Xây dựng phương pháp bán định lượng acid salvianolic b trong cao đan sâm bằng HPTLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ QUỲNH
Mã sinh viên: 1201499

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP BÁN
ĐỊNH LƯỢNG ACID SALVIANOLIC B
TRONG CAO ĐAN SÂM BẰNG HPTLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ QUỲNH
Mã sinh viên: 1201499

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP BÁN
ĐỊNH LƯỢNG ACID SALVIANOLIC B
TRONG CAO ĐAN SÂM BẰNG HPTLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
TS. Nguyễn Thị Thuận
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới T.S Nguyễn
Thị Thuận - người đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện cho tôi
trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn tới:
Tập thể giảng viên, kỹ thuật viên bộ môn Hóa Dược đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi
điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận.
Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất, Viện Công nghệ Dược phẩm đã hỗ trợ trang thiết
bị, máy móc giúp tôi hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban giám hiệu nhà
trường, các giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dìu dắt tôi
trong suốt 5 năm học qua.
Cuối cùng xin được cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ở bên
tôi quan tâm chăm sóc, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa học.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, Ngày 19 tháng 4 năm 2017
Sinh viên
Lê Thị Quỳnh


MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH .........................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................... 2
1.1. Đan sâm .......................................................................................................... 2

1.1.1. Cây Đan sâm................................................................................................. 2
1.1.2. Dược liệu Đan sâm ....................................................................................... 3
1.1.3. Cao Đan sâm ................................................................................................ 4
1.1.4. Acid Salvianolic B ........................................................................................ 4
1.1.4.1. Công thức cấu tạo ...................................................................................... 4
1.1.4.2. Tính chất..................................................................................................... 5
1.1.4.3. Tác dụng ..................................................................................................... 5
1.1.5. Một số nghiên cứu định tính, định lượng acid Salvianolic B ......................... 6
1.2. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu ........................................................... 7
1.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ............................................................................... 8
1.2.2. Các bước tiến hành định lượng bằng sắc ký lớp mỏng .................................. 9
1.2.3. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) .................................................. 10
1.2.4. Ứng dụng của HPTLC ............................................................................... 11
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 12
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu .......................................................... 12
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 12
2.1.2. Nguyên vật liệu và hóa chất ........................................................................ 12
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu ....................................................................... 12
2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 13
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 13


2.3.1. Khảo sát và xây dựng phương pháp ............................................................ 13
2.3.2. Thẩm định phương pháp ............................................................................. 14
2.3.3. Phân tích các mẫu cao trên thị trường ......................................................... 17
2.4. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 17
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................... 18
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích ...................................................... 18
3.1.1. Khảo sát hệ dung môi pha động .................................................................. 18
3.1.2. Khảo sát bước sóng phát hiện ..................................................................... 20

3.1.3. Quy trình bán định lượng acid Salvianolic B trong cao Đan sâm ................. 22
3.2. Thẩm định phương pháp ............................................................................... 24
3.2.1. Thẩm định phương pháp với detector videoscan. ........................................ 24
3.2.2. Thẩm định phương pháp với detector densitometer ..................................... 29
3.2.3. So sánh với phương pháp HPLC theo Dược điển Trung Quốc .................... 33
3.3. Ứng dụng phương pháp để kiểm tra sơ bộ một số mẫu cao thu được trên thị
trường.................................................................................................................... 34
3.4. Bàn luận ........................................................................................................ 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................. 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
AOAC

Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống

C

Nồng độ dung dịch

EtOAc

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

HL

Hàm lượng

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

MeOH

Methanol

r

Hệ số tương quan

R

Độ thu hồi

Rf

Hệ số lưu giữ

RSD

Độ lệch chuẩn tương tối (Relative Standard Deviation)

S

Diện tích

S/N

Tín hiệu/nhiễu (Signal/Noise)

SAL B

Acid Salvianolic B

TB

Trung bình

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TW

Trung ương

UV

Tử ngoại (Ultraviolet)

VIS

Khả kiến (Visible)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Các phương pháp định tính, định lượng SAL B trong dược liệu ............... 6
Bảng 1.2. Bảng so sánh một vài thông số giữa HPTLC và TLC ............................. 11
Bảng 2.1. Các mẫu cao Đan sâm thu thập được. .................................................... 12
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá đường chuẩn của SAL B - videoscan .......................... 26
Bảng 3.2. Độ lặp lại - videoscan ............................................................................ 28
Bảng 3.3. Độ thu hồi - videoscan ........................................................................... 28
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá đường chuẩn SAL B - densitometer. ........................... 30
Bảng 3.5. Độ lặp lại - densitometer ........................................................................ 32
Bảng 3.6. Độ thu hồi - densitometer ...................................................................... 32
Bảng 3.7. Kết quả hàm lượng SAL B mẫu cao IE bằng phương pháp HPLC ......... 33
Bảng 3.8. Kết quả hàm lượng SAL B mẫu cao IE bằng phương pháp HPTLC ....... 34
Bảng 3.9. Kết quả phân tích một số mẫu cao trên thị trường .................................. 35

