Nghiên cứu tính đa dạng loài của chi aspergillus fr fr trên các vị thuốc mã tiền (semen strychni) và khiếm thực (semen euryales) đang lưu hành trên địa bàn hà nội

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ HẠNH
MÃ SINH VIÊN: 1201165

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG LOÀI
CỦA CHI ASPERGILLUS FR.: FR.
TRÊN CÁC VỊ THUỐC MÃ TIỀN
(SEMEN STRYCHNI) VÀ KHIẾM THỰC
(SEMEN EURYALES) ĐANG LƯU HÀNH
TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ HẠNH
MÃ SINH VIÊN: 1201165

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG LOÀI
CỦA CHI ASPERGILLUS FR.: FR.
TRÊN CÁC VỊ THUỐC MÃ TIỀN
(SEMEN STRYCHNI) VÀ KHIẾM THỰC
(SEMEN EURYALES) ĐANG LƯU HÀNH
TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Trịnh Công
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Vi Sinh và Sinh Học

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng chân thành và biết ơn sâu sắc
đến người thầy của tôi là TS. Trần Trịnh Công – Giảng viên Bộ môn Vi sinh
và Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy đã tận tình chỉ bảo, động
viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, các chị kĩ thuật viên
của Bộ môn Vi sinh và Sinh học cùng toàn thể các thầy cô trường Đại học Dược
Hà Nội – là những người thầy đã chia sẻ và giúp tôi có được những kiến thức
quý báu trong học tập và hành trang trong quá trình thực hiện khóa luận.
Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn và các em sinh
viên nghiên cứu khoa học trên Bộ môn Vi sinh và Sinh học là những người đã
luôn động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều từ khi khóa luận mới bắt đầu được tiến
hành cho đến khi hoàn thành.
Cuối cùng, tôi muốn gửi đến gia đình của tôi, nơi đã sinh ra tôi, nuôi
dưỡng tôi lớn lên và luôn bên cạnh động viên tôi suốt những năm tháng qua,
lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Bùi Thị Hạnh


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 2
Một vài nét về chi Aspergillus Fr.: Fr. .................................................... 2
Tình hình nghiên cứu chi Aspergillus và độc tố trên thảo dược ở ngoài
nước ................................................................................................................ 4
Tình hình nghiên cứu chi Aspergillus và độc tố trên thảo dược ở trong
nước .............................................................................................................. 10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 11
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ........................................................................ 11
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 11
2.1.2. Môi trường phân lập và xác định nấm mốc .................................... 11
2.1.3. Thiết bị thí nghiệm .......................................................................... 11
2.1.4. Hóa chất .......................................................................................... 12
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 12
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 12
2.3.1. Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu ...................................... 12
2.3.2. Phương pháp phân lập nấm mốc ..................................................... 13
2.3.3. Phương pháp phân loại nấm mốc ................................................... 13
2.3.4. Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm ......................................... 13
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................. 15
3.1. Mức độ nhiễm các loài của chi Aspergillus trên các mẫu của vị thuốc mã
tiền ................................................................................................................ 15
3.1.1. Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc mã tiền nghiên cứu ........................ 15

3.1.2. Mức độ nhiễm các loài của chi Aspergillus trên các mẫu vị thuốc mã
tiền nghiên cứu .......................................................................................... 15
3.1.3. Một số ý kiến bàn luận.................................................................... 23
3.2. Mức độ nhiễm các loài của chi Aspergillus trên các mẫu của vị thuốc
khiếm thực .................................................................................................... 24
3.2.1. Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc khiếm thực nghiên cứu .................. 24
3.2.2. Mức độ nhiễm các loài của chi Aspergillus trên các mẫu vị thuốc
khiếm thực nghiên cứu.............................................................................. 24
3.2.3. Một số ý kiến bàn luận.................................................................... 32
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 34
1. Kết luận .................................................................................................... 34
1.1. Vị thuốc mã tiền ................................................................................. 34
1.2. Vị thuốc khiếm thực........................................................................... 34
2. Đề xuất ..................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADM

: Aspergillus Differentiation Medium Base

BGYF test

: Bright greenish-yellow fluorescence test

DĐVN IV

: Dược điển Việt Nam IV

DGM

: Dichloran Glycerol Medium Base

HPLC

: Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)

HPLC-MS/MS

: Sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp detector khối phổ 2 lần
(High performance liquid chromatography - tandem mass
spectrometry)

LÔ

: Phố Lãn Ông

MEA

: Malt Extra Agar

PDA

: Potato Dextrose Agar

TLC

: Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

UPLC-MS/MS

: Sắc kí siêu hiệu năng kết hợp detector khối phổ 2 lần
(Ultra performance liquid chromatography - tandem
mass spectrometry)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc mã tiền nghiên cứu ....................... 15
Bảng 3.2. Các loài và số lượng chủng của chi Aspergillus phân lập được từ 10
mẫu mã tiền nghiên cứu .................................................................................. 16
Bảng 3.3. Một số đặc điểm khuẩn lạc của các loài thuộc chi Aspergillus phân
lập được từ các mẫu mã tiền nghiên cứu ........................................................ 17
Bảng 3.4. Một số đặc điểm vi học của các loài thuộc chi Aspergillus phân lập
được từ các mẫu mã tiền nghiên cứu .............................................................. 18
Bảng 3.5. Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc khiếm thực nghiên cứu ................. 24
Bảng 3.6. Các loài và số lượng chủng của chi Aspergillus phân lập được từ 10
mẫu khiếm thực nghiên cứu ............................................................................ 24
Bảng 3.7. Một số đặc điểm khuẩn lạc của các loài thuộc chi Aspergillus phân
lập được từ các mẫu khiếm thực nghiên cứu .................................................. 26
Bảng 3.8. Một số đặc điểm vi học của các loài thuộc chi Aspergillus phân lập
được từ các mẫu khiếm thực nghiên cứu ........................................................ 27


