Nghiên cứu thủy phân bã rong câu (gracilaria verrucosa) bằng enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng trong sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
------------

LÊ HƯƠNG THỦY

NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN BÃ RONG CÂU
(Gracilaria verrucosa) BẰNG ENZYM
CELLULASE TỪ VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN NUÔI CÁ RÔ
PHI ĐƠN TÍNH GIAI ĐOẠN THƯƠNG PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

KHÁNH HÒA, 2017
i

------------


BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
------------

LÊ HƯƠNG THỦY

NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN BÃ RONG CÂU
(Gracilaria verrucosa) BẰNG ENZYM
CELLULASE TỪ VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN NUÔI CÁ RÔ PHI
ĐƠN TÍNH GIAI ĐOẠN THƯƠNG PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản
Mã số
: 60.54.10.05
Người hướng dẫn khoa học: GS.TSKH. Nguyễn Trọng Cẩn
PGS.TS. Vũ Ngọc Bội

KHÁNH HÒA, 2017
ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình
nào khác.
Nha Trang, Ngày

tháng

Tác giả luận văn

Lê Hương Thủy

iii

năm 2017

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Luận án này
Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu, Lãnh đạo Khoa Sau đại học và Ban Chủ
nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên
cứu tại Trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho Thầy GS.TSKH. Nguyễn Trọng
Cẩn - nguyên Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang và PGS.TS. Vũ Ngọc Bội Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt
quá trình thực hiện Luận án.
Xin cám ơn Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Hải sản và các cán bộ Phòng Nghiên cứu
Công nghệ Sau thu hoạch, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia về Công nghệ gen
- Viện Công nghệ Sinh học, Xí nghiệp Giống thủy sản Hải Phòng, Viện Công nghệ Sinh
học và Thực phẩm - Trường Đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ
và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận án vừa qua.
Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ, động viên của gia đình và bạn bè
luôn luôn chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, Ngày

tháng

Tác giả luận văn

Lê Hương Thủy

iv

năm 2017


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................ix
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................xi
DANH MỤC SƠ ĐỒ................................................................................................... xiii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ...............................................................................................xiv
TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ...........................................xv
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3
1.1. Nguyên liệu rong biển và tình hình sản xuất Agar ...............................................3
1.1.1. Nguyên liệu rong biển ...................................................................................3
1.1.2. Các quy trình sản xuất agar ...........................................................................4
1.1.3. Thành phần cơ bản của bã thải agar ..............................................................8
1.1.4. Các phương pháp xử lý bã thải agar ..............................................................9
1.2. Tổng quan về Cellulase .....................................................................................11
1.3. Enzym Cellulase .................................................................................................13
1.3.1. Định nghĩa và phân loại ...............................................................................13
1.3.2. Tính chất ......................................................................................................14
1.3.3. Cơ chế thủy phân cellulose ..........................................................................15
1.3.4. Cơ chế tác dụng của cellulase......................................................................16
1.4. Vi sinh vật tổng hợp Cellulase ...........................................................................18
1.4.1. Giới thiệu chung về các nhóm vi sinh vật tổng hợp cellulase .....................18
1.4.2. Một số chủng vi sinh vật được ứng dụng nhiều trong sản xuất cellulase ...22
1.4.3. Ứng dụng của enzym cellulase vi sinh vật ..................................................24
1.4.4. Môi trường nuôi cấy và nguồn nguyên liệu ................................................26
1.4. 5. Phương pháp thu nhận enzym cellulase .....................................................27
1.5. Sản lượng nuôi cá rô phi .....................................................................................30
1.6. Đặc điểm sinh học của cá rô phi.........................................................................32
v

1.6.1. Phân loại ......................................................................................................32
1.6.2. Đặc điểm hình thái: .....................................................................................32
1.6.3. Đặc điểm về dinh dưỡng và sinh trưởng. ....................................................33
1.6.4. Nhu cầu dinh dưỡng của cá rô phi ...............................................................34
1.6.5. Nhu cầu dinh dưỡng và ảnh hưởng của thức ăn lên sinh trưởng của cá rô
phi. .........................................................................................................................38
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................42
2.1. Đối tượng ............................................................................................................42
2.1.1. Bã thải rong sau sản xuất agar .....................................................................42
2.1.2. Giống vi sinh vật sinh cellulase ...................................................................42
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................43
2.2.1. Phương pháp phân tích ................................................................................43
2.2.2. Các phương pháp thu nhận và xác định hoạt tính cellulase ........................44
2.2.3 Phương pháp nuôi cấy và đánh giá khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi
sinh vật...................................................................................................................47
2.2.4. Phương pháp xây dựng mô hinh thực nghiệm ............................................50
2.3. Hóa chất và thiết bị chủ yếu sử dụng trong luận án ................................................57
2.3.1. Hóa chất .......................................................................................................57
2.3.2. Thiết bị.........................................................................................................57
2.4. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................................58
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .....................................59
3.1. Khảo sát đánh giá khối lượng và thành phần hóa học cơ bản của bã thải rong câu
chỉ vàng sau sản xuất agar .........................................................................................59
3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật và nghiên cứu một số tính chất cơ bản của các
chủng vi sinh vật tuyển chọn .....................................................................................61
3.2.1. Kết quả nghiên cứu tuyển chọn các chủng giống vi sinh vật ......................61
3.2.2. Nghiên cứu một số tính chất cơ bản của các chủng vi sinh vật tuyển chọn ....65
3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn B.

