi trường pH
6,8 của các mẫu vi nang

24

29

32

34


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Tên bảng

STT

Trang

1.

Hình 1.1: Các thế hệ bào chế của chế phẩm chứa probiotic

3

2.

Hình 1.2: Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

4

3.

4.

Hình 1.3: Cấu trúc của β – D – Mannuronic acid và α – L –
Guluronic acid
Hình 1. : Mô hình vỉ trứng mô tả các ion Ca2+ phối hợp với các
chuỗi guluronat tạo hydrogel calci alginat

9

9

5.

Hình 1.5: Cấu trúc phân tử chitin và chitosan

11

6.

Hình .1: Hình ảnh các mẫu vi nang sau đông khô

25

7.

8.

9.

10.

11.

Hình 3.2: Hình ảnh bề mặt các vi nang placebo dưới kính hiển vi
điện tử quét
Hình 3.3: Ảnh mặt cắt của vi nang Alg-TB-Chi 1 (M8) dưới kính
hiển vi điện tử quét
Hình . : Đồ thị biễu diễn khả năng bảo vệ VSV trong môi trường
pH 3,0 của các vi nang M7-M8-M9

Hình 3.5: Vi nang Alg-TB-Chitosan 1 (M8) sau khi ủ trong môi
trường pH 6,8 tại thời điểm ban đầu (hình a) và sau 90 phút (hình b)
Hình .6: Đồ thị biểu diễn khả năng giải phóng VSV của các mẫu vi
nang trong môi trường pH 6,8 của các vi nang M7-M8-M9

26

30

32

35

35


ĐẶT VẤN ĐỀ

Probiotic được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích cho con
người như ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng dung nạp lactose,
tăng cường miễn dịch, hấp thụ ure, hỗ trợ điều trị cho người bị suy thận, giảm
cholesterol máu, tuy nhiên nhược điểm của nhóm VSV này là dễ bị ảnh hưởng bởi
các yếu tố như pH, nhiệt độ, độ ẩm… làm giảm số lượng sống sót. Hiện nay, đối
với các dạng bào chế thông dụng trên thị trường (bột và cốm), việc đảm bảo số
lượng vi sinh vật sống sót trong suốt quá trình sản xuất và bảo quản đến khi được sử
dụng qua đường uống là một thách thức. Phương pháp đông khô và vi nang hóa
được ứng dụng rộng rãi như là biện pháp làm tăng độ ổn định và hoạt tính trao đổi
chất của tế bào khi có sự thay đổi nhiệt độ, pH hay sự có mặt của các chất ức chế
trong môi trường, kết quả làm kéo dài khả năng tồn tại, thời gian sống sót của vi
sinh vật. Việc sử dụng tá dược tạo vi nang alginat kết hợp chitosan có ưu điểm an

toàn, không độc, phương pháp bào chế đơn giản, vi nang tạo thành có độ đồng đều
cao [43].
Xuất phát từ những lí do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh
giá khả năng bảo vệ vi sinh vật của vi nang calci - alginat bao chitosan”
nhằm thực hiện các mục tiêu sau:
1. Tạo vi nang calci – alginat bao chitosan theo 2 phương pháp.
2. Đánh giá khả năng bảo vệ vi sinh vật của vi nang alginat - tinh bột chitosan trong dịch tiêu hóa mô phỏng.

1


CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN

1.1

Đại cương về probiotic

1.1.1

Khái niệm probiotic
Thuật ngữ probiotic có nguồn gốc từ Hy Lạp. Theo nghĩa gốc, “biotic” hay

“biosis” xuất phát từ chữ “life” là đời sống và “pro” là thân thiện, nên probiotic có
thể hiểu là “thân thiện với đời sống con người” [43]. Năm 2002, Tổ chức Y tế thế
giới (WHO) và tổ chức Nông lương thế giới (FAO) đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn
và hoàn chỉnh nhất về probiotic như sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà
khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật
chủ” [15], [23], [43]. Probiotic có thể được sử dụng cho cả người và động vật.