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang

Hin
̀ h 1.1. Cấu trúc sinh conidi của chi Aspergillus .......................................... 3
Hin
̀ h 3.1. Loài A. niger nhiễm trên vị thuốc mã tiền...................................... 19
Hin
̀ h 3.2. Loài A. flavus nhiễm trên vị thuốc mã tiền .................................... 20
Hin
̀ h 3.3. Loài A. tamarii nhiễm trên vị thuốc mã tiền .................................. 21
Hin
̀ h 3.4. Loài A. ochraceus nhiễm trên vị thuốc mã tiền ............................. 22
Hin
̀ h 3.5. Loài A. flavus nhiễm trên vị thuốc khiếm thực .............................. 28
Hin
̀ h 3.6. Loài A. niger nhiễm trên vị thuốc khiếm thực ............................... 29
Hin
̀ h 3.7. Loài A. fumigatus nhiễm trên vị thuốc khiếm thực ........................ 30
Hin
̀ h 3.8. Loài A. terreus nhiễm trên vị thuốc khiếm thực ............................ 31


ĐẶT VẤN ĐỀ
Thảo dược đang được sử dụng chế biến các phương thuốc gia truyền
cũng như làm nguồn nguyên liệu thô cho ngành công nghiệp dược ngày một
tăng. Tuy nhiên, trên thực tế và theo đánh giá của các nhà khoa học, nguồn
nguyên liệu này hiện chưa đáp ứng được các yêu cầu về chất lượng, độ an toàn
và tính hiệu quả [13], [17], [25]. Trong quá trình thu hoạch, vận chuyển, bảo
quản và phân phối, thảo dược là mục tiêu lây nhiễm của nhiều loại nấm mốc
khác nhau (đặc biệt là các loài của chi Aspergillus) và là nguyên nhân gây hư
hỏng và tạo thành mycotoxin [14]. Mã tiền (Semen Strychni) và khiếm thực
(Semen Euryales) là các vị thuốc được dùng khá phổ biến trong đông y. Mã

tiền, ngoài việc được dùng để chiết strychnin trong tây y, còn được dùng nhiều
trong đông y để chữa tê thấp, bại liệt và bán thân bất toại [9]. Khiếm thực cũng
được dùng khá phổ biến trong đông y để làm thuốc bổ, điều trị các bệnh như
đau nhức dây thần kinh, tê thấp, đau đầu gối, di tinh, tiểu tiện nhiều, phụ nữ khí
hư bạch đới [9]. Tuy nhiên, cho đến nay ở trong nước vẫn chưa có một công
trình nghiên cứu nào về mức độ nhiễm nấm mốc, đặc biệt là các loài của chi
Aspergillus và mycotoxin trên các thảo dược này. Để góp phần nâng cao hiệu
quả sử dụng, độ an toàn của thảo dược nói chung, các vị thuốc mã tiền và khiếm
thực nói riêng, đề tài “Nghiên cứu tính đa dạng loài của chi Aspergillus Fr.:
Fr. trên các vị thuốc mã tiền (Semen Strychni) và khiếm thực (Semen
Euryales) đang lưu hành trên địa bàn Hà Nội” đã được thực hiện với 2 mục
tiêu sau:
1. Phân lập các chủng nấm nhiễm trên các mẫu của hai vị thuốc nghiên cứu.
2. Phân loại các chủng nấm thuộc chi Aspergillus phân lập được đến cấp loài.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Một vài nét về chi Aspergillus Fr.: Fr.
Chi Aspergillus do Micheli mô tả lần đầu năm 1729, sau đó đến năm
1832 được Fries chấp nhận và theo luật quốc tế về danh pháp thực vật, chi
Aspergillus chính thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries. Sau này Fries lại
xem xét bổ sung nên được mang tên Aspergillus Fries ex Fries.
Chi Aspergillus đặc trưng bởi những đặc điểm sau: Hệ sợi nấm gồm các
sợi có vách ngăn, phân nhánh, không màu, màu nhạt hoặc trong một số trường
hợp trở thành màu nâu hay màu sẫm, một số ngả màu xanh lá cây khác nhau ở
các vùng nhất định của khuẩn lạc. Cấu trúc mang bào tử trần phát triển từ một
tế bào có đường kính lớn hơn, thành tế bào dày hơn. Giá bào tử trần
(conidiophore) được cấu tạo bởi một cuống (stipe) không phân nhánh, với phần