Subtilis VTCC B-505 và B. Lichenformis (Li) và ứng dụng thủy phân bã rong câu
(G. Verrucosa) sau sản xuất Agar..............................................................................72
3.3.1. Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi sản xuất enzyme cellulase
từ 2 chủng B505 và Li ...........................................................................................72
vi


3.3.2. Đề xuất quy trình nuôi cấy và thu nhận chế phẩm cellulase thô .................80
3.3.3. So sánh đánh giá hoạt tính cellulase của chủng Li và B505 với chế phẩm
cellulase từ các VSV khác .....................................................................................84
3.3.4. Nghiên cứu thủy phân bã thải rong sau sản xuất agar bằng enzyme cellulase
từ hai chủng vi khuẩn B 505 và Li ........................................................................88
3.4. Thử nghiệm sử dụng chế phẩm thủy phân bã thải rong trong thức ăn nuôi cá rô
phi ..............................................................................................................................95
3.4.1. Xây dựng công thức thức ăn nuôi cá rô phi ................................................95
3.4.2. Đề xuất quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi .......................................97
3.4.3. Điều kiện môi trường nuôi thử nghiệm cá rô phi ......................................100
3.4.4. Thử nghiệm nuôi cá rô phi bằng thức ăn bổ sung chế phẩm thủy phân bã rong
.............................................................................................................................104
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................108
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN
LUẬN ÁN ...................................................................................................................110
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................111

vii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A530

: Đo OD ở bước sóng 530nm

B26

: Vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-26

B505

: Vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-505

CMC

: Carbonyl – methyl cellulose

CMCase
CPF
Thailand
ĐC

: Carbonyl – methyl cellulase

DNSA

: 2 –hydroxyl – 3,5 dinitrobenzoic acid

DO

: Hàm lượng oxy hòa tan

DWG

FCR

: Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối
: Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ Chức
Liên Hiệp Thế Giới về Lương Thực và Nông Nghiệp)
: Feed convertion ratio (Hệ số chuyển đổi thức ăn)

K-Na

: TartratePotassium Sodium Tartrate Tetrahydrate

Li

: Vi khuẩn Bacillus lichenformis

NT

: Nghiệm Thức

Nxb

: Nhà xuất bản

OD

: Optical Density ( mật độ quang học)

TCA

: Tricloacetic axit

TLS

: Tỷ lệ sống

TM & SX

: Thương mại và sản xuất

TNHH

: Trách nhiệm hữu hạn

USD

: Đô la Mỹ

VSV

: Vi sinh vật

Wt

: Khối lượng cá ứng với thời điểm t

FAO

: Tập đoàn Nông sản Charoen Pokphand Thái Lan
: Đối chứng

viii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Vi sinh vật phân hủy lignocellulose ................................................................19
Bảng 1.2. Các vi khuẩn có hoạt tính cellulase riêng cao nhất (µmol/phút/mg) ..............20
Bảng 1.3. Phân biệt cá đực, cá cái ..................................................................................32
Bảng 1.4. Giới hạn các thành phần trong thức ăn có giá thành ít nhất cho cá rô phi ở các
giai đoạn ................................................................................................................35
Bảng 1.5. Cung cấp bổ sung vitamin và khoáng chất trong thức ăn của cá rô phi ..........36
Bảng 1.6. Tiêu chuẩn kỹ thuật của thức ăn nuôi cá rô phi và chế độ ăn trong nuôi lồng
và ao thâm canh ....................................................................................................37
Bảng 1.7. Thành phần hoá học cá rô phi nuôi bằng thức ăn viên có hàm lượng protein
34,2 (%) ................................................................................................................40
Bảng 1.8. Nuôi cá rô phi bằng thức ăn viên có hàm lượng protein (%) khác nhau. .......40
Bảng 1.9: Nuôi cá rô phi với tỷ lệ thức ăn (%)/thân khác nhau ......................................41
Bảng 2.1. Xây dựng đường chuẩn glucose ......................................................................46
Bảng 3.1. Khối lượng bã thải rong sau sản xuất agar từ các vùng rong nguyên liệu khác
nhau .......................................................................................................................59
Bảng 3.2. Hàm lượng các chất cơ bản trong bã rong câu của một số cơ sở sản xuất Agar
...............................................................................................................................60
Bảng 3.3. Hàm lượng kim loại nặng trong bã rong câu của một số cơ sở sản xuất Agar
...............................................................................................................................60
Bảng 3.4. Hoạt tính cellulase ngoại bào của 17 chủng vi sinh vật nghiên cứu ...............62
Bảng 3.5. Hoạt tính enzym cellulase của chủng Li, B505, B26 và CFd .........................63
Bảng 3.6. Hoạt tính cellulase ngoại bào của chủng Li, B505 trên đĩa thạch có cơ chất
bột giấy 0,2% ........................................................................................................69
Bảng 3.7. Khả năng thủy phân bã thải agar bằng cellulase từ 2 chủng Li và B505 ........70
Bảng 3.8. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 nuôi trong

các môi trường khác nhau .....................................................................................73
Bảng 3.9. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng Li nuôi cấy ở các
môi trường khác nhau ...........................................................................................73
Bảng 3.10. Khả năng sinh trưởng và vòng hoạt tính của chủng B505 và chủng Li tại các
nhiệt độ khác nhau ................................................................................................76
ix