Theo đánh giá của tổ chức FAO và WHO, tiêu chuẩn quan trọng nhất để
chọn chủng probiotic là chủng đó phải có khả năng sống sót và phát triển trong
đường ruột. Trong quá trình bảo quản và sử dụng, probiotic bị ảnh hưởng bởi nhiều
điều kiện bất lợi của môi trường bên ngoài cũng như môi trường trong đường tiêu
hóa [15], [38]. Vì vậy, để thu được lợi ích từ probiotic, liều tiêu thụ hàng ngày được
khuyến cáo cần vượt quá 106 VSV sống trong mỗi đơn vị sản phẩm [24], thực phẩm
có chứa probiotic cần chứa ít nhất 107 VSV sống trong mỗi g hoặc ml sản phẩm tại
thời điểm sử dụng để tạo ra tác dụng mong muốn [23]. Nồng độ VSV trong sản
phẩm sữa thương mại thường nằm trong khoảng 108 - 109 CFU/ml.
Một số tác giả cho rằng cơ chế hoạt động của probiotic dựa vào thay đổi
thành phần hệ VSV đường ruột nội sinh và hoạt động trao đổi chất của chúng, ngăn
cản sự phát triển quá mức và xâm chiếm của mầm bệnh, kích thích hệ miễn dịch
[30], [32].
1.1.2

Các chủng probiotic phổ biến
Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ

yếu thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium, ngoài ra Enterococcus và

2


Streptococus cũng được sử dụng nhưng ít hơn. Những vi khuẩn này thường cư trú
trong ruột.
Một số chủng tiêu biểu bao gồm: L. acidophilus, L. gasseri, L. rhamnosus, B.
longum, B. bifidum. Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces
boulardii cũng được xem là probiotic.
1.1.3

Các thế hệ bào chế của chế phẩm probiotic
Nhiều báo cáo trước đây đã chỉ ra rằng số lượng vi khuẩn probiotic trong các

chế phẩm trên thị trường còn thấp dưới mức FAO/WHO quy định. Để cải thiện số
lượng vi sinh vật sống sót trong suốt quá trình bảo quản và trong môi trường pH
thấp của hệ tiêu hóa, các nhà cung cấp đã nghiên cứu các công thức bảo vệ VSV
trong các sản phẩm probiotic với bốn thế hệ bào chế như sau [3]:
Thế hệ 1 (non-coated):
VSV sống trong sữa chua, phomat..., bào tử VSV, dạng bột
đông khô, gói bột uống
Thế hệ 2 (enteric-coated):
VSV dưới dạng viên nén, viên nang có lớp bao tan trong ruột
Thế hệ 3 (micro-encapsulated):
VSV trong dạng vi nang
Thế hệ 4 (dual-coated):
Bao hai lớp, lớp bên trong là protein, lớp ngoài là polysaccharid

H nh 1.1: Các thế hệ bào chế của chế phẩm chứa probiotic

3


1.2

Loài Lactobacillus acidophilus

1.2.1

Đặc điểm hình thái và điều kiện nuôi cấy
Lactobacillus acidophilus thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus,

nhóm vi khuẩn lactic (LAB) và tồn tại trong đường tiêu hóa, âm đạo của người và
động vật. Lactobacillus acidophilus có khả năng chịu được điều kiện pH khoảng 5,0
đến 6,0 trong 24 - 36 giờ [2].
Cấu trúc hình thái của Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn hình que,
Gram dương, kích thước thường là 0,6-0,9 × 1,5-6 𝜇𝑚, mọc đơn hoặc mọc đôi tạo
thành chuỗi ngắn, không sinh bào tử, không di động, kị khí không bắt buộc, phản
ứng catalase âm tính. Nhiệt độ phát triển tối ưu 70C, tối đa trong khoảng 430C480C, không phát triển trong khoảng 200C-220C [16]. Điểm hạn chế của vi khuẩn
L. acidophilus là khả năng sống sót của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như pH, sự
acid hóa trong sản phẩm lên men, sản phẩm hydroperoxid, nồng độ oxy hòa tan
(khuếch tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản), nhiệt độ bảo quản, độ
ổn định của dạng khô hoặc đông khô [34], [35], trong đó, nồng độ oxy hòa tan có
vai trò đáng kể trong việc hạn chế khả năng sống sót của L. acidophilus. Do đó, sau
một thời gian bảo quản, số lượng L. acidophilus sống sót sẽ bị giảm đáng kể [14].