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cây và rễ Đan sâm ................................................................................... 2
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của acid Salvianolic B................................................. 5
Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu ............................................................................. 14
Hình 3.1. Kết quả khảo sát dung môi pha động – bản mỏng GF254 ....................... 19
Hình 3.2. Khảo sát hệ pha động 6 trên bản mỏng HPTLC...................................... 20
Hình 3.3. Khảo sát pha động 6’ trên bản HPTLC ............................................... 20
Hình 3.4. Khảo sát bước sóng phát hiện................................................................. 21
Hình 3.5: Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn ở bước sóng 250 – 320 nm ................ 22
Hình 3.6: Độ hấp thụ của vết chuẩn ở bước sóng 320 – 350 nm ........................... 22
Hình 3.7. Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn ở bước sóng 314 nm ......................... 22
Hình 3.8. Kết quả thử độ đặc hiệu ...................................................................... 24
Hình 3.9. Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu bằng detector videosan .......................... 25
Hình 3.10. Vết sắc ký của đường chuẩn ................................................................. 25
Hình 3.11: Kết quả đánh giá khoảng nồng độ hồi quy của SAL B-videoscan ......... 26
Hình 3.12. Vết sắc ký xác định LOD, LOQ ........................................................... 27
Hình 3.13. Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ – detecter videoscan ............................ 27
Hình 3.14. Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu bằng detector densitometer ............. 30
Hình 3.15: Kết quả đánh giá khoảng nồng độ hồi quy của SAL B - densitometer .. 31
Hình 3.16. Sắc ký đồ khảo sát LOD, LOQ – densitometer ................................... 31
Hình 3.17. Hình ảnh sắc ký đồ của mẫu thử và chuẩn bằng phương pháp HPLC ... 33
Hình 3.18. Hình ảnh vết sắc ký của các mẫu cao phân tích trên thị trường ............. 35
Hình 3.19. Cách tính diện tích pic của 2 phương pháp HPLC và HPTLC .............. 37


ĐẶT VẤN ĐỀ
Đan sâm được biết đến với các tác dụng chống đông, giãn mạch, kháng khuẩn và
chống viêm. Ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Việt Nam và một số nước châu
Á khác, vị thuốc này đã được sử dụng phổ biến từ lâu dưới dạng các bài thuốc y học

cổ truyền. Hiện nay ở Việt Nam nhu cầu sử dụng thuốc có thành phần Đan sâm
đang không ngừng gia tăng, kể cả trong điều trị ở một số bệnh viện lớn. Trên thị
trường, trừ các chế phẩm thuốc sắc, ngâm rượu dùng nguyên dược liệu, các chế
phẩm có Đan sâm chủ yếu dùng dạng cao Đan sâm. Trong khi đó, Việt Nam lại
chưa có tiêu chuẩn quy định về kiểm nghiệm cao Đan sâm. Vì vậy, cần có phương
pháp phù hợp để kiểm tra chất lượng nguyên liệu đầu vào này.
Acid Salvianolic B (SAL B) là hợp chất chính trong Đan sâm. Cùng với các
phenol và diterpen khác có trong Đan sâm, SAL B có vai trò quan trọng trong hiệu
quả điều trị của Đan sâm. Vì vậy, Việc xác định hàm lượng SAL B có ý nghĩa quan
trọng trong công tác kiểm tra chất lượng của cao Đan sâm. Do đó, với mục đích xác
định nhanh hàm lượng SAL B trong cao nguyên liệu và tiến tới xa hơn là xác định
hàm lượng SAL B trong chế phẩm có Đan sâm trên thị trường, chúng tôi tiến hành
đề tài “Xây dựng phương pháp bán định lượng acid Salvianolic B trong cao Đan
sâm bằng HPTLC” với 2 mục tiêu chính:
1. Xây dựng phương pháp bán định lượng acid Salvianolic B trong cao Đan
sâm bằng phương pháp HPTLC với 2 detector: videoscan và densitometer.
2. Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để xác định sơ bộ hàm lượng SAL B
trong một số mẫu cao và chế phẩm thu được trên thị trường.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Đan sâm

1.1.1. Cây Đan sâm
Tên khoa học: Salvia miltiorhiza Bunge.
Đan sâm là một loài thuộc Chi Salvia,

Họ hoa môi Lamiaceae, Bộ Lamiales
Tên khác: Xích sâm, Huyết sâm, Huyết căn.
Sở dĩ có tên như vậy là vì rễ cây này giống
sâm mà lại có màu đỏ (Đan là đỏ) [2], [8].
Cây có nguồn gốc từ Trung Quốc, mới được
di thực vào nước ta. Hiện được gây giống ở
Hình 1.1: Cây và rễ Đan sâm