Bảng 3.11. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase của chủng B505 và chủng Li ở các pH
khác nhau ..............................................................................................................77
Bảng 3.12. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng Li theo thời gian
nuôi cấy .................................................................................................................78
Bảng 3.13. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 theo thời
gian nuôi cấy .........................................................................................................79
Bảng 3.14. So sánh hoạt tính cellulase từ 5 chủng VSV (A. niger, T. konigii, Li, B505 và
T3) trên đĩa thạch có CMC 0,2% ..........................................................................85
Bảng 3.15. So sánh hoạt tính cellulase từ 5 chủng VSV (A. niger, T. konigii, Li, B505
và T3) trên đĩa thạch có cơ chất bột giấy 0,2% ....................................................87
Bảng 3.16. Kết quả thí nghiệm của mô hình Box-Behnken ............................................89
Bảng 3.17. Kết quả xử lý số liệu trên phần mềm DX6 ....................................................89
Bảng 3.18. Kết quả dự đoán tối ưu cho tỷ lệ Naa/Nts theo mô hình Box-Behnken..........91
Bảng 3.19. Kết quả kiểm chứng tối ưu theo tiên đoán và thực nghiệm ..........................92
Bảng 3.20. Thành phần hóa học của các nguyên liệu phối trộn ......................................95
Bảng 3.21. Thành phần nguyên liệu của các công thức thức ăn phối trộn bã rong thủy
phân. ......................................................................................................................99
Bảng 3.22. Dao động các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm .....................101
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của công thức thức ăn đến sinh trưởng của cá rô phi trong 80 ngày
nuôi......................................................................................................................104

x

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc cellulose và mạng lưới liên kết hydrogen ......................................11
Hình 1.2. Sự sắp xếp các chuỗi cellulose trong thành tế bào thực vật .........................12
Hình 1.3. Cơ chế tác động của enzym cellulase ...........................................................17
Hình 1.4. Cơ chế thủy phân cellulose ............................................................................17
Hình 1.5. Hình dạng nấm mốc A. niger .........................................................................23
Hình 1.6. Hình dạng nấm Trichoderma viride .............................................................23
Hình 2.1. Bã thải sau sản xuất agar ...............................................................................42
Hình 2.2. Cá rô phi ........................................................................................................43
Hình 2.3. Bố trí các giai nuôi thử nghiệm cá rô phi ......................................................55
Hình 3.1. Hình ảnh về đường kính vòng thủy phân CMCcủa 4 chủng vi sinh vật lựa
chọn trên đĩa thạch chứa 1% CMC .......................................................................63
Hình 3.2. Điện di đồ chế phẩm cellulase thô thu nhận từ vi khuẩn B505 và Li trên gel
polyacrylamis 12,5 % theo hệ đệm Laemmi ........................................................68
Hình 3.3. So sánh vòng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn Li, B505 trên đĩa thạch bổ
sung cơ chất bột giấy 0,2% ...................................................................................69
Hình 3.4. Khả năng thủy phân bã thải agar của cellulase ngoại bào từ chủng Li và B505 .....71
Hình 3.5. Khả năng thủy phân bã thải agar của hỗn hợp cellulase ngoại bào từ 4 chủng
(B505, B26, Li, CFd) ............................................................................................71
Hình 3.6. Hình ảnh về vòng thủy phân của cellulase từ chủng B505 nuôi trong các môi
trường khác nhau ..................................................................................................72
Hình 3.7. Hình ảnh về vòng thủy phân của cellulase từ chủng vi khuẩn Li nuôi trong
các môi trường khác nhau .....................................................................................74
Hình 3.8. Khả năng sinh trưởng và vòng hoạt tính của chủng B505 và chủng Li tại các
nhiệt độ khác nhau ................................................................................................75
Hình 3.9. Vòng hoạt tính cellulase của chủng B505 và chủng Li nuôi cấy ở các pH
khác nhau ..............................................................................................................77
Hình 3.10. Đường kính vòng thủy phân của cellulase từ Li, B505 và T3 trên đĩa thạch

có cơ chất CMC 0,2% ...........................................................................................84
Hình 3.11. Đường kính vòng thủy phân cellulase từ Tricoderma trên đĩa thạch có cơ
chất CMC 0,2 %....................................................................................................85
Hình 3.12. Hoạt tính cellulase Aspergillus trên đĩa thạch có cơ chất CMC 0,2 % .......85
xi


Hình 3.13. Hoạt tính cellulase của 2 chủng nấm Tricoderma và Aspergillus nuôi ở các
môi trường khác nhau trên đĩa thạch có chứa cơ chất bột giấy 0,2 %. .................86
Hình 3.14. Hình ảnh về đường kính vòng thủy phân cellulase từ Li, B505 và T3 trên
đĩa thạch có cơ chất bột giấy 0,2 % ......................................................................86
Hình 3.15. Đường đồng mức và bề mặt đáp ứng (3D) của hàm lượng đường tổng số
theo thời gian thủy phân và nồng độ enzyme .......................................................91
Hình 3.16. Đường đồng mức và bề mặt đáp ứng (3D) tiên đoán hàm lượng đường tổng
số theo thời gian thủy phân và nồng độ enzyme...................................................92

