Nghiên cứu phân lập và chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
_______________________

Cao Lệ Quyên

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN LIÊN
QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀO GIỐNG
LÚA Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
_______________________

Cao Lệ Quyên

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN LIÊN
QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀO GIỐNG
LÚA Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Phạm Xuân Hội

2. PGS.TS. Đinh Đoàn Long

Hà Nội – 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá
nhân, đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của PGS.TS. Phạm Xuân
Hội và PGS.TS. Đinh Đoàn Long.
Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc tác giả
nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.

Hà Nội, ngày 20 tháng 09 năm 2017
Nghiên cứu sinh

Cao Lệ Quyên


LỜI CẢM ƠN
NCS xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Phạm Xuân Hội (Viện
Di truyền Nông nghiệp), PGS. TS. Đinh Đoàn Long (Khoa Y Dược, Trường
Đại học Quốc Gia Hà Nội) và TS. Michel Nicole (Trung tâm Nghiên cứu Vì
Sự Phát triển, Montpellier, Pháp) là những người thầy đã tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho NCS trong suốt thời gian học tập,
thực hiện và hoàn thành bản luận án này.
NCS xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học
Tự nhiên, Phòng Sau Đại học , Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học (Trường ĐH
KHTN) và Ban lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo điều kiện thuận
lợi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn hiện luận án.

NCS xin chân thành cảm ơn các thầy,các cô Bộ môn Di truyền (Khoa
Sinh học, Trường ĐH KHTN) đã giảng dạy NCS trong quá trình học tập và
tập thể cán bộ nghiên cứu Bộ môn Bệnh học Phân tử (Viện DTNN) và các bạn
bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để NCS hoàn thiện bản luận án
này.
Tôi xin được cảm ơn gia đình và người thân đã luôn ở bên cạnh tôi,
quan tâm, cảm thông và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện
luận án.
Hà Nội ngày 20 tháng 09 năm 2017

NCS Cao Lệ Quyên


MỤC LỤC
MỤC LỤC ........................................................................................................ 1
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... 5
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... 9
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... 12
MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 14
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 20
1.1. HÁN HẠN-YẾU TỐ KÌM HÃM TRONG SẢN XUẤT NÔNG
NGHIỆP

................................................................................................... 20

1.1.1. Khái niện về hạn hán ............................................................... 20
1.1.2. Tác động tiêu cực của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp ........... 21
1.2. PHẢN ỨNG CỦA THỰC VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN............. 24
1.2.1. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với thực vật ................................... 24
1.2.2. Đáp ứng chống, chịu hạn của thực vật ...................................... 26

1.2.3. Cơ sở phân tử của đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật ................ 29
1.3. CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở
THỰC VẬT ................................................................................................. 34
1.3.1. Nhóm nhân tố phiên mã NAC .................................................. 36
1.3.2. Nhóm nhân tố phiên mã MYB/MYC ........................................ 37
1.3.3. Nhóm nhân tố phiên mã bZIP .................................................. 38
1.3.4. Nhóm nhân tố phiên mã AP2/ERF ........................................... 40

1


1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG LÚA CHUYỂN GEN
CHỊU HẠN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM ..................................... 41
1.4.1. Nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn trên thế giới ....... 44
1.4.2. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen ở Việt Nam ....... 50
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 53
2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ................................... 53
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................. 53
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu ................................................................. 54
2.1.3. Thiết bị .................................................................................. 57
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 57
2.2.1. Xƣ̉ lý cây lúa trong điều kiện hạn ............................................. 57
2.2.2. Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA ........................................... 58
2.2.3. Sinh tổng hợp DNA bổ sung hoàn chỉ nh (full-length cDNA) ...... 60
2.2.4. Nhân bản đoạn DNA đặc hiệu bằng kĩ thuật PCR ...................... 62
2.2.5. Thiết kế vector chuyển gen ...................................................... 65
2.2.6. Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens ................ 67
2.2.7. Đánh giá khả năng hình thành callus và tái sinh ở lúa ................ 68
2.2.8. Chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium ............. 69
2.2.9. Đánh giá số lƣợng bản sao của gen chuyển ............................... 71

2.2.10. Đánh giá sinh trƣởng, phát triển, khả năng chịu hạn của lúa
chuyển gen ...................................................................................... 74

2


2.2.11. Đánh giá biểu hiện gen OsDREB1A bằng phƣơng pháp PCR định
lƣợng .............................................................................................. 75
2.2.12. Đánh giá biểu hiện gen bằng phƣơng pháp PCR bán định lƣợng76
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 77
3.1.

PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN

OsDREB1A/OsDREB2A .............................................................................. 77
3.1.1. Phân lập trình tự mã hóa OsDREB1A/OsDREB2A ..................... 77
3.1.2. Thiết kế vector chuyển gen OsDREB1A/OsDREB2A ................. 92
3.1.3. Biến nạp vector biểu hiện vào A. tumefaciens chủng LBA4404 .. 94
3.2. NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO GIỐNG LÚA Ở
VIỆT NAM .................................................................................................. 95
3.2.1. Khả hình thành callus của tập đoàn giống lúa Việt Nam ............. 95
3.2.2. Khả năng tái sinh của tập đoàn giống lúa Việt Nam ................... 99
3.2.3. Khảo sát khả năng tiếp nhận gen của giống lúa Việt Nam ........ 103
3.3. TẠO GIỐNG LÚA CHÀNH TRỤI CHUYỂN GEN ........................ 108
3.3.1. Biến nạp trình tự mã hóa OsDREB1A/OsDREB2A vào lúa Chành
trụi ................................................................................................ 108
3.3.2. Sàng lọc các dòng Chành Trụi chuyển gen .............................. 108
3.4. ĐÁNH GIÁ KIỂU HÌ NH CÂY CHUYỂN GEN .............................. 118
3.4.1. Đánh giá sinh trƣởng và phát triển của các dòng lúa chuyển gen
T2 ................................................................................................. 118

3.4.2. Đánh giá khả năng giữ nƣớc và phục hồi của các dòng lúa chuyển
gen T2 ........................................................................................... 120

3


3.4.3. Đánh giá khả năng chịu hạn và tạo hạt của các dòng chuyển
gen T3 ........................................................................................... 124
3.4.4. Đánh giá biểu hiện OsDREB1A và gen liên quan chịu hạn khác
trong cây chuyển gen thế hệ T3........................................................ 127
KẾT LUẬN .................................................................................................. 130
KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 132
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN ........................................................................................... 133
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 134
PHỤ LỤC ..................................................................................................... 151

4


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

3-AT

3-Amino-1, 2, 4-triazole

A. thaliana

Arabidopsis thaliana

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

ABA

Abscisic acid

ABRE

Yếu tố đáp ứng acid abscisic chứa trình tự ACGT
(ACGT-containing abscisic acid response element)

AD

Vùng tác động (acting domain)

ADB

Ngân hàng phát triển châu Á (Asian Development
Bank)

AMP

Adenosine monophosphate

ADP

Adenosine diphosphate

ATP

Adenosine triphosphate

BAP

6-Benzylaminopurine

BD

Vùng liên kết (binding domain)

BĐKH

Biến đổi khí hậu

bp

Cặp bazơ (base pair)

CBB

Coomassie Brilliant Blue

cDNA

DNA bổ sung (complementary deoxyribonucleic

acid)

5


CDBK

protein kinase phụ thuộc canxi (calciumdependent protein kinase)

Ct

Chu kỳ ngƣỡng (threshold cycle)

dCTP

Deoxycytidine triphosphate

DEPC

Diethylpyrocarbonate

DMSO

Dimethyl sulfoxide

dNTP

Deoxyribonucleoside Triphosphate

DRE

Yếu tố đáp ứng hạn (dehydration responsive
element)

DREB

Protein liên kết với yếu tố đáp ứng hạn DRE
(dehydration responsive element-binding protein)

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

FAO

Tổ chức lƣơng thực và Nông nghiệp Liên Hợp
quốc (Food and Agriculture Organization of
United Nations)

GMP

Guanosine monophate

HSP

Protein sốc nhiệt (Heat shock protein)

HK

Histidine Kinase

IPCC

Ủy ban liên chính phủ về Biến đổi khí hậu
(Intergovernmental Panel on Climate Change)

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

6


kb

Kilobase

LB

Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Luria-Bertani

LEA

Protein hình thành trong giai đoạn phát triển muộn
của phôi (late embryogenesis abundant)

LiAc

Lithium acetate

MAPK

Protein kinase hoạt hóa mitogen (MitogenActivated Protein Kinase)