Tam Đảo [8].
 Đặc điểm thực vật

Cây thảo lâu năm, cao khoảng 40 - 80 cm. Rễ có đường kính 0,5 – 1,5 cm, màu
đỏ nâu. Lá kép mọc đối, gồm 3 - 7 lá chét, mặt trên lá chét màu xanh tro, có lông.
Hoa mọc thành chùm ở đầu cành, dài 10 - 15 cm, với 6 vòng hoa; mỗi vòng 3 - 10
hoa, thông thường là 5 hoa, màu đỏ tím. Tràng hoa 2 môi, môi trên cong hình lưỡi
liềm, môi dưới xẻ ba thuỳ; 2 nhị ở môi dưới; bầu có vòi dài. Quả nhỏ, dài 3 mm,
rộng 1,5 m [2], [8].
 Thành phần hóa học [2], [8], [10], [25]
Các thành phần hóa học của Đan sâm đã được nghiên cứu từ đầu những năm 30
của thế kỉ trước. Hiện tại có hơn 100 chất hóa học được tách chiết và xác định từ
Đan sâm. Dựa trên tính tan của các chất hóa học thì có thể chia các nhóm thành
phần trong Đan sâm ra làm ba loại: các thành phần tan trong nước, các thành phần
tan trong dầu và các hành phần khác.
Thành phần tan trong dầu: Chủ yếu là các diterpenoid gồm nhiều cấu trúc khác
nhau, chia làm 4 nhóm: abietan diterpenoid, clerodan diterpenoid, pimaran
diterpenoid, lapdan diterpenoid. Trong rễ Đan sâm chủ yếu là nhóm abietan

2

diterpenoid với thành phần chính là các tanshinon I, II và III. Ngoài ra còn có
isotanshinon I, II…
Thành phần tan trong nước: Chủ yếu là các acid phenolic và dẫn chất. Đã có
hơn 30 hợp chất phenolic được tách ra từ Đan sâm. Các hợp chất phenolic chính là:
danshensu, acid rosmarinic và acid Salvianolic từ A-K (chủ yếu là Salvianolic B),
acid caffeic…
Thành phần khác: Là các hợp chất khó phân loại: β-sitosterol, baicalin, acid
ursolic, daucosterol, vitamin E, tanin và các hợp chất polysaccharid.
1.1.2. Dược liệu Đan sâm
Dược liệu Đan sâm (Radix Salviae miltiorrhizae) là rễ phơi khô hay sấy khô của
cây Đan sâm (Salvia multiorrhiza Bunge).
 Đặc điểm dược liệu.
Rễ ngắn, thô, đôi khi ở đầu rễ còn sót lại gốc của thân cây. Rễ hình trụ dài, hơi
cong queo, có khi phân nhánh và có rễ con dạng tua nhỏ; dài 10 – 20 cm, đường
kính 0,3 – 1 cm. Mặt ngoài màu đỏ nâu hoặc đỏ nâu tối, thô, có vân nhăn dọc. Vỏ rễ
già bong ra, thường có màu nâu tía. Thể chất cứng và giòn, mặt bẻ gãy không chắc
có vết nứt, hoặc hơi phẳng và đặc, phần vỏ màu đỏ nâu và phần gỗ màu vàng xám
hoặc màu nâu tía với bó mạch màu trắng vàng, xếp theo hướng xuyên tâm. Mùi nhẹ,
vị hơi đắng và se. Dược liệu từ cây trồng tương đối mập chắc, đường kính 0,5 – 1,5
cm. Mặt ngoài màu nâu đỏ, có nếp nhăn dọc, phần vỏ bám chặt vào gỗ không dễ
bóc ra. Chất chắc, mặt bẻ gãy tương đối phẳng, hơi có dạng chất sừng [3].
Chế biến: Ðào rễ vào mùa đông, rửa sạch, cắt bỏ rễ con, phơi hay sấy khô. Tẩm
nước, ủ mềm một đêm, thái lát mỏng, phơi khô, dùng sống, sao qua, hoặc tẩm rượu
1 giờ rồi mới sao. Bảo quản nơi kín, khô mát [3], [8].
 Tác dụng
Theo y học cổ truyền [2], [8]:
Đan sâm được dùng chữa bệnh tim, tâm hư phiền nhiệt, hồi hộp khó chịu, kinh
nguyệt không đều, bế kinh, bụng dưới kết hòn cục, phong thấp khớp sưng đau, thần
kinh suy nhược, nhức đầu mất ngủ, chấn thương sai khớp, mụn độc, ghẻ lở. Ngoài