xii


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Quy trình công nghệ sản xuất agar theo quy mô bán cơ giới ............................6
Sơ đồ 1.2 Cơ chế chuyển hóa cellulose .........................................................................16
Sơ đồ 1.3. Thu nhận cellulase từ A. niger .....................................................................28
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát.................................................................51
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ thí nghiệm sử dụng chế phẩm bã rong thủy phân trong nuôi cá rô phi
...............................................................................................................................53
Sơ đồ 3.3. Quy trình thủy phân bã rong bằng cellulase từ vi khuẩn .............................93
Sơ đồ 3.4. Quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi ....................................................97

xiii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 1.1. Tăng trưởng sản lượng cá rô phi, cá da trơn và cá hồi giai đoạn 1980 –
2010 ......................................................................................................................30
Biểu đồ 3.1. Hoạt tính enzyme cellulase của 17 chủng vi sinh vật đã thử nghiệm .......62
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ enzym cellulase ngoại bào của bốn chủng
vi khuẩn Li, B26, B505, CFd ................................................................................65
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzym cellulase ngoại bào của 4
chủng Li, B26, B505, CFd ....................................................................................66
Biểu đồ 3.4. Hoạt tính cellulase ngoại bào của chủng Li theo thời gian nuôi cấy ........78
Biểu đồ 3.5. Sự thay đổi hoạt tính cellulase của chủng B505 theo thời gian nuôi cấy .........79
Biểu đồ 3.6. Biến động nhiệt độ nước ao thí nghiệm nuôi cá rô phi. ..........................101
Biểu đồ 3.7. Biến động DO nước ao thí nghiệm nuôi cá rô phi ..................................102
Biểu đồ 3.8. Biến động độ pH của nước ao thí nghiệm ..............................................103
Biểu đồ 3.9. Tốc độ sinh trưởng (g/con) và DWG (g/ngày) của cá rô phi với thức ăn
phối trộn bã rong thủy phân khác nhau sau 80 ngày nuôi. .................................105
Biểu đồ 3.10. Hệ số chuyển đổi thức ăn của nuôi thử nghiệm các công thức thức ăn.....106

xiv


TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Đề tài luận án:

“Nghiên cứu thủy phân bã rong câu (Gracilaria verrucosa) bằng
enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng trong sản xuất thức ăn
nuôi cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm”.

Ngành/Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến thủy sản

Mã số:

62540105

Nghiên cứu sinh:

Lê Hương Thủy

Người hướng dẫn: 1. PGS. TSKH. Nguyễn Trọng Cẩn
2 PGS. TS. Vũ Ngọc Bội
Cơ sở đào tạo:

Trường Đại học Nha Trang

Tóm tắt những đóng góp mới về lý luận và học thuật của luận án:
Bã thải rong từ công nghệ sản xuất agar thường giàu cellulose là hợp chất hữu
cơ rất khó bị phân hủy. Trên thế giới hiện nay, người ta đã tiến hành xử lý phế liệu rong
biển để làm thức ăn gia súc bằng một số phương pháp thủy phân trong môi trường kiềm
hoặc axit. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học thường
phức tạp, tốn kém và gây ô nhiễm môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải
hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ vi sinh, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase
ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường.
Thủy phân cellulose từ bã rong phế thải sẽ giúp động vật tiêu hóa và hấp thụ dễ dàng
các protein, glucide, các nguyên tố khoáng đa vi lượng có trong bã thải sau quá trình sản
xuất agar. Sự thành công của đề tài sẽ cơ sở khoa học cho việc tận dụng bã thải rong câu
trong sản xuất thức ăn nuôi động vật thủy sản.

Người hướng dẫn
(Ký và ghi rõ họ tên)

Nghiên cứu sinh
(Ký và ghi rõ họ tên)

Lê Hương Thủy

xv


Key Findings
Thesis title:

"Study on hydrolysis of seaweed wastes (Gracilaria verrucosa) by

cellulase enzyme from bacteria to apply in the production of feed for tilapia".
Mayor:

Seafood processing technology

Major code: 62540105
PhD Student: Lê Hương Thủy
Supervisor:
1. Prof. PhD. Nguyen Trong Can
2 Assoc. Prof, PhD. Vu Ngoc Boi
Institution: (Nha Trang University)
Key Findings:
Seaweed waste from agar production technologies are often richly organic
cellulose that is very difficult to decompose. Todays, seaweed waste has processed to
produce animal feeds by several hydrolysis methods in alkali or acidification. However,
the processing of cellulose by physical and chemiscal methods are often complicate,
expensive and polluting the environment. while the treatment of organic waste

containing cellulose by microbial technology, especially the use of cellulase enzyme
from microbial extracellular would have advantages in technical, economic and
environmental aspects. Hydrolysis of cellulose from seaweed waste will help animals
digest and easily absorb protein, glucide, mineral elements in the waste after the
production of agar. The success of the research will be scientific basis for the utilization
of seaweed waste in feed production of aquatic animals.