đỉnh phồng to gọi là bọng (vesicle) hình chùy, hình elip, hình cầu hoặc nửa cầu.
Bọng này mang các thể bình. Các thể bình (phialide) được gọi là thể bình một
tầng (uniseriate phialide), hoặc trên cuống thể bình (metula) là thể bình hai tầng
(biseriate phialide). Conidi (conidium) được tạo thành nối tiếp nhau từ thể bình.
Conidi chỉ gồm một tế bào, bề mặt nhẵn hoặc xù xì, có gai, không màu hoặc có
màu. Bọng, thể bình, cuống thể bình (nếu có) và conidi hình thành một khối
conidi (conidial head) (hình 1.1). Khối conidi có thể hình thành dạng cột
(columnar), dạng phóng xạ (radiate) hoặc dạng cầu (globose). Một số loài có
bào tử túi (ascosporum) trong các thể quả kín (cleitothecium), thể quả có thể
nằm trong đệm nấm dạng hạch cứng (sclerotium) là các khối sợi thường có
dạng hình cầu, cứng. Hình thức hữu tính: Eurotium, Emericella, Neosartorya
và một số chi khác.
Nhiều loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus phân bố rộng rãi trên các cơ
chất tự nhiên, đặc biệt là lây nhiễm trên các loại hạt lương thực, các loại cơ chất
chết có nguồn gốc thực vật [6], ở nhiều vùng địa lí khác nhau trên thế giới. Ở
2


các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới sự xuất hiện của chi Aspergillus phổ biến
hơn rất nhiều so với các loài của chi Penicillium.

Hin
̀ h 1.1. Cấu trúc sinh conidi của chi Aspergillus
Một số loài của chi nấm này được dùng trong công nghệ lên men, hoặc
các ứng dụng trong công nghệ sản xuất acid hữu cơ (acid citric, acid glucomic)
hoặc các enzym (amylase, protease) [19]. Mặt khác, một số loài có khả năng
gây bệnh ở người và động vật [32] hoặc có khả năng sinh các chất chuyển hoá
thứ cấp độc (mycotoxin) [15], [17].
Hệ thống phân loại chi Aspergillus của Raper & Fennell (1965) [20] gồm
18 nhóm (Group) và có 132 loài với 18 thứ. Samson (1979, 1992, 1994a & b)

đã công bố sưu tập dữ liệu của các loài, thứ đã được mô tả từ 1965 và chỉ ra sự
bất hợp lý của một số taxon đã được công bố. Đến nay, số lượng các loài của

3


chi đã được phát hiện lên tới trên 200 loài, trong đó có khoảng trên 70 loài là
các trạng thái hữu tính [19].
Nhận diện nấm bằng nuôi cấy: các chủng đã phân lập được cấy đơn bào
tử tại 3 điểm trên môi trường Czapek và MEA 2% và ủ ở 25 0 C. Đối với các
loài nấm ưa khô như A. penicillioides, trạng thái hữu tính Eurotium và một số
loài khác có thể sử dụng các môi trường Czapek và MEA với 20-40% đường
kính. Các chủng thuộc 2 loài A. flavus và A. parasiticus được nuôi cấy xác định
trên môi trường ADM. Trong điều kiện nuôi cấy trên các môi trường, sử dụng
các đĩa Petri thuỷ tinh tốt hơn là sử dụng các đĩa Petri bằng chất dẻo. Hầu hết
các loài hình thành bào tử trong vòng 7 ngày. Quan sát bằng kính hiển vi các
đặc điểm và cấu trúc của khối conidi sau nuôi cấy. Cần có biện pháp phòng
tránh hít phải bào tử do một số loài của chi Aspergillus có thể gây bệnh ở người
(đặc biệt là A. fumigatus).
Tình hình nghiên cứu chi Aspergillus và độc tố trên thảo dược ở ngoài
nước
Hiện nay, trên thế giới xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc
thực vật để làm thuốc ngày một tăng. Tuy nhiên, việc sử dụng càng nhiều thực
vật làm thuốc càng tạo ra mối nguy cơ về sức khỏe cho cộng đồng do thiếu các
nghiên cứu cần thiết về cách sử dụng, tính hiệu quả, độc tính, và chất lượng của
các sản phẩm tự nhiên này. Khi nguồn dược thảo được sử dụng tăng cao có thể
dẫn đến việc tăng lượng mycotoxin đưa vào cơ thể. Bởi vậy, dược thảo nhiễm
mycotoxin có thể gây ra các vấn đề bất lợi đối với sức khỏe con người, và có
thể dẫn đến rủi ro nguy hiểm đến tính mạng. Sự xuất hiện tự nhiên của nhiều
mycotoxin trong các loại thực vật làm thuốc và các dược thảo truyền thống

được ghi nhận ở nhiều nước trên thế giới như Tây Ban Nha, Trung Quốc, Đức,
Ấn Độ, Thổ Nhĩ Kỳ, và các nước Trung Đông [13], [17], [25].