H nh 1.2: H nh ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
1.2.2

Tác dụng của L. acidophilus đối với sức khỏe
Lactobacillus acidophilus đem lại nhiều tác động có lợi đối với sức khỏe

giống như những probiotic khác:

4


- Cạnh tranh vị trí, làm giảm số lượng vi sinh vật hoặc nấm gây hại ở ruột
non, có khả năng sinh lactase - một enzym quan trọng liên quan quá trình chuyển
hóa sữa [16].
- Tạo môi trường acid thuận lợi cho hệ lên men đường ruột và đồng thời ức

chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh Gram (-) [16].
- Tổng hợp các vitamin, ngoài ra còn có khả năng sản xuất acid lactic và các
chất diệt khuẩn như Lactocidin, Bacteriocin.
- Điều trị các bệnh đường tiêu hóa như táo bón, tiêu chảy... [16].
- Giảm sinh tổng hợp cholesterol [16].
- Ức chế các vi khuẩn đường ruột chuyển đổi tiền chất gây ung thư thành chất
gây ung thư [16].
- Chủng L. acidophilus LA -5 có tác dụng lên hệ miễn dịch, làm lượng
cytokine tăng lên, tăng hoạt động thực bào và sản xuất kháng thể [18].
1.3

Tổng quan về dạng bào chế vi nang và vi nang hóa probiotic

1.3.1

Khái niệm
Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định, có

kích thước 0,1 µm – 5 mm (thông thường từ 100 - 500 µm). Một số tài liệu xếp kích
thước vi nang nằm trong khoảng 1 µm - 1000 µm [15], [28]. Vi nang hóa là quá
trình bao gói những giọt chất lỏng nhỏ hoặc phân tử nhỏ bằng một lớp màng thích
hợp [28].
1.3.2

Cấu tạo, thành phẩn, đặc điểm
Vi nang được cấu tạo bởi hai phần:



Phần nhân: Gồm một hoặc nhiều dược chất ở trạng thái rắn, lỏng hoặc nhũ

tương, hỗn dịch, có thể thêm các chất phụ nhằm mục đích ổn định hoặc điều chỉnh
tốc độ giải phóng dược chất [5], [13].


Phần vỏ: Thường là các hợp chất cao phân tử có nguồn gốc thiên nhiên như

gelatin, alginat, chitosan, cellulose,...hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid,

5


polystyren, polyacrylat,…có tác dụng tạo màng mỏng, bề dày từ 0,1 đến 200 µm
[5], [9].
Các tính chất của vật liệu làm vỏ vi nang như bám dính, tính thấm, khả năng
hút ẩm, khả năng hòa tan, độ ổn định phải phù hợp với mục đích bào chế vi nang
[42]. Lớp vỏ này phải có khả năng “bẫy”, “nhốt” và bao gói các dược chất, VSV
trong các vi nang nhỏ. Lớp vỏ vi nang có độ bền tương đối để vừa có khả năng bảo
vệ tế bào VK vừa có khả năng giải phóng dược chất khi cần thiết [19].
1.3.3

Vi nang hóa probiotic
Vi nang hóa probiotic là một trong những phương pháp cố định tế bào VSV

được áp dụng rộng rãi hiện nay. Phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là
các polyme có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose… hoặc
có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylamid, polyester,
polyvinyl pyrrolidon (PVP), polyethylen glycol (PEG),… để bẫy, nhốt và bao gói
các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống trong các nang nhỏ [6].
1.3.3.1 Ưu, nhược điểm

a. Ưu điểm:
Vi nang hóa cho phép cố định một lượng lớn tế bào sống tạo ra mật độ vi
sinh vật lớn, phương pháp cố định tế bào VSV dùng trong lên men rượu, bia,… để
sử dụng VSV tiết kiệm, tối ưu và hiệu quả hơn. Vi nang hóa giúp bảo vệ VK tránh
khỏi các yếu tố bất lợi của môi trường như oxy, pH thấp, muối mật,… Ngoài ra, vi
nang làm ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ
hay sự có mặt của các chất ức chế có trong môi trường lên men do đó làm tăng độ
ổn định và kéo dài khả năng tồn tại của VK [31], [43].
Vi nang hóa có thể tạo ra các gradien nồng độ cơ chất, sản phẩm, nồng độ
oxy hòa tan, pH môi trường lên men… từ đó có thể tạo ra các môi trường khác nhau
cho tế bào trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng. Vi nang cũng cho phép
điều chỉnh tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, cho phép sử dụng tế bào ở một pha