Phd Student

Le Huong Thuy

xvi


MỞ ĐẦU
Agar là hợp chất hữu có có nguồn gốc từ rong biển và được sử dụng trong nhiều
lĩnh vực của đời sống như dùng làm môi trường nuôi cấy vi sinh, dùng trong chế biến
các sản phẩm thực phẩm,… Trên thế giới, sản lượng agar vào khoảng 7.000 - 10.000
tấn/năm [26]. Hàng năm Việt Nam sản xuất khoảng 500 tấn agar [30]. Quá trình chiết
rút agar từ rong câu thường thải ra môi trường một lượng lớn bã thải hữu cơ thải, ước
tính vào khoảng 6 - 8 tấn bã thải hữu cơ/1 tấn sản phẩm agar. Như vậy, ước tính hàng
năm lượng bã thải rong thải ra từ quá trình sản xuất agar ở nước ta vào khoảng 7.000 ÷
9.000 tấn [15]. Riêng thành phố Hải Phòng có khoảng 40 xưởng sản xuất agar từ rong
biển. Trong đó, xưởng sản xuất agar của Công ty Đồ hộp Hạ Long sản xuất 50 tấn
agar/năm và một số xưởng sản xuất agar khác tại Hải Phòng được tư nhân đầu tư sản
xuất với công suất trung bình 10 tấn/năm [30]. Trong bã thải rong có chứa protein,
carbohydrat, các khoáng chất có nguồn gốc từ biển như iod, phosphat, các nguyên tố vi
lượng cần thiết cho sự sinh trưởng phát triển của động vật nuôi. Chính vì thế, bã thải
rong nếu không được tận dụng một cách hợp lý sẽ dẫn tới lãng phí và gây ô nhiễm môi
trường nghiêm trọng. Vì vậy, việc nghiên cứu nhằm sử dụng một cách hợp lý nguồn bã

thải rong, góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường và nâng cao giá trị cho nguồn tài nguyên
rong biển, tạo công ăn việc làm cho người dân ven biển, giúp xóa đói giảm nghèo là cần
thiết. Do vậy việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu thủy phân bã rong câu (Gracilaria
verrucosa) bằng enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng trong sản xuất thức ăn nuôi
cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm” là hướng nghiên cứu cần thiết và có ý nghĩa
thực tiễn cao.
Mục đích của luận án
Sử dụng phế thải rong câu trong sản xuất Agar để tạo ra nguồn nguyên liệu bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường.
Nội dung nghiên cứu của luận án
1) Đánh giá lượng bã thải rong và xác định thành phần cơ bản của bã thải rong
sau sản xuất agar.

1


2) Sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh cellulase cao từ bộ sưu tập giống vi khuẩn
của Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.
3) Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô từ chủng vi khuẩn đã lựa chọn và ứng
dụng thủy phân bã rong câu (Gracilaria verrucosa) sau sản xuất agar.
4) Thử nghiệm sử dụng sản phẩm thủy phân bã rong bằng enzyme cellulase từ vi
khuẩn trong sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm.
Ý nghĩa khoa học của luận án
Luận án lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng enzyme cellulase từ vi khuẩn trong xử
lý bã thải rong sau sản xuất agar và sử dụng dịch thủy phân bã rong làm thức ăn nuôi cá
rô phi. Luận án có ý nghĩa khoa học cao do kết quả nghiên cứu của Luận án đã khẳng
định hoàn toàn có thể ứng dụng enzyme cellulase để chuyển bã thải rong sau sản xuất
agar thành sản phẩm hữu ích dùng trong nuôi cá rô phi ở quy mô công nghiệp.
Ý nghĩa thực tiễn của luận án

Thành công của đề tài có ý nghĩa về thực tiễn cao bởi giúp giảm thiểu ô nhiễm môi
trường từ công nghệ sản xuất agar và giúp nâng cao giá trị của rau câu chỉ vàng, giảm
chi phí sản xuất trong nuôi cá rô phi và đem lại hướng mới trọng tận dụng bã thải rong
sau chế biến.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Nguyên liệu rong biển và tình hình sản xuất Agar
1.1.1. Nguyên liệu rong biển
Rong biển là thực vật thủy sinh có đời sống gắn liền với nước. Chúng có thể là đơn
bào, đa bào sống thành quần thể. Chúng có kích thước hiển vi hoặc có khi dài hàng chục
mét. Hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất
đặc biệt. Rong biển là loại thực vật biển quý giá được làm nguyên liệu chế biến thành
sản phẩm có giá trị trong công nghiệp, y dược và thực phẩm. Từ lâu rong biển đã được
coi là đối tượng nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới [10], [69]. Các ngành rong biển
được chú ý và đã đưa vào sản xuất công nghiệp và đời sống gồm: ngành rong đỏ, ngành
rong nâu, rong lục. Sản lượng lớn rong nâu được dùng sản xuất acid alginic và alginat
và quan trọng hơn là ngành rong đỏ được dùng để sản xuất agar và carrageenan.
Một số loài rong đỏ có hàm lượng cao về agar, carrageenan, furcellaran. Theo tài
liệu FAO, nhóm rong cho agar thuộc ngành rong Đỏ bao gồm các loại như: Gelidium,
Gracilaria và Acanthopeltis. Rong biển phân bố ở các vùng nước mặn, nước lợ, cửa
sông, vùng triền sâu, vùng biển cạn... Ở nước ta có một số vùng chuyên canh trồng rong
câu chỉ vàng, thuộc ngành rong Đỏ, như: Phá Tam Giang (Lăng Cô - Thừa Thiên Huế);
Đầm Thị Nại (Bình Định); Đầm Ô Loan (Phú Yên) [11], [26].
Rong biển nước ta có sản lượng lớn là rong mơ Sargasum có thành phần acid
alginic với chất dinh dưỡng cao chưa được khai thác và sử dụng, rong sụn cũng đang
được trồng và chế biến thành carrageenan. Đặc biệt là rong câu Gracilaria là loài có giá
trị kinh tế cao. Theo báo cáo điều tra khảo sát của chuyên gia tư vấn thuộc chương trình

