NGHIÊN cứu xác ĐỊNH một số THÀNH PHẦN hóa học QUAN TRỌNG TRONG nấm THƯỢNG HOÀNG TRỒNG tại VIỆT NAM

ĐẠI HỌC KHOA HỌC HUẾ
KHOA HÓA HỌC

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ
THÀNH PHẦN HÓA HỌC QUAN TRỌNG TRONG NẤM THƯỢNG HOÀNG – Phellinus
linteus (Berk Curt.) Teng – TRỒNG TẠI VIỆT NAM

Giáo viên hướng dẫn:

Nhóm sinh viên thực hiện:

Lê Lâm Sơn

Nguyễn Thị Phương Nhi
Trần Thị Vẽ
Hoàng Ngọc Sỹ
01/2016


MỞ ĐẦU

Polysaccharide
Cấu trúc phong phú
Đa dạng về hoạt tính sinh học

Nghiên cứu xác định thành phần
Nấm Thượng hoàng

hóa học của nấm Thượng hoàng

Nấm dược liệu mới
Lần đầu tiên trồng tại Việt Nam

2


3

NỘI DUNG CHÍNH
Kết luận

Phương pháp – Kết quả

Tổng quan

nghiên cứu


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về nấm Thượng hoàng
1.2. Tổng quan về polysaccharide
1.3. Tổng quan về triterpenoid

4


1.1. Tổng quan về nấm thượng hoàng

Phân loại

Hình 1. Nấm Thượng hoàng sắp thu hoạch.

-

Giới Fungi

-

Ngành Basidiomycota

-

Lớp Basidiomycetes

-

Bộ Hymenochaetales

-

Họ Hymenochaetaeae

-

Chi Phellinus

-

Loài P. linteus

5


1.1. Tổng quan về nấm thượng hoàng

Hình 2. Phân bố địa lý nấm Thượng
hoàng.

Phellinus linteus
6


1.1. Tổng quan về nấm thượng hoàng

Đặc điểm

‒
‒
‒

Quả thể không cuống dạng quạt đến thon dài, gỗ cứng.
Kích thước quả thể: 7 – 10 × 11 – 15 × 5 – 8 cm.
Mặt mũ: màu nâu hạt dẻ đậm, có lông mịn.

Hình 3. Nấm Thượng hoàng sấy khô sau khi thu hoạch.

7

1.1. Tổng quan về nấm thượng hoàng

Bảng 1. Một số công trình nghiên cứu thành phần hóa học của nấm Thượng hoàng.

STT

Nguồn gốc nấm

Nội dung

Năm

1

Đài loan

Secquiterpene

2013

2

Cam pu chia

Phenolic

2011

3

Hàn quốc

Cấu trúc của polysaccharide (PS)

2008

4

Hàn quốc

Acidic polysaccharide

2003

5

Hàn quốc

Acidic proteo-heteroglycan

2003

8


1.1. Tổng quan về nấm thượng hoàng

Công dụng

•
•
•
•

Chống ung thư
Kháng khuẩn, kháng u, kháng virus
Điều hòa miễn dịch
Chống đông máu, nghẽn tĩnh mạch

Đặc biệt, tại trung tâm nghiên cứu ung thư Tokyo (1976), tỉ lệ ức chế khối u của nấm Thượng hoàng cao nhất.

9


1.2. Tổng quan về polysaccharide

Homo-PS

‒
‒

Glycan
Heteroglycan

Polysaccharide

Hetero-PS

‒

‒

N-heteropolysaccharide
S-heteropolysaccharide

10


1.2. Tổng quan về polysaccharide

Hoạt tính sinh học

‒
‒
‒

Homopolysaccharide: chống ung thư, tăng tính miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus,…
Protein-polysaccharide: chống lại sự hình thành các khối u, kháng oxy hóa, kháng ung thư,…
Sulfate-polysaccharide: tăng hoạt động miễn dịch, tác dụng ức chế tế bào ung thư,,…

11


1.2. Tổng quan về polysaccharide

Cấu trúc PS của nấm Thượng hoàng
John R. Baker (2008) xác định cấu trúc mạch chính của P.linteus: bộ khung glucomannan với liên kết chủ yếu β (1-3) glucopyranoside, liên kết β (1-3)
mannopyranoside.