MCS

Vùng nhân dòng đa điểm cắt (multiple cloning
site)

MOPS

Acid 3-(N-morpholino) propansulfonic

mRNA

Messenger ribonucleic acid

MS

Môi trƣờng nuôi cấy thực vật Murashige & Skoog

NAA

1-naphthaleneacetic acid

NAC

NAM – No Apica Meristem/ATAF1-Arabidopsis
transciption activation factor /CUC- Cup shaped
cotylendon

NACRS

Trình tự nhận biết protein NAC (NAC recognition
sequence)

NST

Nhiễm sắc thể

OD

Mật độ quang học (optical density)

ORF

Khung đọc mở (open reading frame)

PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain
reaction)

7


PEG

Polyethylene glycol

qRT-PCR

Phản ứng nhân bản gen định lƣợng thời gian thực

ROS

Các chất chứa oxy hoạt tính (reactive oxygen
species)

RT-PCR

Phản ứng nhân bản DNA sao chép ngƣợc (reverse
transcription polymerase chain reaction)

S. cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae

SDM

Môi trƣờng dinh dƣỡng tối thiểu (synthetic defined
medium)

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

Điện di gel polyacrylamide có chƣ́a SDS (SDS Polyacrylamide gel electrophoresis)

sqRT-PCR

Phản ứng nhân bản gen bán định lƣợng

TAE

Đệm Tris-acetate-EDTA

TBE

Đệm Tris-borate-EDTA

TE

Đệm Tris-EDTA

TF

Nhân tố phiên mã (transcription factor)

Ti-plasmid

Plasmid gây khối u (tumor inducing plasmid)

X-Gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dgalactopyranoside

8


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 | Giản đồ mô tả quá trình phản ứng chịu hạn ở thực vật .................. 30
Hình 1.2 | Con đƣờng dẫn truyền tín hiệu đáp ứng stress ở A. thaliana ......... 35
Hình 2.1 | Giản đồ miêu tả kỹ thuật sinh tổng hợp sợi phân tử cDNA sợi 1 của
mRNA trƣởng thành (GeneRacerTM Kit - Invitrogen) .................................... 61
Hình 2.2 | Giản đồ quy trình thiết kế vector chuyển gen pBIG-Lip9 và pBIGUBI mang trình tự mã hóa OsDREB1A và OsDREB2A ................................. 66
Hình 3.1 | Vị trí và tổ chức của OsDREB1A (Nipponbare cv.) ...................... 77
Hình 3.2 | Điện di sản phẩm khuếch đại trì nh tƣ̣ mã hóa OsDREB1A với mồi
đặc hiệu ........................................................................................................... 78
Hình 3.3 | Vị trí và tổ chức của gen OsDREB2A (Nipponbare cv.) ................ 80
Hình 3.4 | Nhân bản trì nh tƣ̣ mã hóa OsDREB2A tƣ̀ giống lúa Cƣờm Dạng . 82
Hình 3.5 | Kết quả PCR trực tiếp khuẩn lạc mang vector pUC19 tái tổ hợp .. 86
Hình 3.6 | Kết quả điện di PCR từ khuôn plasmid các vector pUC19 tái tổ
hợp ........................................................................................................... 87
Hình 3.7 | Kết quả điện di sản phẩm cắt

BamHI các vector pUC19 tái tổ

hợp ........................................................................................................... 88
Hình 3.8 | Kết quả giải và phân tích trình tự mã hóa OsDREB1A .................. 90

Hình 3.9 | Kết quả so sánh trình tự OsDREB2A ............................................. 91
Hình 3.10 | Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc biến nạp vector chuyển
gen ................................................................................................................... 93
Hình 3.11 | Kết quả điện di kiểm tra PCR các khuẩn lạc Agrobacterium tái tổ
hợp ................................................................................................................... 94

