qui trình định lượng tổng coliform

BỘ CÔNG THƯƠNG 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TP HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG
COLIFORMS
GVHD : Phan Thị Kim Liên
Môn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm
Nhóm 3 


DANH SÁCH NHÓM

1.
2.
3.
4.
5.

Trần Vũ Quỳnh Anh

2005140006

Thạch Nguyễn Phương Khanh

2005140239

Vũ Kim Nguyên

2005140357

Hồng Lệ Nhi

2005140369

Trần Văn Thắng

2005140501


Nội dung

Tình hình ngộ độc

Tổng quan về

Các phương pháp

Coliforms

định lượng

PP đếm đĩa

PP MPN


1.

Tình hình ngộ độc thực phẩm:

• Theo thống kê của Bộ Y tế, chỉ trong 4 tháng đầu năm 2016, cả nước đã xảy ra gần
30 vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng, làm trên 1.386 người bị ngộ độc, trong đó
có 2 trường hợp tử vong. Riêng trong tháng 4.2016 đã xảy ra 9 vụ ngộ độc thực
phẩm, làm 375 người bị ngộ độc.

•  Hầu hết các bệnh nhân bị ngộ độc do ăn phải thức ăn bị nhiễm vi sinh vật bởi thời
tiết nóng bức gây ra, cùng với đó là một số trường hợp bị ngộ độc do hấp thụ phải
hóa chất tồn dư trong thực phẩm.


2.  Tổng quan về Coliforms:

• Coliforms là một chỉ tiêu thông dụng được dùng để đánh giá
mức độ an toàn về vi sinh trong thực phẩm.

• Sự hiện diện một lượng lớn Coliforms trong thực phẩm là điều
không mong muốn, tuy nhiên rõ ràng không thể loại bỏ
chúng hoàn toàn khỏi nhiều thực phẩm đông lạnh và tươi
sống.

•  Vấn đề ở chỗ số lượng chúng đến mức nào, có thể coi là
không an toàn trong thực phẩm.


2.  Tổng quan về Coliforms:

• Thuộc nhóm trực khuẩn gram (-).
• Không sinh bào tử.
• Hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện.
• Có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37oC trong 24-48h.

• to : -2o-50oC
• pH: 4,4-9,0.


2.  Tổng quan về Coliforms:

• Colifforms gồm 4 nhóm chính:
oEscherichia ( với 1 loài duy nhất là E.coli).
oCitrobacter.
oKlebsiella.
oEntrobacter.
• Tính chất sinh hóa của nhóm này được thể hiện qua các thực nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), VogesProskauer (VP), và Citrate (iC) thuogwf được gọi là IMViC.


2.  Tổng quan về Coliforms:

• Thường sống ở ruột và phân người hoặc các động vật máu nóng.
• Nguồn nhiễm: nhiễm từ nước hoặc phân chứa VSV gây bệnh.
• Triệu chứng:
• Bệnh phát đột ngột, gây đau bụng dữ dội, ít nôn mửa, đi phân lỏng, sốt nhẹ.
• Có trường hợp sốt cao, chân co.
• Thời gian ủ bệnh 2h-20h.
• Khỏi sau 2-3 ngày.


3. Các phương pháp định lượng

PP đếm khuẩn lạc

PP MPN

Phương pháp
ĐẾM KHUẨN LẠC.


3.1. 1 Nguyên tắc.

• Số lượng Coliforms được xác định bằng cách cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường
rắn chọn lọc thích hợp( thạch Violet Red Bile) có chứa lactose và chất chỉ thị pH. Đếm
o
khuẩn lạc lên men lactose tiêu biểu sau khi ủ ở 37 C trong thời gian 24h. Đếm khuẩn lạc
điển hình và khẳng định lại trong môi trường canh Brilliant Green Bile Salt Lactose ( BGBL),
o
Coliforms sẽ sinh khí trong môi trường này ở 37 C trong 24h. Kết quả được biểu thị bằng
số Coliforms trên 1g mẫu chưa pha loãng.


3.1.2. Môi trường hóa chất.

Saline Pepton Water (SPW).
• NaCl
• Pepton
• Nước cất vừa đủ

1g
8,5g
1L

3.1.2. Môi trường hóa chất.

Trypton Soya Agar (TSA).
• Pancreatic Digest of Casein
• Soy peptone
• Sodium chloride
• Agar

15g
5g
5g
5g


3.1.2. Môi trường hóa chất.

Violet Red Bile Agar (VRB).
• Pepton
• Yeast Extract
• Bile Salts
• Lactose
• Sodium chloride
• Neutral Red
• Agar

7g
3g
1,5g
10g
5g

0,03g
15g


3.1.2. Môi trường hóa chất.

Môi trường canh Brilliant Green Bile Salt Lactose ( BGBL).
• Pepton
• Lactose
• Mật bò
• Brillantgreen
• Nước cất vừa đủ

10g
10g
20g
0,0133g
1L


3.1.3. Thiết bị và dụng cụ.

• Đĩa petri.
• Ống nghiệm.
• Que cấy.
• Tủ ấm.
• Bể điều nhiệt.
• Máy đếm khuẩn lạc ( hoặc kính hiển vi).