3


ra Đan sâm còn được dùng để chữa vàng da, chảy máu tử cung, kinh nguyệt ít, an
thai, trục thai, mẩn ngứa.
Liều dùng: 8 – 15 g/ngày, dạng thuốc sắc.
Theo y học hiện đại:
Đan sâm có tác dụng tăng tuần hoàn vi mạch, giãn mạch vành, tăng cường nuôi
máu cơ tim từ đó giảm nguy cơ nhồi máu cơ tim. Ngoài ra, Đan sâm còn có khả
năng ức chế tổng hợp cholesterol ở tế bào giúp hạ lipid máu, an thần, hỗ trợ điều trị
chứng mất ngủ và hạ đường huyết.
1.1.3. Cao Đan sâm [16], [25]
Trên thị trường có nhiều loại cao Đan sâm khác nhau. Dựa vào dung môi chiết
mà ta có thể chia cao Đan sâm thành 3 loại chính là: cao chiết trong nước, cao chiết
trong cồn, cao chiết cồn-nước. SAL B tan tốt trong nước và các dung môi hữu cơ
phân cực (EtOH, MeOH…). Vì vậy trong các loại cao Đan sâm này đều chứa SAL
B. Tuy nhiên với mỗi loại cao được chiết với dung môi khác nhau, quy trình khác
nhau thì hàm lượng SAL B là khác nhau.
Ngoài ra dựa vào thể chất của cao ta cũng có thể chia làm 2 loại:
Cao khô: Dạng bột khô hoặc dạng phun sấy. Dạng này cao thu được có hàm
lượng nước rất nhỏ, hạn chế sự thủy phân hoặc biến đổi của SAL B trong quá trình
bảo quản.
Cao đặc: Dạng cao trong cồn hoặc cao trong nước. Trong quá trình chiết cũng
như bảo quản SAL B có thể bị thủy phân hoặc biến đổi.
Như vậy, thành phần có hoạt tính trong cao Đan sâm là SAL B có hàm lượng
khác nhau ở mỗi loại cao. Hàm lượng này có thể thay đổi trong quá trình vận
chuyển và bảo quản nên cần định kỳ kiểm tra chất lượng cao Đan sâm.
1.1.4. Acid Salvianolic B
1.1.4.1.

Công thức cấu tạo [20]

Công thức phân tử: C36H30O16
Trọng lượng phân tử: 718,62 g/mol

4


Tên khoa học (danh pháp UIPAC): (2R)-2-[(E)-3-[(2R,3R)-3-[1-carboxy-2-(3,4dihydroxyphenyl)ethoxy]carbonyl-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxy-2,3-dihydro1- benzofuran-4-yl]prop-2-enoyl]oxy-3-(3,4-dihydroxyphenyl) propanoic acid.

.
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của acid Salvianolic B
1.1.4.2.

Tính chất

Tính chất vật lý: Bột không màu, dạng vô định hình. Dễ dàng hòa tan trong nước,
ethanol, methanol, aceton và hòa tan được trong ethyl acetat. Cấu trúc có nhân
thơm, hấp thụ UV-VIS. Phân tử có carbon bất đối nên có đồng phân quang học.
Góc quay cực của SAL B trong ethanol là +92° [25].
Tính chất hóa học: SAL B có nhóm carboxylic và nhiều nhóm OH phenol nên có
tính acid (pKa = 2,77), và có đầy đủ tính chất hóa học của phenol [17]. Mặt khác,
trong phân tử có các liên kết ester nên SAL B không bền dưới tác động của nhiệt độ
và độ ẩm - hai tác nhân chính thủy phân liên kết. Do vậy, cần bảo quản SAL B ở
nhiệt độ thường, tránh ẩm [18].
1.1.4.3.

Tác dụng

Qua các kết quả thực nghiệm cho thấy, acid Salvianolic B có hiệu quả trên một

số bệnh về thần kinh và tim mạch:
- Thúc đẩy, bảo vệ và phục hồi các chức năng thần kinh thông qua việc bảo vệ
bao myelin quanh sợi trục thần kinh tủy sống [28].

5


- Cải thiện tình trạng thiếu máu cục bộ, tưới máu lại trong chấn thương thông
qua ức chế TLR4 (Toll - like receptor 4 - thụ thể liên quan đến khả năng tự
miễn dịch và một số phản ứng viêm) [27].
- Bảo vệ tim mạch khi bị nhồi máu cơ tim cấp tính nhờ thúc đẩy autophagy (quá
trình tự thực bào), neovascularization (quá trình hình thành vi mạch) và ức chế
apoptosis (quá trình tự chết theo chương trình của tế bào) [15].
- Giảm mỡ máu và ức chế hoạt động của HMGB1 (emzym đóng vai trò quan
trọng trong bệnh sinh của bệnh gan nhiễm mỡ không do dùng đồ uống có cồn)
giúp cải thiện tình trạng gan nhiễm mỡ [24].
1.1.5. Một số nghiên cứu định tính, định lượng acid Salvianolic B
Qua một số tài liệu cho thấy đã có nhiều nghiên cứu định tính, định lượng SAL
B, tuy nhiên hầu hết chỉ trên đối tượng dược liệu. Bảng 1.1 tổng hợp một số phương
pháp mà chúng tôi thu thập được.
Bảng 1.1 Các phương pháp định tính, định lượng SAL B trong dược liệu
STT TLTK

Phương pháp
Điều kiện phân tích
Ứng dụng

TLC
Định tính

1

2

Dược
điển
Trung
Quốc
[21]

[10]

HPLC
Định lượng

TLC và
HPTLC
Định tính

Bản mỏng: Silica gel GF254
Pha động: Toluen: Cloroform: EtOAc: MeOH:
acid formic (2: 3: 4: 0,5: 2)
Thể tích chấm: 5 µl
Phát hiện vết: UV 254 nm
Pha tĩnh: Cột C18
Pha động: MeOH: acetonitril: acid formic: nước
(30:10:1:59)
Dung dịch chuẩn: Acid Salvianolic B hòa tan
trong MeOH 75%. Nồng độ 0,14 mg/ml
Thể tích tiêm: 10 µl