4


Mycotoxin là các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp độc được tạo bởi các chi
nấm quan trọng như Aspergillus, Penicillium, Fusarium và Alternaria.
Mycotoxin cũng có thể được định nghĩa là các chất chuyển hóa của nấm, khi
ăn phải, hít phải hay được hấp thu qua da gây ra các bệnh khác nhau, được gọi
chung là bệnh do độc tố nấm (mycotoxicosis), hoặc gây tử vong ở người và
động vật. Mycotoxin có thể gây ra nhiều tác động khác nhau như gây ung thư,
độc với hệ thần kinh, gây quái thai, và làm tổn thương hệ miễn dịch. Cho đến
nay, có khoảng 400 mycotoxin đã được phát hiện. Tuy nhiên, xét về tác hại đối
với sức khỏe con người và động vật nuôi, các mycotoxin quan trọng là
aflatoxin, ochratoxin A, fumonisin, zearalenone, và deoxynivalenol. Các
mycotoxin này thường được phát hiện trên các sản phẩm như ngũ cốc, các loại
quả hạch, dược thảo, và các loại gia vị. Các sản phẩm có nguồn gốc thực vật,
khi được bảo quản qua nhiều ngày (trên 48 giờ) sẽ nhạy cảm với sự phát triển
của nấm mốc và sự hình thành mycotoxin. Sự lây nhiễm có thể xuất hiện trước
thu hoạch, hoặc giai đoạn sau thu hoạch. Khí hậu nhiệt đới ẩm hoặc điều kiện
bảo quản kém là các yếu tố môi trường thuận lợi cho nấm mốc phát triển và tạo
thành mycotoxin. Sự hình thành độc tố nấm mốc có thể tăng lên khi gặp các
điều kiện khác như khô hạn, tổn hại do côn trùng hoặc thu hoạch bằng máy móc
trong quá trình trồng trọt và bảo quản [13].
Đánh giá mức độ nhiễm và khả năng sinh độc tố của các loài nấm mốc
trên 152 mẫu nguyên liệu thô có nguồn gốc từ 56 loài thảo dược, được thu thập
từ 13 cơ sở sản xuất của Achentina [23], bằng các phương pháp phân lập, nhận
diện chuẩn cho thấy: có 52% của 152 mẫu nghiên cứu bị nhiễm các loài của chi
Aspergillus. Trong số này, có 27% thuộc nhóm loài A. flavus và 25% thuộc

nhóm loài A. niger. Ngoài ra, 16% tổng số mẫu đã bị nhiễm các loài của chi
Fusarium. Các loài A. flavus và A. parasiticus phân lập được nhiều nhất, với
50% trong số 40 chủng phân lập được có khả năng sinh độc tố, và nồng độ
5


aflatoxin xác định được dao động trong khoảng 10-2000 ng/g. Trái lại, chỉ có
26% số chủng của nhóm loài A. niger phân lập được có khả năng sinh độc tố
ochratoxin A ở nồng độ thấp, trong khoảng 0,12-9,0 ng/g. Qua tỷ lệ nhiễm các
loài nấm có khả năng sinh độc tố trên các mẫu dược thảo nghiên cứu, cho thấy
sự cần thiết phải điều tra mức độ nhiễm tự nhiên của các mycotoxin. Trên cơ
sở đó mới có thể xác định được giới hạn hợp lý về các loại độc tố, giúp quản lý
hiệu quả nguồn nguyên liệu dược thảo, tránh rủi ro cho sức khỏe cộng đồng.
Điều tra mức độ nhiễm các loài nấm sinh độc tố và mycotoxin trên 40
mẫu dược liệu của 8 cây thuốc (mỗi cây 5 mẫu gồm: Saraca indica, Terminalia
arjuna, Withania somnifera, Bacopa monnieri, Evolvulus alsinoides, Zingiber
officinale, Tribulus terrestris và Hemidesmus indicus), được thu thập từ các
chợ khác nhau của bang Agra và vùng lân cận (Ấn Độ), giai đoạn 2009-2010,
cho thấy: các loài gồm: Aspergillus niger, A. flavus, Mucor spp., và Rhizopus
spp. nổi trội so với các loài khác phân lập được. Trong số 10 mẫu bị nhiễm A.
flavus, 4 mẫu phân lập được các chủng có khả năng sinh aflatoxin [22]. Với
dược liệu bị nhiễm các chủng nấm sinh độc tố, không đồng nghĩa với sự có mặt
của mycotoxin trên nguồn cơ chất. Tuy nhiên, sự có mặt của các loài nấm là
một rủi ro tiềm tàng về khả năng nhiễm độc tố. Bởi vậy, các thảo dược phải
được bảo quản cẩn thận mới có khả năng ngăn chặn được sự phát triển của nấm
mốc sau thu hoạch. Ngoài ra, các dược liệu có nguồn gốc thực vật này phải
được kiểm tra sự có mặt của mycotoxin trước khi sử dụng.
Điều tra mức độ nhiễm nấm mốc và mycotoxin trên 50 mẫu dược liệu là
lá khô của 2 loài thực vật (Azadirachta indica và Justica adhatoda) được thu
thập từ các hiệu bán buôn và bán lẻ của 8 quận, bang Jammu và Kashmir (Ấn

Độ) bằng kỹ thuật rửa bề mặt (surface washing technique), sắc ký lớp mỏng
(TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả cho thấy: có tổng số 50
loài nấm, thuộc 30 chi đã được phân lập. Sự đa dạng của các loài nấm trên 2
6