6


riêng biệt đối với môi trường lên men, do đó có khả năng dừng phản ứng nhanh khi
cần thiết [43].
Vi nang hóa dự kiến sẽ kéo dài thời hạn sử dụng của các chế phẩm sinh học
ở nhiệt độ phòng, tăng khả năng chịu nhiệt, tăng khả năng chịu nén, chịu biến dạng
và tăng khả năng chịu acid [36].
b. Nhược điểm:
Vi nang hóa probiotic yêu cầu kỹ thuật bào chế phức tạp, vật liệu vi nang hóa
an toàn và hiệu quả, chủng VSV có hiệu lực cao, chỉ các chủng VSV tiềm năng mới
có thể được sử dụng. Sự phát triển của sản phẩm cần cả thời gian và nguồn lực tài
chính, làm tăng chi phí cuối cùng. Brownlie ước tính rằng việc vi nang hóa
probiotic có thể tăng chi phí hai hoặc ba lần so với không bao gói. Mặc dù chi phí
tăng nhưng vi nang hóa đem lại lợi ích tiềm năng cao hơn [36], [37].
1.3.3.2 Vi nang hóa bằng phương pháp tách pha đông tụ
Phương pháp tách pha đông tụ dựa trên nguyên tắc tách pha nhờ sự thay đổi

nhiệt độ, pH, sự hóa muối hoặc khi thêm một dung môi thứ hai vào hệ vi nang. Tác
động vào dung dịch keo trong một dung môi thích hợp nhằm thay đổi độ tan của nó,
kết quả là một lượng đáng kể keo được tách ra thành pha mới. Như vậy hệ trở thành
hai pha, một pha có nồng độ cao chất keo được tách ra dưới dạng giọt nhỏ được gọi
là giọt đông tụ. Sau đó, các giọt đông tụ dần kết dính lại với nhau hoặc hấp phụ trên
bề mặt chất cần bao gói tạo thành lớp màng bao [5], [9].
Vi nang hóa bằng phương pháp tách pha đông tụ có thể chia làm 2 loại: đông
tụ đơn giản (chỉ sử dụng 1 loại dung dịch keo) và đông tụ phức hợp (sử dụng nhiều
loại dung dịch keo) [5], [9].
Đông tụ đơn giản: Là quá trình loại nước của các chất keo thân nước dùng
trong hệ, do đó làm giảm độ tan của chất keo. Trong phương pháp này thường chỉ
sử dụng một loại polyme (gelatin, polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose). Làm
giảm độ tan của chất keo bằng cách: Thêm vào một dung môi có thể trộn lẫn với

7


nước (ethanol, aceton, isopropanol,…) hoặc thêm vào một muối vô cơ hay thay đổi
nhiệt độ [41].
Đông tụ phức hợp: Là quá trình tương tác giữa các phân tử tích điện âm và
tích điện dương của hai hoặc nhiều hợp chất cao phân tử, có thể do sự thay đổi nồng
độ các chất tan cao phân tử hoặc thay đổi pH. Các polyme càng có sự khác nhau về
điểm đẳng điện càng dễ tạo thành hạt đông tụ [5], [9], [41]. Tách pha còn có thể
được thực hiện do thêm vào một polyme khác không tương đồng, do thêm vào một
dung môi thứ hai, do sự hóa muối (đông tụ thông thường), hoặc do sự tương tác
giữa các polyme…[5].
Kỹ thuật đông tụ hóa muối (đông tụ thông thường) là một kỹ thuật ion hóa cố
định gel. Phương pháp này thường sử dụng các polyme có nguồn gốc tự nhiên, có
tính tương thích sinh học cao như alginat, chitosan, gôm gellan… Các polyanion
như alginat sẽ kết hợp với các ion đa hóa trị tạo thành các hạt gel có mạng lưới

không gian ba chiều bao gói lấy dược chất hoặc kết hợp tạo phức với các polyanion
khác trên bề mặt của hạt gel alginat để tạo lớp màng có độ bền cơ học cao hơn,
ngăn thấm tốt hơn. Phương pháp này có thể được thực hiện bằng kỹ thuật nhỏ giọt
hoặc kỹ thuật phun đông tụ [33].
1.4

Một số thành phần sử dụng trong vi nang probiotic

1.4.1

Alginat
Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic, tồn tại dưới dạng

anion. Acid aginic là một heteropolymer saccharid mạch thẳng, cấu tạo từ hai gốc
uronic là acid

𝑚

và acid

nối với nhau bằng

liên kết 1 - 4 - glycosid.
Alginat được chiết xuất từ rong biển nâu, được khai thác rộng rãi trong các
ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm nhờ khả năng bao gói các chất đại
phân tử, tế bào.