9


Hình 3.12 | Khả năng tạo callus của các giống lúa số thứ tự từ 1-24 ............. 96
Hình 3.13 | Khả năng tạo callus của các giống lúa số thứ tự từ 25-47 ........... 97
Hình 3.14 | Khả năng tái sinh của các giống lúa ........................................... 101
Hình 3.15 | Phản ứng của 5 giống lúa khi chuyển gen theo quy trình I ........ 103
Hình 3.16 | Quy trình chuyển gen giống Chành trụi sử dụng nền môi trƣờng
MS ................................................................................................................. 106
Hình 3.17 | Hình ảnh tƣ liệu hóa các bƣớc trong quy trình chuyển gen vào
giống lúa Chành Trụi .................................................................................... 107
Hình 3.18 | Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra cây Chành trụi chuyển
gen ................................................................................................................. 110
Hình 3.19 | Kết quả điện di sản phẩm PCR cây chuyển gen biến nạp cấu trúc
pBIG/Ubi:OsDREB2A với 02 cặp mồi đặc hiệu gen chuyển/Hygromycin .. 111
Hình 3.20 | Kết quả kiểm tra số bản sao cây chuyển gen bằng lai Southern
Blotting .......................................................................................................... 114
Hình 3.21 | Kết quả sàng lọc cây chuyển gen đồng hợp qua thông qua tỷ lệ
nảy mầm trên môi trƣờng Hygromycin ........................................................ 115
Hình 3.22 | So sánh một số chỉ tiêu sinh trƣởng giữa các dòng cây chuyển
gen T2 ..................................................................................................... 119
Hình 3.23 | Độ hụt khối của các dòng lúa chuyển gen T 2 khi mất nƣớc
cƣỡng bức .............................................................................................. 121
Hình 3.24 | Khả năng gữ nƣớc và phục hồi của các dòng chuyển gen T 2 sau

mất nƣớc cƣỡng bức ...................................................................................... 122
Hình 3.25 | Kết quả phục hồi của các dòng chuyển gen T 2 sau xử lý hạn
cƣỡng bức .............................................................................................. 123
10


Hình 3.26 | Khả năng phục hồi của các dòng chuyển gen T 3 sau ngừng tƣới
2-3 tuần .................................................................................................. 124
Hình 3.27 | Khả năng phục hồi, tạo hạt của các dòng T 3 chuyển gen khi xƣ̉ lý
hạn 3 tuần ở giai đoạn trƣởng thành ............................................................. 126
Hình 3.28 | Nghiên cứu mức độ biểu hiện OsDREB1A trong cây chuyển
gen T3 ..................................................................................................... 127
Hình 3.29 | Mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến tính chịu hạn trong
các dòng cây chuyển gen T3 .......................................................................... 128

11


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 | Các nghiên cứu chuyển gen chức năng tăng cƣờng tính chống/chịu
mặn ở lúa ......................................................................................................... 46
Bảng 1.2 | Nghiên cứu tạo giốn lúa chuyển gen chịu hạn trên thế giới .......... 49
Bảng 2.1 | Danh sách các giống lúa đƣợc trồng ở miền Bắc Việt Nam đƣợc sử
dụng trong nghiên cứu..................................................................................... 53
Bảng 2.2 | Trình tự các primer (oligo) sử dụng trong nghiên cứu .................. 54
Bảng 2.3 | Thành phần môi trƣờng đã đƣợc sử dụng trong chuyển gen lúa ... 56
Bảng 3.1 | Khả năng tạo callus của tập đoàn 47 giống lúa ............................ 95
Bảng 3.2 | Kết quả phân tích Anova hai nhân tố (3 lần lặp lại) khả năng tạo
callus của 47 giống lúa .................................................................................... 98
Bảng 3.3 | Kết quả phân tích Anova hai nhân tố (3 lần lặp lại) khả năng tái

sinh của 26 giống lúa..................................................................................... 100
Bảng 3.4 | Kết quả khảo sát khả năng tái sinh của 26 giống lúa có khả năng
tạo callus tốt .................................................................................................. 102
Bảng 3.5 | Khả năng tiếp nhận gen của 5 giống lúa Việt Nam ..................... 104
Bảng 3.6 | Kết quả biến nạp các vector chuyển gen vào lúa Chành Trụi ..... 108
Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra các cây chuyển gen T0 ....................................... 112
Bảng 3.8 | Kết quả theo dõi của các dòng lúa chuyển gen T0 ....................... 112
Bảng 3.9 | Kết quả ƣớc tí nh số lƣợng bản sao và tì nh trạng đồng hợp các
dòng T1................................................................................................ 117
Bảng 3.10 | Kết quả sinh trƣởng của các dòng lúa chuyển gen T 1 đồng hợp
tử......................................................................................................... 118
12