mẫu lá tương đối giống nhau (có thể do nguồn dinh dưỡng phong phú và không
khác nhau nhiều). Các loài nấm phân lập được có khả năng sinh mycotoxin
quan trọng. Kết quả phân tích độc tố cho thấy: các aflatoxin B1, B2, và patulin
đã được phát hiện trên các mẫu lá khô của Azadirachta indica, và aflatoxin B1,
B2 và zearalenol cũng được phát hiện ở các mẫu lá cây Justica adhatoda. Trong
các mycotoxin đã được phát hiện, aflatoxin có mặt trên cả 2 loại lá (do sự có
mặt của các chủng sinh độc tố thuộc loài A. flavus). Tuy nhiên, các độc tố
ochratoxin, citrinin, zearalenone và deoxynivalenol đã không phát hiện thấy
trong các mẫu lá nghiên cứu [28].
Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm và mycotoxin trên 84 mẫu dược thảo và
gia vị thực phẩm thường dùng (có nguồn gốc từ 14 loại thực vật khác nhau,
được nhập khẩu từ Ấn Độ), được thu thập từ các hiệu bán lẻ của thủ đô Cairo,
Ai Cập. Kết quả cho thấy: 10 chi nấm đã được nhận diện. Trong đó, các loài
Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. niger, Fusarium oxysporum, và
Penicillium viricatum đã xuất hiện với tần suất cao nhất trên các mẫu dược thảo
và gia vị nghiên cứu. Kết quả phân tích mycotoxin cho thấy: 17 mẫu đã bị
nhiễm aflatoxin B1, với hàm lượng trung bình từ 10-160 µg/kg. Độc tố
ochratoxin đã bị nhiễm trong 3 mẫu, với lượng trung bình từ 20-80 µg/kg.
Không phát hiện thấy các độc tố khác như acid penicillic, zearalenone, và Ttoxin [14].
Nghiên cứu mức độ nhiễm tự nhiên của nấm mốc và độc tố trên 5 loại rễ
(cả dạng tươi và khô sau thu hoạch) của 5 loài thực vật: Aegle marmelos,
Clerodendrum phlomoides, Desmodium gangeticum, Gmelina arborea và
Oroxylum indicum bằng các phương pháp chuẩn cho thấy: đã có 43 và 37 chủng
nấm được phân lập từ các mẫu tươi (genuine) và khô ở các chợ, chủ yếu thuộc

2 chi Aspergillus và Fusarium. Định tính và định lượng các aflatoxin B1, B2,
G1 và G2 bằng BGYF test (dựa vào màu huỳnh quang vàng xanh sáng dưới
7


bức xạ tử ngoại 365 nm) và HPLC cho thấy: Các mẫu rễ tươi và khô của 5 loại
dược thảo trên đã bị nhiễm aflatoxin với lượng khác nhau, đặc biệt là aflatoxin
B1 và B2. Tuy nhiên, các độc tố này có mặt với lượng thấp hơn so với qui định
(20 µg/kg) của tổ chức Y tế Thế giới [21].
Một nghiên cứu khác khảo sát khả năng nhiễm các aflatoxin B1, B2, G1
và G2 trong các mẫu hạt của 2 loài cây Mucuna pruriens L., Portulaca
oleracceae L., và rễ của cây Delphinium denudatum Wall, được thu thập từ các
chợ của thủ đô New Delhi, Ấn Độ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với
khối phổ 2 lần (HPLC-MS/MS) cho thấy: Các aflatoxin B1, B2 đã được phát
hiện ở dạng vết (thấp hơn giới hạn phát hiện) trong hạt của cây M. pruriens,
không phát hiện được trong rễ của cây D. denudatum. Hạt của cây P. oleraceae
đã bị nhiễm aflatoxin B1 và B2. Các aflatoxin G1 và G2 đã không phát hiện
thấy ở M. pruriens, P. oleraceae, và thấp hơn giới hạn phát hiện ở D.
denudatum [29].
Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm và độc tố từ các mẫu dược thảo khô là
vỏ (từ các cây Betula utilis D. Don., Symplocos paniculata Wall., Berberis
aristata DC.), rễ (Arnebia euchroma (Royle) Johnston. Contr., Articum lappa
Linn., Plumbago zeylanica Linn., Cichorium intybus Linn.), thân rễ (Acorus
calamus Linn.), lá (Oroxylum indicum Vent.), thân và lá (Centella asiatica
Linn.) được thu thập từ các chợ ở Himachal Pradesh bằng các môi trường chuẩn
và sắc ký lớp mỏng cho thấy: Các loài nấm thuộc các chi Aspergillus, Rhizopus
và Penicillium đã có mặt trên tất các các mẫu nghiên cứu. Trong đó, A. niger
là loài phân lập được nhiều nhất. Trong 10 loại dược thảo nghiên cứu, có 7/10
dương tính với aflatoxin [26].
Khảo sát các mẫu của 3 loại quả khô (của 3 loài thực vât Emblica

officinalis, Terminalia chebula và T. bellerica) - các thành phần được dùng để
sản xuất chè thuốc cổ truyền Triphala nổi tiếng của Ấn Độ, được thu thập ngẫu
8