8

H nh 1.3: Cấu trúc của β – D – Mannuronic acid và α – L – Guluronic
Dung dịch alginat có khả năng tạoacid.
gel với các cation kim loại hóa trị II, III
như Ca2+, Ba2+, Sr2+, sự tạo gel được giải thích theo mô hình “vỉ trứng”. Bình
thường trong dung dịch alginat tồn tại block M và block G tương ứng là các dải hẹp
và dải gấp khúc. Khi có mặt ion kim loại đa hóa trị ở nồng độ thích hợp thì xảy ra
sự gel hóa. Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp khúc tạo
thành khoảng không gian giống như chỗ đặt trứng. Các ion Ca2+ khớp vào các
khoảng trống này tạo nên mạng lưới không gian ba chiều. Với cấu trúc gel này, khi
sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như một tấm chắn chống lại những yếu tố
bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng có
kiểm soát [29].

H nh 1.4: Mô h nh "vỉ trứng" mô tả các ion Ca2+ phối hợp với các chuỗi
guluronat tạo hydrogel calci alginat
Alginat là nguyên liệu an toàn, không độc, dễ sử dụng và giá thành rẻ. Alginat
gel hóa nhanh chóng ở pH trung tính và nhiệt độ thường, thích hợp cho các tế bào
sống và phân tử sinh học nhạy cảm như protein và acid nucleic [36]. Alginat dễ
dàng tạo gel bao bọc các tế bào VK, lớp gel tạo thành có độ ổn định cao. Quá trình
vi nang hóa VK bằng alginat thực hiện dễ dàng, đơn giản, có thể thực hiện ở nhiệt
độ thường nên ít ảnh hưởng đến VK sống và gel tạo thành có tính thuận nghịch giúp
giải phóng tế bào bên trong. Hạt vi nang tạo thành đẹp và tương đối đồng đều [11].

9


1.4.2

Tinh bột
Tinh bột là hợp chất hữu cơ rất phổ biến, được phát triển khi người Ai Cập sử

dụng nó như chất kết dính làm từ lúa mì. Các loại thực phẩm giàu tinh bột có nguồn
gốc từ hạt, rễ, củ.
Tinh bột là một polysaccharid được cấu tạo từ 2 polysaccharid là Amylose và
Amylopectin. Cả hai cấu tử này đều được cấu tạo từ
1,4 - glycosid và liên kết

- D glucose bằng liên kết

-

- 1,6 - glycosid. Tỉ lệ amylose/amylopectin trong đa số

tinh bột là ⁄ .
Trong môi trường acid, tinh bột bị thủy phân thành sản phẩm hòa tan. Ở môi
trường acid mạnh, sản phẩm thủy phân cuối cùng là glucose. Trong môi trường
kiềm, tinh bột bị ion hóa từng phần do sự hydrat hóa tốt hơn. Khi hòa tinh bột vào
nước, do sự hấp thụ nước làm hạt tinh bột trương nở, tăng thể tích. Ở nhiệt độ trên
55 - 70oC, các loại tinh bột trương nở do hấp thụ nước vào các nhóm hydroxyl phân
cực, độ nhớt của dung dịch tăng mạnh. Kéo dài thời gian xử lí nhiệt có thể gây nổ,
vỡ hạt tinh bột, thủy phân từng phần và hòa tan phần nào vào các phần tử cấu thành
của tinh bột, kèm theo sự giảm độ nhớt của dung dịch.
Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, tương thích sinh học, phân hủy sinh
học. Tinh bột không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch. Nó được sử dụng làm tá
dược độn phổ biến, giá rẻ và có thể tiêu hóa được [14].
Tinh bột là một tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô theo cơ chế làm giảm
lượng nước liên kết trong mẫu [27]. Trong quá trình vi nang hóa tế bào vi khuẩn
bằng phương pháp đông tụ hóa muối sử dụng alginat, tinh bột được phối hợp như tá
dược độn rắn, góp phần cải thiện tính chất vật lý của vi nang sau đông khô và giúp
tế bào ổn định hơn trong quá trình đông khô và bảo quản [7], [14].