Bảng 3.11 | Một số chỉ tiêu sinh trƣởng của cây chuyển gen T2 và cây đối
chứng ............................................................................................................. 119
Bảng 3.12 | Khả năng giữ nƣớc của các dòng lúa chuyển gen T2................. 121
Bảng 3.13 | Khả năng phục hồi, kết hạt của các dòng lúa chuyển gen T 3 sau
xử lý hạn ........................................................................................................ 125

13


MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp với khoảng 70% dân số sinh sống ở
nông thôn và 48% lấy nông nghiệp làm sinh kế. Do đặc điểm tự nhiên và điều
kiện nền kinh tế, phần lớn các hoạt động sản xuất nông nghiệp của nƣớc ta
trong đó có sản xuất lúa gạo (nguồn lƣơng thực chính) bị phụ thuộc vào
nguồn nƣớc mƣa tự nhiên và nguồn nƣớc đổ về qua hai hệ thống sông Hồng
(miền Bắc) và sông Mekong (đồng bằng sông Cửu Long). Do đó, hạn hán

hoặc hiện tƣợng thiếu nƣớc tƣới cho sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là sản
xuất lúa nƣớc có thể xảy ra khi có sự thiếu hụt lƣợng mƣa hoặc nguồn nƣớc
đổ về qua hai hệ thống sông chính bị hạn chế.
Đối với sản xuất nông nghiệp, hạn hán là yếu tố môi trƣờng gây ảnh
hƣởng lớn nhất, là nguyên nhân chính làm giảm năng suất, sản lƣợng cây
trồng, đặc biệt là với những cây trồng cần nhiều nƣớc tƣới nhƣ cây lúa. Gần
đây, do ảnh hƣởng của hiện tƣợng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán xảy ra
ngày càng thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, gây tác động
lớn tới tổng sản lƣợng lƣơng thực quốc gia, ảnh hƣởng tới công tác xuất khẩu
lúa gạo, đe doạ trực tiếp tới an ninh lƣơng thực trong khu vực và trên thế giới.
Từ thực tế đó, việc tạo ra các giống cây trồng có năng suất cao, đồng thời
chống/chịu đƣợc với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng trở thành một trong
những nhiệm vụ then chốt của khoa học nông nghiệp trong nƣớc.
Thực tế hiện nay cho thấy những giống cây trồng chống chịu điều kiện
môi trƣờng bất lợi đƣợc sử dụng trong sản xuất ở Việt Nam đều đƣợc lai tạo
dựa trên các phƣơng pháp chọn giống truyền thống, hầu nhƣ chƣa có giống
cây trồng chịu hạn nào đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp công nghệ sinh học
hiện đại. Hiện nay, với sự phát triển bùng nổ của sinh học phân tử và công
nghệ tế bào, hai định hƣớng chọn giống chịu hạn đang đƣợc các nhà khoa học

14


trong nƣớc cũng nhƣ quốc tế đặc biệt quan tâm là chọn giống kết hợp chỉ thị
phân tử và chọn giống nhờ kỹ thuật chuyển gen thực vật. Trong hai phƣơng
pháp này thì bƣớc đầu phƣơng pháp chọn giống kết hợp chỉ thị phân tử đã
bƣớc đầu thu đƣợc các kết quả ấn tƣợng đặc biệt là với các tính trạng đơn gen
nhƣ các gen kháng, gen quy tính tính trạng số lƣợng...
Tuy nhiên, do tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen nên định hƣớng
chọn giống ứng dụng chỉ thị phân tử đang gặp khó khăn lớn trong việc quy tụ