nghiên từ các chợ của bang Jummu và Kashmir, Ấn Độ. Kết quả điều tra cho
thấy: tất cả các mẫu phân tích đều bị nhiễm nấm. Gần một nửa các loài nấm
hoại sinh thuộc 2 chi Aspergillus và Penicillium. Kết quả phân tích độc tố cho
thấy: các mẫu nghiên cứu dương tính với nhiều loại độc tố khác nhau, bao gồm
aflatoxin (B1, B2), ochratoxin A, patulin và citrinin [27]. Với hàm lượng cao
các độc tố này trong các mẫu quả của 3 loài thực vật trên, bên cạnh việc làm
giảm hiệu quả của chè thuốc Triphala còn có thể gây ra mối nguy hiểm cho con
người do các tác dụng độc với gan, thận, và tế bào. Trên cơ sở nghiên cứu này,
các tác giả cũng đã khuyến cáo rằng: Trước khi chế tạo chè thuốc Triphala, điều
rất quan trọng là phải đánh giá cẩn thận chất lượng của 3 loại quả này về các
chỉ tiêu nhiễm nấm và mycotoxin.
Một nghiên cứu khác về mức độ nhiễm nấm mốc và mycotoxin trên 12
dược thảo dạng hạt gồm thảo quyết minh, hạt cây tơ hồng, hạt ý dĩ, sa uyển tử,
hạt sen, hạt vải, đào nhân, hạt tiêu, hạt mã đề, bá tử nhân, hạt màn màn, và hạt
quýt đã cho thấy: Với hệ vi nấm bề mặt, 34 loài thuộc 7 chi đã được phát hiện.
Trong đó, Aspergillus niger và Penicillium polonicum là các loài phổ biến nhất
(lần lượt là 12% và 15%). Các mẫu hạt dược thảo đã được kiểm tra khả năng
nhiễm 2 độc tố chính là ochratoxin và aflatoxin (B1, B2, G1 và G2) bằng thiết
bị siêu hiệu năng kết nối với detector khối phổ 2 lần (UPLC-MS/MS) cho thấy:
Các mẫu hạt trắc bách diệp (từ cây trắc bá) đã bị nhiễm độc tố aflatoxin B1
(52,0 µg/kg) và hạt quýt đã phát hiện thấy độc tố ochratoxin A (92,3 µg/kg),
quá qui định cho phép của châu Âu (lần lượt với 2 độc tố aflatoxin, ochratoxin
A là 5 µg/kg và 20 µg/kg) [15].
Tosun và cộng sự [31] đã nghiên cứu mức độ nhiễm độc tố aflatoxin trên
12 mẫu chè thuốc (herbal tea) đang lưu hành ở các cửa hiệu ở Manisa (Thổ Nhĩ

Kỳ) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết quả cho thấy: Trong số 48 mẫu được
phân tích, có 43 mẫu bị nhiễm aflatoxin. Hàm lượng cao nhất của độc tố này
9


(34,18 µg/kg) đã phát hiện thấy trên một mẫu của chè thuốc “Cúc La Mã”
(camomile tea). Tỷ lệ nhiễm các aflatoxin B1, B2, G1 và G2 được phát hiện
trong các mẫu chè thuốc lần lượt là 54; 29; 71 và 46%. Hàm lượng các độc tố
này trong các mẫu được phát hiện lần lượt dao động trong các khoảng 0-14,2;
0-12,4; 0-13,5 và 0-28,7 µg/kg. Độc tố aflatoxin đã không phát hiện thấy trong
5 mẫu của 3 loại chè thuốc khác.
Tình hình nghiên cứu chi Aspergillus và độc tố trên dược liệu ở trong
nước
Trong nước, cho đến nay các công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm
nấm mốc nói chung, chi Aspergillus nói riêng và mycotoxin trên thảo dược
không nhiều. Một số công trình nghiên cứu về tính đa dạng loài của chi
Aspergillus [7], [8], [10], [11]. Một số công trình khác nghiên cứu về mức độ
nhiễm loài A. flavus, nấm mốc nói chung và aflatoxin [1], [3], [4], [5], [6], [10].
Điểm chung của các công trình này là đều áp dụng phương pháp đặt trực tiếp
dược liệu trên môi trường PDA để phân lập các chủng nấm nhiễm. Đồng thời
cũng sử dụng môi trường Czapek Dox để nuôi cấy các chủng nấm trong khảo
sát đặc điểm khuẩn lạc và vi học trong xác định các loài. Kết luận của các công
trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc đều cho thấy các loài của chi
Aspergillus đều chiếm một tỷ lệ cao nhất trong các chủng nấm phân lập được
từ các dược thảo nghiên cứu [5], [6]. Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy,
các loài A. niger, A. flavus và A. fumigatus thường chiểm tỷ lệ cao trong các
loài của chi Aspergillus phân lập được. Ngoài ra, các kết quả nghiên cứu cũng
cho thấy, một số dược thảo như hạt sen, ý dĩ đã bị nhiễm aflatoxin (một độc tố
có khả năng gây ung thư) quá mức cho phép của ngành y tế [4], [6], [10].

10


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
10 mẫu mã tiền và 10 mẫu khiếm thực được thu thập từ các hiệu thuốc
đông dược thuộc địa bàn Hà Nội (phố Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm), được chuyển
về phòng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ phòng trước khi phân lập và phân
loại nấm.
2.1.2. Môi trường phân lập và xác định nấm mốc
• Môi trường PDA (Himedia, Ấn Độ). Thành phần (g/l): Khoai tây gọt vỏ:
200; Glucose: 20; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC) 5,6 ±0,2.
• Môi trường Dichloran Glycerol Medium Base - DGM (Himedia, Ấn Độ).
Thành phần (g/l): Peptone: 5; Glucose: 10; KH2PO4: 1; MgSO4: 0,5;
Dichloran: 0,002; Chloramphenicol: 0,1; Thạch: 15; pH cuối cùng (25 oC):
5,6 ± 0,2.
• Môi trường xác định 2 loài A. flavus và A. parasiticus: Aspergillus
Differentiation Medium Base - ADM (Himedia, Ấn Độ). Thành phần (g/l):
Peptone: 10; Cao nấm men: 20; Ferric amonium citrate: 0,5; Dichloran:
0,002; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC): 6,3 ± 0,2.
• Môi trường Czapek Dox Agar (Himedia, Ấn Độ). Thành phần (g/l): Đường
kính: 30; NaNO3: 2,0; KCl: 0,5; K2HPO4: 1,0; MgSO4.7H2O: 0,5;
FeSO4.7H2O: 0,01; Thạch: 15; pH cuối cùng (25oC): 7,3 ± 0,2.
2.1.3. Thiết bị thí nghiệm
• Kính hiển vi Axiostar plus, Carl Zeiss (Đức), gắn máy chụp ảnh kỹ thuật số
Canon (Nhật Bản).
• Tủ cấy vô trùng Aura VF48 (Đức).
• Tủ ấm Memmert (Đức)
• Tủ sấy SEL LAB (Đức)