Tốc độ dòng: 1 ml/phút
Phát hiện vết: UV 286 nm
Pha động: Toluen, EtOAc, acid formic (5:4:1)
hoặc toluen: EtOAc, aceton, acid formic
(5:2:2:1)
Phát hiện vết: UV 366 nm
6


HPTLC
Định tính
3

[22]
HPLC
Định lượng

HPTLC
Định tính
Dược
điển
Mỹ
[23]

4

HPLC
Định lượng

Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel 60 GF254 (10x10)

Pha động: Cloroform: EtOAc: toluen: acid
formic: MeOH (15:20:10:10:1)
Phát hiện vết: UV 254 hoặc dd FeCl3/EtOH 2%,
sấy bản mỏng ở 110°C.
Pha tĩnh: Cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm)
Pha động: Nước: acetonitril: acid formic (90: 10:
0,4)
Phát hiện: UV 280 nm
Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel 60 GF254
Pha động: Toluen: dicloromethan: EtOAc:
MeOH: acid formic (4:6:8:1:4)
Phát hiện vết: Phun dung dịch acid
sulfuric/MeOH 10%. Sấy khô ở 100°C, soi dưới
ánh sáng khả kiến.
Pha tĩnh: Cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm).
Pha động: DD acid phosphoric 1% trong nước:
acetonitril (78:22)
Phát hiện: UV 286 nm
Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
Thể tích tiêm: 10 µl

Như vậy, TLC và HPTLC được sử dụng để định tính SAL B, song song với việc
chạy HPLC để định lượng. Việc này tốn nhiều thời gian và khi không yêu cầu độ
chính xác quá cao thì chạy HPLC là không cần thiết. Mặt khác, việc xây dựng
phương pháp định tính, định lượng acid SAL B chỉ tiến hành trên đối tượng là dược
liệu Đan sâm mà chưa xây dựng phương pháp trên đối tượng là cao nguyên liệu. Vì
vậy để giảm thời gian cũng như là chi phí cho việc đánh giá sơ bộ hàm lượng SAL
B trong cao nguyên liệu chúng tôi đã tiến hành đề tài này.
1.2.

Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

Bản chất của sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là sắc ký lớp mỏng
(TLC). Vì vậy HPTLC hoạt động dựa trên nguyên tắc của TLC.

7


1.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) [1]
Nguyên tắc: Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành trên một
bản mỏng bao gồm các hạt có kích thước đồng nhất, được kết dính trên một giá đỡ
bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Lớp mỏng kết dính đó gọi là pha tĩnh. Các hạt
trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách các chất theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi
ion… Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi
thích hợp và được hút lên bản sắc ký nhờ lực mao dẫn tách dung dịch thí nghiệm
dựa trên độ phân cực của các thành phần trong dung dịch.
Quá trình tách hỗn hợp các chất bằng TLC xảy ra khi cho pha động chuyển động
qua pha tĩnh. Dưới tác dụng của lực mao quản, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua
điểm xuất phát - nơi hỗn hợp các chất cần phần tích đã được đưa lên bản mỏng.
Trong quá trình di chuyển của pha động qua lớp mỏng chất hấp thụ (pha tĩnh) nhờ
các quá trình hấp phụ và giải hấp phụ được lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố khác
nhau mà những chất khác nhau di chuyển theo hướng chuyển động của pha động
với các tốc độ khác nhau. Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp phân tích có thể sẽ
được tách riêng ra ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu
giữ Rf. Trị số của nó được tính bằng tỉ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân
tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động: Rf =
Trong đó: dR: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích
dM: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động
Rf có giá trị dao động từ 0 - 1. Trị số Rf nằm trong khoảng 0,2 – 0,8 thích hợp để

định tính và định lượng.
Pha tĩnh: Là các hạt có kích thước 10 - 30 µm, được dải đều và kết dính thành
lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vuông. Bản mỏng trên thị
trường có kích thước khác nhau thường 5 - 20 cm, nhiều khi có đưa các chất phát
huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân tích. Chất hấp phụ
thường dùng nhất là silica gel.

8


Pha động: Là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo
tỷ lệ khác nhau, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Tiêu chuẩn quan trọng nhất để chọn hệ
dung môi pha động là độ phân cực và pH của nó.
1.2.2. Các bước tiến hành định lượng bằng sắc ký lớp mỏng
 Chuẩn bị bản mỏng: Hoạt hóa bản mỏng ở 100 - 120°C trong khoảng 2 giờ để
làm tăng khả năng hấp phụ của silica gel.
 Đưa chất phân tích lên bản mỏng và khai triển sắc ký: Lượng mẫu đưa lên bản
mỏng khoảng 0,1 - 50 µg. Thể tích dung dịch chấm khoảng 1 - 5 µl đối với sắc
ký phân tích và 0,1 – 0,2 µl đối với sắc ký điều chế. Sau khi chấm sắc ký bản
mỏng đã sấy khô được cho vào bình bão hòa pha động. Mép dưới bản mỏng
được nhúng vào pha động, vết chấm cách bề mặt pha động khoảng 1 cm.
 Phát hiện vết sắc ký đồ: dựa vào tính chất lý hóa khác nhau của chất cần phân
tích để lựa chọn cách phát hiện vết thích hợp
- Sử dụng thuốc thử hiện màu: Sau khi khai triển, muốn quan sát đầy đủ nhất
tất cả các vết, thường phải phun thuốc thử lên bề mặt bản mỏng hoặc nhúng cả bản
mỏng vào thuốc thử. Đôi khi làm nóng bản mỏng để tăng tốc độ phản ứng tạo màu
và cường độ vết màu.
- Soi dưới ánh sáng đèn UV: Nhiều vết hữu cơ trên sắc ký đồ trở nên tối hoặc
phát quang sáng khi soi dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm hoặc 366 nm. Một số
bản mỏng tráng sẵn có chất phát quang không tan đưa vào pha tĩnh nên phát huỳnh