1.4.3

Chitosan
Chitosan là một polyaminosaccharid sinh học tự nhiên có phân tử lượng từ

800 đến 2000000 dalton, mức độ acetyl hóa từ 40 - 98%, thu được từ phản ứng
deacetyl hóa chitin - một polyaminosaccarid rất phong phú trong tự nhiên, là thành

10


phần cơ bản của lớp vỏ bảo vệ của các động vật giáp xác như tôm, cua,…và thành
tế bào của một số loài như aspegillus, mucor,…[40].

H nh 1.5: Cấu trúc phân tử chitin và chitosan
Chitosan có một nhóm amin bậc 1 và hai nhóm hydroxyl liên kết với mỗi tiểu
đơn vị C6. Chitosan là một base yếu, không tan trong nước và dung môi hữu cơ
nhưng tan được trong dung dịch acid loãng (pH < 6,5) do trong môi trường acid,
những nhóm amin (các tiểu đơn vị glucosamin) của chitosan nhận proton tạo thành
dạng polysaccharid tích điện dương tan được. Các muối của chitosan (muối
glutamat, clorid) tan trong nước. Chitosan không tan trong môi trường trung tính và
kiềm. Đặc tính này được ứng dụng để chế tạo vi cầu, vi nang chitosan [40].
Chitosan có ưu điểm là độc tính thấp, tính tương thích sinh học cao với tế bào
vi khuẩn và nhiều hoạt chất khác, có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm... đồng thời
còn tự phân hủy được nên chitosan thường được dùng làm chất mang trong công
nghệ dược phẩm.
Trong bào chế vi nang probiotic, chitosan có vai trò cung cấp một lớp bao
phủ hiệu quả, bảo vệ các tế bào vi khuẩn trong suốt quá trình bảo quản và sử dụng,
đảm bảo VSV có thể đi qua đường tiêu hóa (acid dạ dày, muối mật,...) đến ruột già
mà vẫn đủ số lượng VSV cần thiết phát huy tác dụng [10].

11


1.5

Một số nghiên cứu về vi nang calci alginat bao chitosan
Theo Zanjani M và cộng sự [26]: Sinh khối Lactobacillus casei và

Bifidobacterium bifidum sau khi lên men được ly tâm ở 40C, tốc độ 4000 vòng/phút
trong 10 phút. Tiếp theo cho 2g tinh bột ngô được vào 100 ml nước, đun sôi để tạo
gel, thêm natri alginat và 1% inulin, khuấy cho đến khi phân tán hết. Tiến hành bổ
sung sinh khối VSV và khuấy cho đến khi đồng nhất. Hỗn dịch trên đem tạo vi nang
bằng phương pháp nhũ tương hóa. Chuẩn bị 100 ml dung dịch chitosan 0,4% trong
acid acetic, pH 5,7 - 6,0. Sau đó ngâm 20g vi nang trong 100 ml dung dịch chitosan
và lắc 100 vòng/phút trong 0 phút. Vi nang bao chitosan tạo thành được giữ trong
dung dịch pepton 0,1% ở 40C. Nghiên cứu tiến hành thử khả năng bảo vệ VSV của
vi nang trong môi trường acid pH 1,5 có chứa pancreatin, NaCl và muối mật ở 370C
sau 0, 60, 90 và 120 phút. Kết quả cho thấy sau khi ủ trong dung dịch mô phỏng
dịch dạ dày-ruột, vi nang Alg-TB với lớp bao chitosan giúp tăng khả năng sống sót
của L. casei và B. bifidum so với tế bào tự do.
Cũng theo Sepideh Abbaszadeh và cộng sự [39]: sinh khối Lactobacillus
rhamnosus được tiến hành tạo vi nang alginat bao chitosan bằng kĩ thuật nhũ tương
hóa tương tự như trên với các nồng độ khác nhau của Alg là 2%, %, % và Chi là
0,2%, 0, % và 1,0% để đánh giá khả năng bảo vệ VSV trong suốt quá trình phơi
nhiễm với dịch tiêu hóa mô phỏng. Kết quả cho thấy sau 48 giờ ủ vi nang trong môi
trường pH 2,0, số lượng VSV tự do giảm mạnh trong khi số lượng VSV được bao
gói trong vi nang Alg-Chi không có thay đổi đáng kể. Hơn nữa, tỷ lệ sống sót sau
khi tiếp xúc với dạ dày-ruột của tất cả các vi nang cao gấp 10-87 lần so với các tế
bào tự do và tăng lên đáng kể khi tăng nồng độ chitosan và alginat.