11


• Nồi hấp tiệt trùng Hiclave HVE - 25, Hirayama (Nhật Bản).
2.1.4. Hóa chất
Dung dịch NaOCl 1%
2.2. Nội dung nghiên cứu
• Xác định hàm ẩm, xử lý các mẫu dược liệu của 2 vị thuốc nghiên cứu, đặt
lên các đĩa Petri chứa môi trường phân lập (PDA hoặc DGM) đã được chuẩn
bị và ủ ở 27ºC trong 5 ngày.
• Phân lập các chủng nấm thuộc chi Aspergillus nhiễm trên các mẫu dược liệu
nghiên cứu.
• Nuôi cấy các chủng nấm phân lập được trên môi trường Czapek Dox Agar ở
25ºC trong 5-7 ngày.
• Nuôi cấy xác định các chủng thuộc 2 loài A. flavus và A. parasiticus trên môi
trường ADM.
• Khảo sát đặc điểm khuẩn lạc, vi học, sinh hóa của các chủng nấm và xác định
loài.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu
Hàm ẩm các mẫu dược liệu được xác định bằng phương pháp "Mất khối
lượng do làm khô" theo hướng dẫn của phụ lục 9.6, DĐVN IV [2].
Cách tiến hành: Dược liệu được nghiền thô, thành mảnh nhỏ đường kính
không quá 3 mm. Cân một lượng mẫu thử (m), tiến hành làm khô trong tủ sấy
ở nhiệt độ 105C trong vòng 4 giờ với khiếm thực, và đến khối lượng không
đổi với mã tiền. Sau khi sấy, làm nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm
rồi cân ngay (m’).
Tính kết quả hàm ẩm theo công thức sau:
Hàm ẩm (%)=

m-m'
×100%
m

12


2.3.2. Phương pháp phân lập nấm mốc
Phương pháp phân lập nấm mốc trên dược liệu được áp dụng trên cơ sở
của phương pháp Samson và cộng sự (sử dụng phương pháp đặt trực tiếp trên
môi trường PDA hoặc DGM) [24]: Các mẫu dược liệu (mỗi mẫu 40g) được
khử trùng hệ vi nấm bề mặt bằng dung dịch natri hypoclorid 1% mới pha trong
2 phút. Sau đó rửa 3 lần bằng nước cất đã khử trùng. Để ráo nước và đặt nhanh
các mẫu dược liệu vào các đĩa Petri đã có môi trường PDA (hoặc DGM) bằng
kẹp vô trùng (thực hiện trong tủ cấy vô trùng). Ủ ở nhiệt độ 27°C, sau 5-7 ngày
tiến hành phân lập các chủng nấm nhiễm trên các mẫu dược liệu nghiên cứu.
2.3.3. Phương pháp phân loại nấm mốc
• Phân loại các loài của chi Aspergillus dựa trên mô tả đặc điểm khuẩn lạc, vi
học các loài của Samson và cộng sự 1995 [24], Raper và Fennell 1965 [20],
Pitt và Hocking 1985 [19]. Nguyên lý chung của phương pháp là dựa trên
sự so sánh đặc điểm khuẩn lạc (đường kính khuẩn lạc, màu sắc mặt trước và
sau của khuẩn lạc, các chất tiết trên khuẩn lạc …) và đặc điểm vi học (cấu
trúc sinh conidi, kích thước, màu sắc của cấu trúc sinh conidi và conidi, sợi
nấm …) của các chủng khi được cấy đơn bào tử tại 3 điểm trên các môi
trường chuẩn (Czapek Dox), và nuôi trong cùng điều kiện (nhiệt độ, thời
gian, nồng độ oxy…).
• Xác định 2 loài A. flavus, A. paraciticus theo phương pháp sinh hóa của Pitt
và Hocking [19]. Nguyên lý của phương pháp là các chủng của 2 loài A.
flavus, A. parasiticus khi nuôi cấy trên môi trường ADM, ủ ở nhiệt độ 30°C

sau 42-48 giờ sẽ xuất hiện màu vàng cam sáng ở mặt trái khuẩn lạc.
2.3.4. Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm
Mức độ nhiễm các loài được tính theo 2 chỉ số [18]:
• Chỉ số có mặt hay tần suất xuất hiện loài trên các mẫu nghiên cứu:

13


FQ (isolation frequency, %) =

Số mẫu có mặt loài
Tổng số mẫu nghiên cứu

x 100%

• Chỉ số có nhiều hay mật độ nấm:
RD (relative fungal density, %) =

Số chủng của loài phân lập được
Tổng số chủng nấm của chi
phân lập được

14

x 100%


CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Mức độ nhiễm các loài của chi Aspergillus trên các mẫu của vị thuốc
mã tiền

3.1.1. Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc mã tiền nghiên cứu
Một trong các yếu tố sinh thái quan trọng, ảnh hưởng đến sự lây nhiễm
và phát triển của nấm trên các cơ chất nói chung và mã tiền nói riêng là hàm
ẩm của cơ chất. Do vậy, các mẫu của vị thuốc này trước khi tiến hành phân lập
nấm, đã được xác định hàm ẩm theo phương pháp của phụ lục 9.6, DĐVN IV.
Kết quả xác định hàm ẩm của các mẫu mã tiền nghiên cứu được liệt kê
trong bảng 3.1 dưới đây.
Bảng 3.1. Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc mã tiền nghiên cứu
TT
1
2
3
4
5