hỗ trợ phát triển nuôi trồng thuỷ sản nước lợ SUMA, sản lượng thu hoạch rong câu
gracilaria ở nước ta mỗi năm khoảng 5000 tấn khô, còn theo con số ước tính của tổ chức
FAO thì sản lượng này là khoảng 7000 tấn. Rong câu phân bố chủ yếu ở các địa phương
như Hải Phòng, Nam Hà, Thái Bình,Thanh Hoá và Thừa Thiên Huế [26], [30], [99].
Sản lượng agar trung bình hàng năm của toàn thế giới là 7.000 – 10.000 tấn/năm.
Nam Triều Tiên cung cấp nguyên liệu sản xuất agar chiếm 40% tổng sản lượng toàn thế
giới. Sản lượng agar sản xuất tại các nước như sau: châu Á: 50% (chủ yếu là Nhật Bản

3


và Hàn Quốc); châu Âu: 30% (Pháp, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha); châu Mỹ: 15% (Mỹ,
Achentina, Brazil, Chilê); châu Phi: 5% (Marốc) [11], [99].
Công nghệ sản xuất agar ở Việt Nam bắt đầu hình thành năm 1960, nhưng lúc đó
tốc độ phát triển chậm do hạn chế bởi kiến thức, công nghệ thiết bị và thị trường. Năm
1983 dưới sự giúp đỡ của cộng hoà dân chủ Đức, một xưởng pilot agar công suất 50
tấn/năm đựợc lắp ráp tại Nhà máy cá hộp Hạ Long nhưng khi vận hành, quy trình công
nghệ gặp nhiều khó khăn và công suất chỉ đạt 20 tấn/năm. Sau này công ty đồ hộp Hạ
Long đã thay đổi quy trình sản xuất và sử dụng từng phần thiết bị để sản xuất theo hướng
thủ công đạt công suất khoảng 50 tấn/năm. Từ 1986 đến 1990, Viện Nghiên cứu Hải sản
kết hợp với Viện Nghiên cứu nghề cá và hải dương học Thái Bình Dương Liên Xô
(TINRO) tiến hành nghiên cứu kỹ thuật trồng rong câu năng suất cao và cải tiến công
nghệ sản xuất agar cùng như áp dụng phương pháp ép tách nước gel agar bằng công
nghệ ép 2 bước: ép sơ bộ bằng trọng vật và ép lần cuối bằng máy ép vít. Đây là giai đoạn
phát triển mạnh của nghề sản xuất agar ở Việt Nam do nhu cầu đầu ra của nguyên liệu
và sản phẩm đều rất lớn; vùng Viễn đông Liên Xô nhập một lượng lớn rong câu khô từ
Hải Phòng với giá 600 USD/tấn, và khoảng 100 tấn agar bột đựợc tiêu thụ tại các tỉnh
phía Nam nước ta [11], [15], [26].
Trong giai đoạn từ 1985 – 1995 nghề sản xuất agar đã có bước phát triển rất lớn.
Hải Phòng là nơi tập trung các xưởng sản xuất agar, tính chung các quy mô khác nhau

có khoảng 40 xưởng với tổng sản lượng agar ước tính sản xuất đạt 500 tấn/năm với
tổng doanh thu khoảng 70 tỷ đồng và giải quyết công ăn việc làm cho hàng nghìn lao
động. Riêng xưởng agar của Công ty Đồ hộp Hạ Long có thể sản xuất thường xuyên với
công suất 50 tấn/năm, một số xưởng sản xuất agar được tư nhân đầu tư sản xuất với
công suất trung bình 10 tấn/năm [30].
1.1.2. Các quy trình sản xuất agar
Qua khảo sát tình hình sản xuất của một số cơ sở chế biến agar nhận thấy quy mô
công nghệ sản xuất agar rất đa dạng từ quy mô thủ công hộ gia đình có công suất từ 10
– 30kg/ngày đến quy mô bán thủ công có công suất là 100 – 300 kg/ngày [26], [30],
[73].
Quy trình sản xuất agar theo quy mô hộ gia đình: đây là quy mô sản xuất nhỏ,
vốn đầu tư nhỏ, thiết bị ít, lao động thủ công, công xuất từ 10 – 30 kg/ngày, Sản phẩm
4


agar chủ yếu là dạng sợi bán cho cơ sở thu mua trong miền Nam, và bán lẻ cho các cơ
sở sản xuất bánh kẹo. Chất lượng sản phẩm không cao, giá rẻ chủ yếu là tiêu thụ nội
địa [26], [30].
Quy trình công nghệ sản xuất agar theo quy mô thủ công: quy mô sản xuất này
phổ biến ở các cơ sở ở các tỉnh miền Trung như Huế, Nha Trang. Công suất chỉ khoảng
5 – 10 kg SP/ngày. Quy mô nhỏ làm theo mùa vụ chủ yếu là bán lẻ cho các cơ sản sản
xuất mứt, bánh kẹo, đông sương ở tỉnh. [26], [30].
Quy trình công nghệ sản xuất agar theo quy mô bán cơ giới: Đây là quy mô sản
xuất bán cơ giới, đầu tư nhiều thiết bị máy móc, công xuất 100 – 250 kg SP/ngày, tập
trung ỏ Hải Phòng như Công ty cổ phần đồ hộp Hạ Long, Công ty TNHH Hải Long,
Công ty cổ phần thương mại Duy Mai, Công ty TNHH Hải Đông, Công ty TNHH
TM&SX Hoàng Yến,……Chất lượng sản phẩm agar theo quy mô sản xuất này sức đông
cao, màu sáng trắng, chất lượng ổn định tiêu thụ trong nước và xuất khẩu sang thị trường
Hàn Quốc, Italia, Trung Quốc... giá thành sản phẩm khoảng 10 -12 USD/1kg SP. Nguồn
rong câu để sản xuất agar là do các cơ sở thu mua từ các vùng ven biển Việt Nam và