Tác giả Đàm Thanh Xuân và cộng sự [7] đã tiến hành tạo vi nang probiotic theo
phương pháp đông tụ hóa muối. Tiến hành pha 100 ml hỗn dịch gồm sinh khối tế
bào (thu được từ 200 ml dịch tế bào), tinh bột, glycerin, alginat; 100 ml dung dịch
chitosan - calci clorid (dung dịch chitosan trong acid acetic 0,5%, pH 5,5 - 6). Tiến
hành bơm nhỏ giọt hỗn dịch thu được vào dung dịch chitosan - calci clorid qua đầu

12


kim cỡ 25G để tạo vi nang ở tốc độ 60 - 80 giọt/phút, khuấy hỗn dịch thu được ở tốc
độ 400 - 600 vòng/phút; ủ vi nang tạo thành trong môi trường đông tụ 0 phút. Tiến
hành đông khô vi nang thu được. Mẫu sau khi đông khô được bảo quản trong túi
polyme kín miệng, nhiệt độ 2 - 8oC. Tác giả tiến hành đánh giá khả năng bảo vệ
L. acidophilus ở môi trường pH 1,2 trong 1 giờ. Kết quả cho thấy các thành phần
alginat, tinh bột, chitosan đều có ảnh hưởng đến đặc tính và khả năng bảo vệ VSV
của vi nang bào chế bằng phương pháp đông tụ.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Mai Hương [4] tác giả đã sử dụng tinh bột vào
trong quá trình tạo vi nang L. acidophilus như sau: Tinh bột, sinh khối VSV được
phân tán vào dung dịch alginat tạo hỗn dịch. Hỗn dịch này cho qua đầu kim có
đường kính trong 900 µm, nhỏ vào dung dịch CaCl2 2% (kl/tt) để tạo hạt. Kết quả
cho thấy việc phối hợp tinh bột đã cải thiện thể chất của nguyên liệu đông khô dạng
vi nang. Hạt có kích thước lớn hơn, đồng đều, bề mặt giảm nhăn nhúm, giữ được độ
cầu tốt hơn, màu sắc đẹp hơn.

13


CHƯƠNG 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1

Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị

2.1.1

Chủng vi sinh vật
Lactobacillus acidophilus (ATCC 4653) – Bộ môn Công Nghiệp Dược

2.1.2

Nguyên vật liệu, hóa chất
Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất sử dụng

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Glucose

Trung Quốc

Triamoni citrate

Trung Quốc

Pepton

Ấn Độ

Natri acetat

Trung Quốc

Cao thịt

Merck -Đức

Natri citrate

Trung Quốc

Cao nấm men

Merck -Đức

Natri alginat

Ấn Độ

KH2PO4

Trung Quốc

Calci clorid

Trung Quốc

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

Acid acetic băng

Trung Quốc

MnSO4.4H2O

Trung Quốc

Chitosan

Đức

Natri clorid

Trung Quốc

Thạch (Agar)

Việt Nam

2.1.3

Thiết bị và dụng cụ

 Thiết bị
Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị

Nguồn gốc

Tên thiết bị

Nguồn gốc

Cân kỹ thuật

Đức (Satorious)

Nồi hấp tiệt trùng

Nhật (ALP)

Kính lúp soi nổi

Nhật (Nikon)

Tủ ấm CO2

Nhật (Sanyo)

Máy đo hàm ẩm

Mỹ (Ohaus)

Tủ cấy vô trùng

Nhật (Sanyo)

Máy khuấy từ

Hàn Quốc (Wisd)

Tủ lạnh bảo quản

Hàn Quốc (LG)