3.1.4. Qui trình phân tích
10(25g) đối với mẫu rắn hoặc 10(25ml) đối với mẫu lỏng + 90(225ml)SPW
( Đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 60s)

-x
Dịch mẫu 10

Pha loãng

-(x+1)
Dịch mẫu 10
1ml dịch

1ml dịch

2 đĩa

2 đĩa

+ 5ml môi trường TSA, xoay đều, để yên trong 1-2h

Tính và biểu thị kết quả

Cấy 5 khuẩn lạc nghi ngờ vào các
o
ống nghiệm chứa BGBL, ủ ở 37 C

o
+ 10/15ml môi trường thạch VRB. Xoay nhẹ trộn đều mãu, để ở nhiệt độ phòng, chờ chô hỗn hợp đông, lật ngược đĩa và ủ ở 37 C
trong 24h

trong 24h


3.1.5. Các bước tiến hành.
Bước 1: Chuẩn bị mẫu

 Cân chính xác 10g(25g) đối với mẫu rắn hoặc đong
10ml(25ml) đối với mẫu lỏng cho vào bình tam giác.

mẫu

SPW

 Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml(225ml) vô trùng vào
bình tam giác chứa mẫu.

 Đồng nhất mẫu + SPW trong máy dập mẫu 1 phút hoặc lắc
đều bình tam giác 2 – 3 phút.


3.1.5. Các bước tiến hành

LƯU Ý:

•
•

Nhiệt độ của SPW trong suốt quá trình thao tác luôn giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng → VSV không bị tổn thương.
Để pipet nằm ngang (không để đứng) do các bào tử lắng xuống nhanh.

3.1.5. Các bước tiến hành
Bước
•   2: Pha loãng mẫu

 Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu cho vào
ống nghiệm chứa 9ml SPW vô trùng.

1ml

 Trộn kỹ bằng máy vortex 5 – 10 giây → dd pha loãng

1ml

(đối với mẫu nguyên chất thì dd pha loãng là ).

 Lặp lại thao tác trên để có được dd pha loãng ,… cho đến
9ml

9ml

SPW

SPW

-1
10

-2

10

khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp.


3.1.5. Các bước tiến hành
Bước 3: Cấy và ủ mẫu

1ml
10

Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu đã pha

-1
1.1

1.2

loãng vào đĩa petri. Sử dụng 2 nồng độ liên tiếp,
mỗi nồng độ 2 đĩa petri.
5ml

TSA

1ml

Bổ sung thêm 5ml môi trường TSA, xoay đều
đĩa để trộn đều mẫu, để yên trong 1-2h.

10

-2
2.1

2.2


3.1.5. Các bước tiến hành
Bước 3: Cấy và ủ mẫu

Tiếp tục bổ sung thêm khoảng 15ml môi trường VRB.
1.1

1.2

Xoay tròn đĩa theo cùng và ngược chiều kim đồng hồ,
mỗi chiều 5 lần.

Sau khi môi trường đông hoàn toàn rót thêm 4ml môi
VRB

trường VRB tráng kín bề mặt đĩa và để đông đặc như
trên.

2.1

2.2

Lật úp đĩa và ủ ở 377̊C trong 24h.

3.1.5. Các bước tiến hành
Bước 4: Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

 Đếm các đĩa có số khuẩn lạc <150 sau 24h nuôi cấy.
 Khuẩn lạc Coliforms đặc trưng trên môi trường VRB màu đỏ tía và được bao quanh bởi 1
vùng hơi đỏ.

 Tính giá trị trung bình từ các độ pha loãng để quy về số coliforms trong 1g mẫu.
 Cấy 5 khuẩn lạc nghi ngờ của mỗi loại vào các ống nghiệm chứa môi trường lỏng BGBL,
ủ ở 377̊C trong 24h.


3.1.6. Công thức tính.

•Tổng
  số coliforms trong 1g mẫu:
X = (CFU/g hay CFU/ml)

•
•
•
•
•
•

R: tỉ lệ khẳng định dương tính
C: tổng số khuẩn lạc coliforms đếm được trên 4 đĩa
V: thể tích dịch đã cấy trên mỗi đĩa (ml)
d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất

: số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất
: số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai


Phương pháp MPN