rong nhập khẩu từ Trung Quốc do đó tỷ lệ phế thải bã rong phụ thuộc rất nhiều vào lọai
rong và chất lượng rong. Rong câu chỉ vàng ở vùng Đình Vũ, Cát Hải - Hải Phòng và
rong ở Phá Tam Giang, Lăng Cô - Huế thì có hàm lượng agar cao và tỷ lệ bã thải thấp
khoảng 6,75T – 7T/ 1 T sản phẩm, nhưng nhiều loại rong ở Thái Bình và Nam Định,…
thì chất lượng rong kém hàm lượng agar thấp, tỷ lệ phế thải khoảng 9 – 14 T/1 T sản
phẩm [11], [15], [26].

5


Nguyên liệu

Xử lý kiềm
Tẩy màu
Xử lý axit
Nấu chiết
Lọc trong lần 1

Bã
rong

Lọc trong có trợ lọc
Làm nguội cắt sợi
Ép tách nước
Sấy khô, Nghiền bột

Bao gói Bảo quản

Sơ đồ 1.1. Quy trình công nghệ sản xuất agar theo quy mô bán cơ giới
Thuyết minh sơ đồ quy trình

+ Nguyên liệu: rong câu chỉ vàng Gracilaria verrucosa được thu mua ở dạng khô
ở các khu vực thuộc vùng ven biển Việt Nam.
+ Xử lý kiềm: rong câu khô được xử lý trong dung dịch NaOH, nồng độ 24 g/l 
0,5 g/l. Tỷ lệ dung dịch/ rong là 20/1, nhiệt độ xử lý ở 80 – 95 oC, thời gian xử lý kể từ
khi dung dịch NaOH sôi là 50 phút. Trong quy trình xử lý cần có chế độ khuấy đảo và
lưu chuyển dịch NaOH trong nồi.

6


+ Rửa trung tính: rửa sạch nước đến khi nước rửa trong và có pH = 7, sau đó để
ráo. Rửa bằng máy rửa khuấy đảo trục.
+ Tẩy màu: tẩy rong bằng dung dịch Giaven 5% tỷ lệ dung dịch/rong = 10/1
+ Xử lý axit: ngâm rong trong dung dịch axit citric có nồng độ 0,3 g/l vào khuấy
đảo đều, thời gian 15 phút. Lượng axit sử dụng phụ thuộc vào màu sắc cung như độ
cứng của cây rong. Sau khi ngâm, rửa kỹ rong đến khi nước trong.
+ Nấu chiết: đun sôi nước và thả rong câu đã xử lý ở trên vào, lượng nước dùng
được tính theo công thức [10]:

N 
Trong đó:

A.D.R
C.100

N: Lượng nước nấu (lit)
A: Hàm lượng Agar trong nguyên liệu (%)
D: Sức đông của Agar (g/cm3)
R: Khối lượng rong khô cho một mẻ nấu (kg)
C: Hệ số phụ thuộc sức đông

Theo kinh nghiệm của các nhà sản xuất tỷ lệ nước cho vào nấu rong là nước/rong
sạch = 5/1.
+ Lọc trong lần 1: Lọc dịch nấu chiết bằng máy ép lọc khung bản để lọc dịch và
loại bỏ bã rong. Nhiệt độ dịch lọc khoảng 80 – 900C. Sau đó, rót dịch lọc được bơm vào
bể lọc 2
+ Lọc lần 2: Bể lọc 2 có bổ sung chất trợ lọc có tác dụng hấp thụ màu. Dịch lọc
trong được rót vào các khay tôn và để nguội tự nhiên.
+ Cắt sợi: cắt sợi thạch bằng máy cắt hoặc ống cắt thủ công theo kích thước 5x5x30
cm, sau đó cho sợi thạch vào các túi vải .
+ Ép tách nước: xếp các túi thạch dưới máy ép thủy lực, ép loại bỏ nước.
+ Sấy khô: Tấm agar sau khi loại bỏ nước có độ ẩm là khoảng 30%, tiếp tục sấy
khô đến 12 – 15%.
7


+ Nghiền bột agar: Máy nghiền có đường kính mắt lưới là 1



3 mm (tùy theo

đơn đặt hàng).
+ Đóng bao: bột agar đựng trong bao polyetylen có hai lớp với kích thước trong
của túi là 270