Máy lắc ổn nhiệt Trung Quốc (KWF)

Tủ sấy

Hàn Quốc (Daihan)

Máy ly tâm

Thiết bị đông khô

Đức (Christ Alpha)

Đức (Satorious)

14

 Dụng cụ
Bình nón 100, 250, 1000ml

Pipet pasteur

Cốc có mỏ

Pipet chia vạch

Ống đong

Pipet tips (Đầu côn)

Ống ly tâm

Pipet Eppendort

Ống nghiệm có nắp

Đĩa petri đường kính 9 cm

Lưới vớt hạt
2.1.4

Một số môi trường sử dụng

 Môi trường MRS lỏng (MT1)
Glucose

20,0 g

Natri acetat

5,0 g

Pepton

10,0 g

K2HPO4

2,0 g

Cao thịt

10,0 g

MgSO4.7H2O

0,2 g

Cao nấm men

5,0 g

MnSO4.4H2O

0,05 g

Triamoni citrat

2,0 g

Nước máy vừa đủ 1000 ml
Điều chỉnh pH 6,3 -6,5

 Môi trường MRS thạch (MT2)
MT2 = MT1 + thạch 2% (20 g thạch/1000 ml môi trường)
2.1.5


Một số dung dịch sử dụng
Dung dịch alginat %: cân ,00 gam natri alginat, phân tán đều trong 100 ml
nước cất. Đem hấp tiệt trùng ở 1150C trong 20 phút cho alginat đồng nhất.



Dung dịch chitosan 0,5% trong acid acetic 0,5%, pH 5,5-6,0: cân 0,50 g
chitosan, hòa tan vào 90 ml acid acetic 0,5%. Điều chỉnh pH 5,5-6,0 bằng
NaOH 1M và HCl 1M, thêm acid acetic 0,5% vừa đủ 100 ml.



Dung dịch natri citrat 2% (kl/tt): cân 2,00 g natri citrat, hòa tan hoàn toàn
trong 100 ml nước cất.



Dung dịch calci clorid (CaCl2) 2% (kl/tt): cân 2,00 g CaCl2, hòa tan hoàn toàn
trong 100ml nước cất.

15




Dung dịch NaCl 0,9% (kl/tt): cân 0,90 g NaCl, hòa tan hoàn toàn trong 100ml
nước cất.



Dung dịch NaCl 0,9% pH ,0: cân 0,90 g NaCl, hòa tan hoàn toàn trong 90ml
nước cất, điều chỉnh pH ,0. Thêm nước cất vừa đủ 100,0ml



Dung dịch đệm phosphat pH 6,8: cân chính xác 6,80 g KH2PO4 và 0,9 g
NaOH, hòa tan hoàn toàn trong 90ml nước cất, điều chỉnh pH ,0. Thêm nước
cất vừa đủ 100,0ml [1].
Nội dung nghiên cứu

2.2

2.2.1 Tạo vi nang calci - alginat bao chitosan theo 2 phương pháp
 Tạo vi nang placebo calci - alginat bao chitosan với tá dược bảo vệ tinh bột
 Khảo sát mật độ L. acidophilus của các vi nang alginat - tinh bột - chitosan
sau đông khô
Đánh giá khả năng bảo vệ vi sinh vật của vi nang alginat - tinh bột -

2.2.2

chitosan trong đường tiêu hóa mô phỏng
 Khả năng bảo vệ VSV trong môi trường pH 3,0
 Khả năng giải phóng VSV trong môi trường đệm phosphat pH 6,8
2.3

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1

Phương pháp tiệt khuẩn

2.3.1.1 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm
Nguyên liệu cần tiệt khuẩn được gói kín bằng giấy bạc hoặc đựng trong bình
nón, đậy kín bằng nút bông, sau đó tiệt trùng trong nồi hấp tiệt khuẩn ở 1150C trong
20 phút.
2.3.1.2 Tiệt khuẩn tinh bột bằng phương pháp Tyndall
Cân một lượng tinh bột nhất định cho vào bình nón, đậy kín bằng nút bông,
đun cách thủy ở 700C - 800C trong 1 giờ, ủ bình trong tủ ấm ở điều kiện 370C trong
2 giờ. Lặp lại thao tác trong

ngày liên tục.

16