quang.
 Định lượng các chất trong vết sắc ký: có hai phương pháp định lượng các chất
trong vết sắc ký:
Phương pháp 1: Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích
hợp, làm sạch dịch chiết rồi định lượng chất phân tích bằng phương pháp thích hợp.
Phương pháp 2: Định lượng trực tiếp trên bản mỏng bằng cách đo cường độ hấp
thụ hoặc bức xạ của vết sắc ký, sử dụng 2 kỹ thuật:
-

Videoscan: Quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh, xử lý dữ liệu
hình ảnh bằng phần mềm máy tính ta thu được sắc ký đồ của chất phân tích.

9


Tính toán kết quả qua diện tích, chiều cao pic bằng cách so sánh điểm hoặc
dựa vào đường chuẩn.
-

Densitometer: Chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ hấp thụ hoặc
huỳnh quang. Xử lý dữ liệu bằng phần mềm máy tính ta thu được sắc ký đồ
của chất phân tích. Tính toán kết quả qua diện tích, chiều cao pic bằng cách
so sánh điểm hoặc dựa vào đường chuẩn.

1.2.3. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) [5], [7], [11]
HPTLC bản chất là TLC, trong đó các bước tiến hành đều được tự động hóa một
phần hoặc toàn bộ, và sử dụng bản mỏng hiệu năng cao.
Để tự động hóa thì phương pháp HPTLC cần sử dụng thiết bị chuyên dụng, cấu
tạo bao gồm các bộ phận:
- Thiết bị chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, AST 4)

- Thiết bị khai triển tự động (ADC 2)
- Bộ phận phát hiện, thu nhận và xử lý kết quả: Thông thường hay sử dụng là
detector UV để phát hiện vết, được kết nối với một máy tính để thu nhận và xử
lý kết quả. Có 2 loại detector UV hay gặp (tương ứng với 2 kỹ thuật định
lượng ở trên):
Detector videoscan:
 Thiết bị soi và chụp ảnh bản mỏng (TLC Visualizer)
 Máy quét vết (TLC Scanner 3.4)
Detector densitometer:
 Máy quét vết (TLC Scanner 4) .
Bản mỏng hiệu năng cao không khác nhiều so với bản mỏng sắc ký lớp mỏng
thông thường, chỉ khác là được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn (dày khoảng 100 µm;
so với TLC là 250 µm) với bột mịn có kích thước hạt 5 µm độ đồng đều cao hơn. Vì
vậy, HPTLC có một số ưu điểm hơn so với TLC [19]:
- Khả năng phân tách tốt hơn: Ưu điểm này chủ yếu nhờ bản mỏng hiệu năng
cao có kích thước hạt nhỏ và đồng đều hơn.

10


- Lượng chất đưa lên bản mỏng ít hơn: Với thiết bị tiêm mẫu chính xác và bản
mỏng có khả năng hấp phụ tốt hơn nên lượng chất cần cho phân tích là nhỏ
hơn.
- Độ lặp lại tốt hơn do gắn với hệ thống máy chấm sắc ký tự động, buồng triển
khai sắc ký, máy quét, chụp ảnh và phần mềm xử lý hình ảnh, số liệu. Các yếu
tố về môi trường, nguyên nhân ảnh hưởng lớn tới kết quả phân tích, được
kiểm soát và hạn chế tối đa các thay đổi.
Bảng 1.2. Bảng so sánh một vài thông số giữa HPTLC và TLC
Tham số

HPTLC

TLC

Công nghệ

Bán tự động

Thủ công

Kích thước hạt

5 - 6µm

10 - 12 µm

Độ dày lớp pha tĩnh

100 µm

250 µm

Chiều cao đĩa lý thuyết

12 µm

30 µm

Hiệu lực tách

cao

Thấp hơn

0,1 - 0,5 ng

1 - 5 ng

5 - 10 pg

50 - 100 ng

Giới hạn phát hiện (sử
dụng máy đo hấp thụ UVVIS
Giới hạn phát hiện (sử
dụng máy quét huỳnh
quang)
1.2.4. Ứng dụng của HPTLC [1] [11]
Tương tự như TLC, HPTLC thường được dùng để: thử tinh khiết, định tính, định
lượng. Do quá trình được tự động hóa nên HPTLC có độ nhạy, độ lặp lại, độ chọn
lọc cao, vì vậy có thể định tính, định lượng tốt hơn TLC. Mặt khác, nhờ khả năng
khống chế một số yếu tố môi trường như: nhiệt độ, độ ẩm,…kết quả phân tích bằng
HPTTLC chính xác và tin cậy cao hơn TLC. Chính vì vậy, hiện nay, Dược điển
Trung Quốc đã đưa HPTLC vào để định tính các chất thay cho TLC. Đi kèm với
Dược điển còn có một bộ atlas HPTLC của các dược liệu.