Mẫu
60 LÔ
61 LÔ
57 LÔ
53A LÔ
44A LÔ

Hàm ẩm
12,09
13,23
10,94
5,92
11,67

TT

6
7
8
9
10

Mẫu
50 LÔ
52 LÔ
55 LÔ
58 LÔ
51 LÔ

Hàm ẩm
11,40
16,35
9,67
11,19
10,77

3.1.2. Mức độ nhiễm các loài của chi Aspergillus trên các mẫu vị thuốc mã
tiền nghiên cứu
Các mẫu của vị thuốc mã tiền nghiên cứu, sau khi xác định hàm ẩm đã
được xử lý các bào tử nấm bề mặt bằng natri hypoclorid 1%, đặt trực tiếp lên
môi trường PDA (hoặc DGM), phân lập các chủng nấm nhiễm sau 5-7 ngày ủ
ở nhiệt độ 27oC. Để phân loại các chủng nấm nhiễm thuộc chi Aspergillus phân
lập được đến cấp loài, tiến hành nuôi cấy trên môi trường Czapek Dox và môi
trường ADM. Khảo sát các đặc điểm khuẩn lạc, vi học và sinh hóa của các
chủng nấm nuôi cấy, đối chiếu với đặc điểm của các loài đã được mô tả từ các
tài liệu tham khảo.

a) Kết quả phân lập và phân loại

15


Kết quả phân lập và phân loại các chủng nấm nhiễm trên 10 mẫu của vị
thuốc mã tiền nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Các loài và số lượng chủng của chi Aspergillus
phân lập được từ 10 mẫu vị thuốc mã tiền nghiên cứu
60 61 57 53A 44A 50 52 55 58 51
Tên loài
Tổng Tỷ lệ
(Aspergillus) LÔ LÔ LÔ LÔ LÔ LÔ LÔ LÔ LÔ LÔ
(%)
A. flavus

16

5

A. niger

10

11

A. fumigatus

10

A. ochraceus
A. tamarii

9

1

6
1
42

11

3

1

5

25

10

10

3

2

2

2
3

A. terreus
Tổng

4

20

2

1

4

10

6

22

31

13

23

20,10

104

52,26

22

11,06

9

4,52

20

10,05

1

4

2,01

4

199

24
3
2

2
12

40

26

100
(%)

Với kết quả thu được từ bảng 3.2 cho thấy: Từ 10 mẫu mã tiền nghiên
cứu đã phân lập được 199 chủng nấm thuộc 6 loài của chi Aspergillus gồm A.
flavus, A. niger, A. fumigatus, A. ochraceus, A. tamarii và A. terreus. Trong đó,
loài A. niger (hình 3.1) chiếm tỷ lệ cao nhất về số chủng phân lập được (chỉ số
có nhiều), với tỷ lệ 52,26% (104/199). Ngoài ra, loài này cũng có tỷ lệ xuất
hiện cao nhất trên các mẫu nghiên cứu (chỉ số có mặt) là 80% (8/10 mẫu nghiên
cứu). Xếp thứ 2 là loài A. flavus (hình 3.2) có chỉ số có nhiều là 20,10%
(40/199), và chỉ số có mặt là 60% (6/10). Xếp thứ 3 là loài A. fumigatus, với
các chỉ số có nhiều và có mặt lần lượt là 11,06% (22/199) và 60% (6/10). Các
loài A. tamarii (hình 3.3), A. ochraceus (hình 3.4) và A. terreus lần lượt xếp thứ
4, thứ 5 và thứ 6 với các chỉ số có nhiều và có mặt lần lượt là: 10,05% (20/199)
và 30% (3/10); 4,52% (9/199) và 50% (5/10); 2,01% (4/199) và 30% (3/10).

16


b) Một số đặc điểm khuẩn lạc và vi học quan trọng của các loài phân lập được
từ 10 mẫu mã tiền nghiên cứu
Để khảo sát đặc điểm sinh học (khuẩn lạc, vi học, ...), các chủng nấm

được nuôi cấy đơn bào tử tại 3 điểm trên các đĩa Petri chứa môi trường Czapek
Dox Agar và được ủ ở 25oC sau 5 ngày. Bảng 3.3 dưới đây là một số đặc điểm
khuẩn lạc quan trọng của các loài phân lập được từ các mẫu mã tiền nghiên
cứu.
Bảng 3.3. Một số đặc điểm khuẩn lạc của các loài
thuộc chi Aspergillus phân lập được từ các mẫu mã tiền nghiên cứu
(môi trường Czapek Dox, 25oC, 5 ngày tuổi)

Mặt phải

Mặt trái

Đường kính
khuẩn lạc
(cm)

A. flavus

Xanh hơi vàng

Màu kem

3-5

A. niger

Đen

Trắng xám

4-5

A. fumigatus

Xanh tối

Xám xanh

3-5

A. ochraceus

Xanh

Trắng đục

2,5-4,0

A. tamarii

Nâu vàng

Trắng đục

4-5

A. terreus

Nâu quế

Trắng đục

3-5

Tên loài

Màu sắc khuẩn lạc

Một số đặc điểm vi học của các loài thuộc chi Aspergillus được trình bày
trong bảng 3.4.

17