các tính trạng, gen quan trọng liên quan đến chịu hạn. Gần đây, dựa trên
những thành tựu nghiên cứu về chức năng hệ gen thực vật, cùng với sự phát
triển các kỹ thuật microaray, proteomic..., các nhà khoa học đã phát hiện và
chứng minh vai trò quan trọng của nhóm gen điều khiển trong việc tăng
cƣờng tính chịu hạn ở thực vật. Nhóm gen điều khiển mặc dù không tham gia
trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn của thực vật nhƣng sự biểu
hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng
khác tham gia vào quá trình đáp ứng hạn, dẫn tới làm tăng cƣờng khả năng
chịu hạn ở thực vật.
Phát hiện này đã mở ra một hƣớng nghiên cứu rất cho lĩnh vực chọn
giống chuyển gen ở thực vật, đó là chỉ cần chuyển một hay một vài gen điều
khiển thay vì vài trăm gen chức năng vào cây để tăng cƣờng tính chống chịu
của cây trồng. Chính vì lí do này mà các nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá
các gen điều khiển liên quan đến tính chịu hạn đang trở thành định hƣớng
nghiên cứu đầy tiềm năng trong việc chuyển gen/chọn tạo giống chịu hạn.
Ở Việt Nam, trong khoảng 10 năm trở lại đây, các nghiên cứu về phân
lập gen chịu hạn và tạo giống cây trồng chống chịu hạn bằng công nghệ
chuyển gen thực vật đã bắt đầu đƣợc một số phòng thí nghiệm quan tâm. Tuy
nhiên, hầu hết các chƣơng trình, dự án nghiên cứu về gen chống chịu stress
môi trƣờng nói chung và chống chịu hạn nói riêng đều đƣợc tiến hành với

15


nguồn vật liệu hoặc nền di truyền không phải của Việt Nam, do đó tính ứng
dụng ra thực tiễn sản xuất ít nhiều bị hạn chế. Xuất phát từ thực tế nêu trên,
chúng tôi đã đề xuất và tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu phân lập và
chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa ở Việt Nam” với mục
đích để tạo nguồn vật liệu, số liệu quan trọng trong việc tạo ra các giống cây
trồng chuyển gen có khả năng chống chịu điều kiện hạn.

Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu chung:
Phân lập và chuyển đƣợc gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa
ở Việt Nam để tạo nguồn vật liệu cho việc chuyển gen/lai tạo các giống cây
chống chịu hạn.
Mục tiêu cụ thể:
i)

Phân lập đƣợc gen mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB1A/2A liên quan
tính chịu hạn trên giống lúa Việt Nam.

ii)

Tối ƣu hoá đƣợc quy trình biến nạp gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens trên một số giống lúa ở Việt Nam.

iii)

Tạo ra đƣợc một số dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã
OsDREB1A/2A tăng khả năng chịu hạn trong điều kiện phòng thí
nghiệm.

Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu của luận án:
(i) Các gen OsDREB1A/2A mã hóa nhân tố điều hòa phiên mã liên quan
tới tính chịu hạn của giống lúa trồng ở Việt Nam và vai trò, biểu hiện của các
gen mã hóa nhân tố phiên mã này trong các dòng lúa chuyển gen dƣới sự điều
khiển của các promoter liên tục hoặc cảm ứng;

16


(ii) Khả năng tạo callus, tái sinh và tiếp nhận gen lạ thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens của một số giống lúa trồng ở phía Bắc Việt Nam.
Các nội dung nghiên cứu chính:


Nội dung 1: Phân lập và thiết kế vector chuyển gen

OsDREB1/OsDREB2A của giống lúa Việt Nam dƣới sự điều khiển của
promoter liên tục (Ubiquitine)/cảm ứng (Lip9).


Nội dung 2: Nghiên cứu qui trình chuyển gen vào giống lúa

trồng ở Việt Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.


Nội dung 3: Tạo giống lúa Chành Trụi chuyển gen

OsDREB1/OsDREB2A.


Nội dung 4: Đánh giá kiểu hình và biểu hiện của các dòng

chuyển gen trong điều kiện xử lý hạn tại phòng thí nghiệm.

Địa điểm nghiên cứu
Luận án đƣợc thực hiện tại 2 địa điểm chính: Bộ môn Bệnh học Phân

tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) là
địa chỉ uy tín , dẫn đầu trong cả nƣớc về công tác phân lập , nghiên cứu chức
năng của các gen mã hóa nhân tố phiên mã ; và Phòng thí nghiệm Tƣơng tác
Cây trồng -Vi sinh vật , Trung tâm nghiên cƣ́u vì sự phát triển

(IRD,

Montpellier) là phòng thí nghiệm hiện đại, có nhiều chuyên gia uy tín trong
nghiên cứu chức năng, biểu hiện của gen/bộ gen thực vật (đặc biệt là lúa).

Đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình nghiên cứu cơ bản theo định hƣớng ứng dụng hai
gen mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB1A và OsDREB2A liên quan tính chịu
hạn. Trong nghiên cứu này, trình tự mã hóa hai nhân tố phiên mã OsDREB1A
và OsDREB2A đƣợc phân lập từ nguồn vật liệu di truyền của giống lúa Việt
Nam và đƣợc đƣa vào vector biểu hiện thực vật dƣới sự điều khiển bởi

17


promoter hoạt động liên tục (Ubiquitin) hoặc promoter cảm ứng stress (Lip9).
Bốn dòng lúa Chành trụi chuyển gen thế hệ T3 đã đƣợc xác định có mang gen
chuyển ổn định (một bản sao, đồng hợp tử). Thử nghiệm cho thấy, cả bốn
dòng lúa đều có khả năng sống sót và tiếp tục sinh trƣởng, ra hạt khi bị xử lý
hạn cƣỡng bức ở giai đoạn mạ/sinh trƣởng. Đặc biệt là hai dòng L3 và L5
(Lip9:OsDREB1A) có kiểu hình tƣơng đồng với cây không chuyển gen trong
điều kiện bình thƣờng và có tỷ lệ sống sót cao khi xử lý hạn.
Luận án đã nghiên cứu khả năng phát sinh callus và tái sinh chồi từ
callus của lƣợng lớn giống lúa ở Việt Nam và đã chỉ ra đƣợc một số giống lúa
có tiềm năng để nghiên cứu, xây dựng quy trình chuyển gen thích hợp cho

từng giống lúa. Điều này càng ý nghĩa hơn khi thời gian gần đây với công
nghệ chỉnh sửa hệ gen đang có những bƣớc tiến dài, chúng ta có thể tạo ra
đƣợc các giống lúa công nghệ sinh học không qua lai tạo, có các đặc điểm
nông sinh học vƣợt trội mà vẫn giữ các phẩm chất của giống gốc ban đầu.
Trong luận án này lần đầu tiên ở Việt Nam, phản ứng PCR định lƣợng
đƣợc áp dụng thành công để ƣớc tính số lƣợng bản sao của cấu trúc chuyển
gen và xác định các dòng chuyển gen đồng hợp ngay từ thế hệ T 1. Phƣơng
pháp này có một số ƣu thế so với các phƣơng pháp trƣớc đó: tiết kiệm thời
gian và vật liệu thí nghiệm, mức độ chính xác cao và xác định đƣợc thể đồng
hợp ngay ở thế hệ T1 và rất phù hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm còn
nhiều hạn chế trong nƣớc.
Ứng dụng thực tiễn của luận án
Kết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra đƣợc các dòng T3 (đồng hợp,
một bản sao gen OsDREB1A dƣới sự điều khiển của promoter cảm ứng Lip9)
có kiểu hình tƣơng đồng cây đối chứng không chuyển gen và đặc biệt có khả
năng phục hồi và kết hạt sau 3 tuần ngừng tƣới nƣớc. Đây là kết quả quan
trọng, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của gen OsDREB1A và điều hòa biểu

18


hiện của gen mã hóa nhân tố phiên mã dƣới sự điều khiển của promoter cảm
ứng trong công tác tạo giống cây chuyển gen chịu hạn. Trên cơ sở kết quả của
luận án, các vector biểu hiện gen OsDREB1A và OsDREB2A đƣợc tạo ra đang
đƣợc nghiên cứu chuyển vào các giống cây trồng quan trọng nhƣ ngô, đậu
tƣơng, bông… để chọn tạo các giống cây chuyển gen chịu hạn nhằm đáp ứng
nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu.
Ngoài ra dòng chuyển gen tiếp tục đƣợc duy trì theo dõi trong nhà lƣới để làm
nguyên liệu cho công tác lai tạo giống khi điều kiện thực tế cho phép (chấp
nhận cây lúa chuyển gen và vật liệu di truyền do sự kiện chuyển gen tạo ra).

19


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. HÁN HẠN-YẾU TỐ KÌM HÃM TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP
1.1.1. Khái niện về hạn hán