11


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.

Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Acid Salvianolic B trong cao Đan sâm.
2.1.2. Nguyên vật liệu và hóa chất
 Chất chuẩn acid Salvianolic B (Trung Quốc): B20261 – 20 mg (hàm lượng >
98%). LOT: Y04A6H2126.
 Ethyl acetat, toluen, acid formic, aceton, methanol, diclomethan, cloroform
(Hãng sản xuất: Merck-Đức) đạt tinh khiết phân tích.
 Các mẫu cao Đan sâm thu thập được:
Bảng 2.1. Các mẫu cao Đan sâm thu thập được.
STT

Kí
hiệu

Mẫu cao Đan sâm

Cơ sở sản xuất

Số lô

1

IE

Cao đặc Đan sâm chiết
bằng cồn

CT TNHH IMC

300615

2

IH

Cao đặc Đan sâm chiết
bằng nước

CT TNHH IMC

011214

3

T

Cao khô Đan sâm dạng
phun sấy

CT CP Traphaco

DS050416001

4

N

Cao khô Đan sâm (Novaco)

CT CPDP
Novaco

160827DS

5

F

Viên nang cứng có chứa
cao đan sâm.

CT TNHH Fito
Pharma

1616002

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
 Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC Camag: Bộ phận chấm mẫu
bán tự động Linomat 5, bộ phận triển khai sắc ký ADC2, bộ phận phát hiện và
xử lí kết quả (videoscan: buồng chụp ảnh sắc ký TLC VISUALIZED, phần
mềm xử lý kết quả VideoScan; densitometer: máy quét vết TLC Scanner 4).

12


 Bản mỏng nhôm TLC silica gel GF254, bản mỏng kính HPTLC silica gel 60

F254 (MERCK)
 Cân phân tích AUW 220
 Cân phân tích XPE 105
 Máy ly tâm Kubota 6500
 Máy lắc Vortex Benchmixer BV 1010
 Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 5, 10 và 25 ml, cốc có mỏ, pipet các
loại, autopipet 10 - 100, 100 - 1000 µl
 Ống ly tâm ( thông tin về thể tích), phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0,45 µl.
2.2.


Nội dung nghiên cứu
Xây dựng phương pháp bán định lượng acid Salvianolic B trong cao Đan sâm
bằng phương pháp HPTLC với 2 detector videoscan và densitometer.



Thẩm định phương pháp vừa xây dựng với các tiêu chí: Độ đặc hiệu, đường
chuẩn - khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại,
độ đúng.
 Thẩm định phương pháp với detector videoscan.
 Thẩm định phương pháp với detector densitometer.
 So sánh phương pháp vừa xây dựng với phương pháp HPLC của Dược điển
Trung Quốc [21].



Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để xác định sơ bộ hàm lượng SAL B
trong một số mẫu cao và chế phẩm thu được trên thị trường.

2.3.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Khảo sát và xây dựng phương pháp
Trên cơ sở các điều kiện vật chất có sẵn và ứng dụng các nghiên cứu trước,
chúng tôi cố định một số yếu tố sau:
- Phương pháp xử lý mẫu: (Hình 2.1).
- Pha tĩnh: bản mỏng HPTLC silica gel 60 GF254.
- Thế tích tiêm mẫu: 2 µl

13


Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu
Các yếu tố khảo sát gồm có:
 Pha động: Sau khi tham khảo một số tài liệu (Bảng 1.1) chúng tôi tiến hành
khảo sát một số pha động nhằm lựa chọn hệ dung môi thích hợp nhất với
phương pháp phân tích HPTLC. Các khảo sát sơ bộ ban đầu được thực hiện trên
bản TLC silica gel GF254, sau đó khẳng định lại kết quả khảo sát trên bản
mỏng HPTLC.
- Bước sóng phát hiện: Thực tế hiện nay, máy phân tích HPTLC ngày càng phổ
biến ở Việt Nam với cả 2 loại detector là videoscan và densitometer. Vì vậy
trong điều kiện có thể sử dụng cả 2 loại detector là videoscan và densitometer
chúng tôi đã tiến hành khảo sát cả 2 loại detector này, tạo điều kiện phát huy tối
đa khả năng ứng dụng của HPTLC.
2.3.2. Thẩm định phương pháp
14

2.3.2.1.