300 mm, khối lượng tịnh của mỗi túi là 500  15g. Sau đó, được đóng

trong bao bì carton có giấy lót chống ẩm. Trên bao bì phải có đầy đủ các thông tin như:

tên xí nghiệp sản xuất, agar, loại, ngày sản xuất, khối lượng tịnh,....
1.1.3. Thành phần cơ bản của bã thải agar
Thành phần và hàm lượng các chất trong bã thải agar phụ thuộc vào quy trình
công nghệ sản xuất agar, nhưng nhìn chung chứa 15 -20% là chất khô, độ ẩm khoảng
75- 80%. Thành phần chất khô có trong bã rong bao gồm khoảng 40-50% hợp chất hữu
cơ, chủ yếu là cellulose (xơ sợi), chất dinh dưỡng, protein 4 – 5 % và 50-60% hợp chất
vô cơ, trong đó, có khoảng 55% muối vô cơ không tan trong nước và nhiều nguyên tố
vi lượng [11].
Thành phần chính của chất thải là bã rong chứa cellulose, protein và khoáng.
Cellulose là polyme mạch thẳng của hàng ngàn cấu tử glucose đuợc nối với nhau bằng
liên kết -1,4 glucosid, tạo thành dạng sợi. Cấu trúc bậc 2,3 của cellulose rất phức tạp:
dạng lớp được gắn kết bằng các liên kết hydro, lực liên kết hydro được trùng hợp nhiều
lớn nhưng rất bền vững do đó cellulose không tan và khó phân giải. Hệ enzym phân giải
cellulose bao gồm: cellobiohydrolase có tác dụng cắt đứt liên kết hydrô làm biến dạng
cellulose tự nhiên, phân giải vùng kết tinh dạng cấu trúc vô định hình. Endoglucanase
có khả năng cắt đứt các liên kết 1-4 glucozit bên trong phân tử tạo thành những chuỗi
dài. Endoglucanase tiến hành phân giải các chuỗi dài trên thành các disacarit gọi là
cellobiose – gluconase tiến hành thuỷ phân cellobiose thành glucoza [11], [26], [99].
Theo các nhà sinh học, phần lớn lượng protein của rong tồn tại ở dạng hợp chất
với gluxit.Các phân tử glucoprotein rất bền vững dưới tác dụng phân giải của enzym
protease. Do đó để sử dụng protein của rong phục vụ mục đích sản xuất thức ăn chăn
nuôi cần phá huỷ các liên kết của các nhóm ngoại gluxit với phân tử protein trong phức
hợp glucoprotein thì enzym protease trong động vật mới có thể phân giải dễ dàng protein
trong rong biển [11].

8


Chất thải rắn sinh ra từ quá trình sản xuất Agar rất lớn, trung bình khoảng 9 ÷ 10
tấn phế thải/1TSP, thành phần chính của chất thải này là bã rong (xellulose). Nhưng do

nguồn nguyên liệu ở các vùng khác nhau, do điều kiện khí hậu ảnh hưởng đến chất lượng
rong câu chỉ vàng nên cũng ảnh hưởng đến thành phần bã rong.
Trước năm 1990 thì diện tích trồng rong câu rất lớn nhưng những năm gần đây do
tính kinh tế sản xuất trên 1 đơn vị diện tích nước nên nông dân đã chuyển hết sang nuôi
tôm cá, các đầm nuôi lớn ở Phú Yên, Bình Thuận, Bình Định,… đã chuyển sang trồng
các lọại rong kinh tế như rong sụn, rong nho, nên nguyên liệu rong câu chủ yếu là thu
gom từ môi trường tự nhiên, và một số được nông dân nuôi xen kẽ tôm cá để cải tạo
môi trường nên sản lượng không cao.
1.1.4. Các phương pháp xử lý bã thải agar
a, Trên thế giới
Trên thế giới hiện nay người ta đã tiến hành thử nghiệm thành công nhiều phương
pháp tận dụng phế liệu rong biển theo phương pháp thuỷ phân trong môi trường bazơ
hay axit, bao gồm [11]:
- Phương pháp Bioca: ngâm bã rong trong dung dịch Ca(OH)2 0,05 N hay trong
dung dịch axit mạnh như H2SO4 1N, thì tất cả protein của rong sẽ bị thuỷ phân thành
axit amin và peptit dễ tiêu hoá. Sau đó trung hoà sản phẩm bằng axit hay kiềm thì sẽ thu
được chế phẩm có giá trị chăn nuôi cao. Ví dụ sản phẩm chăn nuôi sản xuất theo phương
pháp Iodua, trong dung dịch axit chứa 50 – 60% axit amin, trong đó có 4,7% axit amin
không thay thế (Lyzin) và các peptit dễ tiêu hoá cũng như các chất vô cơ khác kể cả Iot.
Chế phẩm này đã được thử nghiệm sinh học.Có thể thay thế 20 – 30% lượng protein
trong khẩu phần ăn. Nếu trộn vào thức ăn nuôi cá thì cá chóng lớn và tăng sức chịu đựng
của cơ thể [11], [26].
- Phương pháp Jimca: dùng để sản xuất sản phẩm chăn nuôi bằng phương pháp
thuỷ phân bã rong trong môi trường axit. Xử lý sơ bộ bã rong trong dung dịch axit HCl
1,5% trong 2 giờ, ở nhiệt độ 200C. Thuỷ phân nguyên liệu bằng dung dịch axit HCl
trong 2 giờ ở nhiệt độ 200C. Sau đó trung hoà sản phẩm bằng CaO khô đến pH = 5,5 –
5,6, lọc sản phẩm loại bỏ tạp chất rồi cô đặc chế phẩm. Chế phẩm dùng cho chăn nuôi

9