Cây trồng luôn cần có nƣớc để duy trì sự sống, tuy nhiên nhu cầu tiêu
thụ nƣớc t huộc vào từng loại cây trồng cũng nhƣ giai đoạn phát triển của
chúng. Hạn đối với thực vật là khái niệm chỉ sự thiếu nƣớc do môi trƣờng gây
nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn, làm ảnh hƣởng đến
quá trình sinh trƣởng và phát triển. Dƣới tác động các yếu tố gây hạn của môi
trƣờng nhƣ thành phần thổ nhƣỡng, thời tiết, khí hậu, nhiệt độ cao, gió
nóng… đã gây nên hiện tƣợng thiếu nƣớc của cây, mà nguyên nhân chính là
do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa cây và môi trƣờng, dẫn đễn sự thiếu
hụt nƣớc trong tế bào. Trong trƣờng hợp này, tác động của môi trƣờng bên
ngoài rất lớn, gây ảnh hƣởng đáng kể lên sự phát triển của cây. Thông thƣờng,
hạn đƣợc phân biệt thành 3 loại là hạn không khí, hạn đất và hạn toàn diện.
Hạn không khí thƣờng có đặc trƣng là nhiệt độ cao (39 oC - 42oC) và độ
ẩm thấp (< 65%), thƣờng gặp ở những tỉnh miền Trung Việt Nam vào những
đợt gió Lào và ở vùng Bắc bộ vào cuối thu, đầu đông. Đối với thực vật nói
chung và cây lúa nói riêng, hạn không khí thƣờng gây ra hiện tƣợng héo tạm
thời thậm chí nếu bị khô kiệt nƣớc, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến
tế bào mô bị tổn thƣơng và chết [21, 36, 90]. Hạn đất tác động trực tiếp đến
bộ phận rễ làm ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của
cây. Đối với cây trồng cạn, hạn đất cũng ảnh hƣởng nghiêm trọng đến giai
đoạn gieo hạt và nảy mầm. Lƣợng nƣớc trong đất không đủ làm co mầm và
héo; nếu thiếu nƣớc nặng sẽ gây thui chột mầm và chết [36]. Hạn toàn diện là
hiện tƣợng khi có cả hạn đất và hạn không khí xảy ra cùng một lúc. Hạn toàn

20


diện thƣờng dẫn đến hiện tƣợng héo vĩnh viễn, cây không có khả năng phục
hồi. Ở nƣớc ta, hạn toàn diện thƣờng xảy ra ở các tỉnh miền Trung nhƣ Nghệ
An, Hà Tĩnh..., gây thiệt hại đáng kể cho cây trồng nói chung và cây lúa nói
riêng [9, 11, 16].
1.1.2. Tác động tiêu cực của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp

Trong các yếu tố bất lợi của môi trƣờng, hạn hán là nhân tố chính và
phổ biến nhất gây ảnh hƣởng tiêu cực đến sản xuất nông nghiệp. Hiện nay,
các vùng canh tác phải đối mặt với hạn hán chiếm khoảng 1% tổng diện tích
đất nông nghiệp trên toàn thế giới, và đƣợc dự báo sẽ tăng lên 30% vào cuối
thế kỉ 21 [11]. Mức độ ảnh hƣởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp phụ
thuộc vào tần xuất, cƣờng độ, tính khắc nghiệt của đợt hạn hán và cả tính
nhạy cảm của từng đối tƣợng cây trồng. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với nông
nghiệp có thể diễn ra hàng năm hoặc thậm chí là mãi mãi, do tác động tới chất
lƣợng sản phẩm, giảm năng suất, tăng nguy cơ nhiễm bệnh và các dịch hại do
sâu bọ, tăng chi phí tƣới tiêu, dẫn tới làm mất sản lƣợng cây trồng và giảm thu
nhập của ngƣời nông dân [10].
Tại Trung Quốc, hạn hán nghiêm trọng thƣờng xuyên xảy ra ở vùng
miền Bắc . Tình trạng hạn hán bắt đầu từ cuối tháng

7 hàng năm gây ảnh

hƣởng nghiêm trọng đến vùng trồng ngô lớn nhất tại đây (chiếm 60% tổng
diện tích trồng trọt). Nền sản xuất nông nghiệp ở Ấn Độ cũng thƣờng xuyên
phải đối mặt với các đợt hạn hán nghiêm trọng. Đặc biệt đợt hạn hán năm
2010 đã khiến tăng trƣởng của quốc gia này giảm 1%. Đợt hạn hán tồi tệ

trong 02 năm gần đây xảy ra tại Thái Lan đã đẩy quốc gia xuất khẩu gạo lớn
nhất thế giới đối mặt với vụ mùa thất thu, sản lƣợng giảm hơn 50%. Ở Mỹ,
thiệt hại do hạn hán hàng năm khoảng 6-8 tỉ USD, tính riêng trong năm 2012,

21