Thẩm định phương pháp với detector videoscan và densitometer

Chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp trên cùng các bản mỏng đã khai
triển, lần lượt với detector videoscan và densitometer, theo các tiêu chí:
- Độ đặc hiệu, chọn lọc
 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
 Giới hạn phát hiện
 Giới hạn định lượng
 Độ lặp lại
 Độ đúng
Hiện nay chưa có tài liệu chính thức nào đưa ra các yêu cầu về các giới hạn thông
số để đánh giá kỹ thuật bán định lượng, nên khóa luận chỉ xác định các thông số
trên và đưa ra cùng với các giới hạn chấp nhận khi thẩm định kết quả định lượng
theo AOAC và một số tài liệu khác [14].
 Độ đặc hiệu - chọn lọc
Xử lý mẫu trắng (dung môi pha mẫu), mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn
theo quy trình đã xây dựng, tiến hành khai triển sắc ký đồng thời các mẫu trên theo
điều kiện đã chọn.
Phương pháp được coi là có chọn lọc khi:
- Trong sắc ký đồ mẫu trắng không có vết có Rf tương ứng với Rf của SAL B
chuẩn.
- Trong sắc ký đồ mẫu thử có vết tương ứng với vết SAL B chuẩn, vết tách hoàn
toàn.
 Đường chuẩn và khoảng hồi quy [14]
Pha dãy dung dịch chuẩn với các nồng độ: 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,8
mg/ml. Tiến hành sắc ký theo điều kiện phân tích đã xây dựng. Xây dựng phương
trình hồi quy biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chuẩn, xác
định hệ số tương quan r. Nếu 0,995 ≤ r ≤ 1,000 (hoặc 0,99 < r2 < 1,00) thì đường

chuẩn đạt yêu cầu.
 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
15


Từ dung dịch chuẩn gốc SAL B 0,8 mg/ml tiến hành pha loãng bằng MeOH
được các dung dịch chuẩn có nồng độ là: 0,05; 0,04; 0,03; 0,02 mg/ml. Tiến hành
sắc ký với điều kiện đã xây dựng.
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất có S/N khoảng 3 lần (tín hiệu đáp
ứng của pic gấp khoảng 3 lần đường nhiễu nền), giới hạn định lượng (LOQ) là nồng
độ thấp nhất có S/N khoảng 10 [14].
 Độ lặp lại phương pháp
Phân tích 6 mẫu thử T1 - T6 từ cùng chế phẩm cao Đan sâm IH. Tính độ lệch
chuẩn tương đối RSD của kết quả giữa các lần phân tích.
Giới hạn độ lặp lại đối với 1 phương pháp định lượng theo AOAC là RSD ≤ 2,7 %
nếu hàm lượng trong khoảng 1 – 10 % và RSD ≤ 3,7 % nếu hàm lượng trong
khoảng 0,1 – 1 % [14].
 Độ đúng
Được đánh giá qua độ thu hồi, sử dụng phương pháp thêm chuẩn. Phân tích 3
mẫu thử từ cao Đan sâm IH đã biết hàm lượng SAL B, rồi thêm cùng một lượng
chuẩn. Độ thu hồi được tính theo công thức:

R=(

̅

× 100

Trong đó:
-

R: độ thu hồi (%)
̅ : Giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm
µ: Giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng

Theo AOAC, giới hạn chấp nhận của độ thu hồi là 97 – 103 % nếu hàm lượng
trong khoảng 1 – 10 %, là 95 – 105 % nếu hàm lượng trong khoảng 0,1 - 1 % [14].
2.3.2.2.

So sánh với phương pháp HPLC theo Dược điển Trung Quốc

Mặc dù trong Dược điển Trung Quốc chưa có phương pháp định lượng SAL B
trong cao, nhưng đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng SAL B trong dược
liệu. Trên cơ sở nhận định rằng, sự khác nhau giữa kết quả định lượng dược liệu và
cao là do quy trình xử lí mẫu. Vì vậy, để khẳng định độ tin cậy của phương pháp

16


vừa xây dựng, chúng tôi đã áp dụng quy trình phân tích của Dược điển Trung Quốc
dùng cho dược liệu vào cao với cùng một cách xử lí mẫu.
Tiến hành định lượng acid Salvianolic B trong mẫu cao IE bằng phương pháp
HPTLC mới xây dựng với 2 detector videoscan, densitometer và HPLC theo Dược
điển Trung Quốc. So sánh hàm lượng SAL B định lượng được giữa các phương
pháp.
Điều kiện phân tích của phương pháp HPLC theo Dược điển Trung Quốc:
 Pha tĩnh: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm).
 Pha động: Acetonitril: MeOH: acid formic: nước (10:30:1:59)
 Dung môi chiết: MeOH
 Phát hiện: UV 286nm.

2.3.3. Phân tích các mẫu cao trên thị trường
Áp dụng quy trình đã xây dựng, tiến hành phân tích và xác định hàm lượng acid
Salvianolic B trong các mẫu cao Đan sâm thu thập được (bảng 2.1).
2.4.

Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu đều được xử lý bằng
các phần mềm có sẵn trong thiết bị HPTLC. Ảnh chụp sắc ký đồ được chuyển sang
xử lý bằng phần mềm VideoScan. Phần mềm này sẽ dựa trên hình ảnh sắc ký đồ
vừa được chụp để ghi lại thành các pic và tính toán diện tích pic (hoặc chiều cao)
tương ứng.
Dựa trên các kết quả thu được từ detector, tính toán các thông số thống kê nhờ
phần mềm tin học Microsoft Office Excel 2010.

17