12

Hình 4. Cấu trúc mạch chính của PS nấm Thượng hoàng.


1.2. Tổng quan về triterpenoid

Bộ khung cơ bản

Hình 5. Cấu trúc bộ khung cơ bản của triterpenoid.

Tính chất

‒
‒
‒

Không phân cực.
Thành phần chính trong tinh dầu.
Hoạt tính sinh học cao.

13


MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Cung cấp thông tin về hàm lượng một số hoạt chất chính trong nấm Thượng hoàng.
Cung cấp thông tin về cấu trúc polysaccharide tách chiết từ nấm Thượng hoàng.

14

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1.
2.
3.
4.
5.

Tách chiết, định tính các nhóm hợp chất quan trọng từ mẫu nấm Thượng hoàng.
Định lượng một số nhóm chất hữu cơ chính.
Phân đoạn PS theo độ phân cực của dung môi, tinh chế và xác định tỷ lệ khối lượng Pr/PS.
Phân đoạn PS theo sự tương tác điện tích và xác định tỷ lệ khối lượng Pr/PS.
Xác định cấu tạo phân đoạn PS-E48.

15


PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.
2.
3.
‒‒
‒‒
4.
5.

Phương pháp chiết: chiết rắn – lỏng, chiết lỏng – lỏng trong tách chiết và tinh chế PS.
Phương pháp hóa học: định tính các nhóm hợp chất quan trọng.
Phương pháp định lượng:

Phương pháp khối lượng: xác định độ ẩm.
Phương pháp trắc quang: định lượng một số hoạt chất chính.
Phương pháp phân đoạn PS theo độ phân cực dung môi và theo sự tương tác điện tích.
Phương pháp xác định cấu trúc PS bằng GC-MS.

16


1. Phương pháp tách chiết và tinh chế PS

3 (g) mẫu
- Chiết bằng nước, 6 lần, mỗi lần 200 mL
Bã

o
- Nhiệt độ 100 C
- Thời gian 4 giờ

Dịch nước

Định lượng carbohydrate tổng

o
- Tủa bằng ethanol 96 C (Vdịch:VEtOH) = 4:1
Dịch

Định lượng đường phân tử lượng thấp

o
- Làm lạnh đến - 4 C

- Để qua đêm
Cao PS
17
Hình 6. Quy trình tách chiết polysaccharide.


1. Phương pháp tách chiết và tinh chế PS

Cao PS

Hòa tan bằng lượng nước cất vừa đủ

Dịch nước

1. Lắc qua butanol:chloroform (4:1), 3 lần
2. Thu phân lớp nước
o
0
3. Tủa bằng ethanol 96 , làm lạnh đến – 4 C, để qua đêm
4. Cất đuổi dung môi

PS tinh khiết
18
Hình 7. Quy trình tinh chế polysaccharide.


2. Phương pháp định lượng các nhóm hoạt chất chính

Phương pháp trắc quang đường chuẩn ngoại chuẩn

‒
‒
‒
‒
‒

Định lượng polysaccharide: thuốc thử phenol-sulfuric (λ = 490 nm).
Định lượng triterpenoid: thuốc thử vanillin/HClO 4 (λ = 740 nm).
Định lượng phenolic: thuốc thử Folin – ciocalteu (λ = 760 nm).
Định lượng flavonoid: thuốc thử AlCl3 trong môi trường kiềm (λ = 510 nm).
Định lượng protein: thuốc thử Lowry (λ = 750 nm).

19


3. Phương pháp phân đoạn PS
theo độ phân cực dung môi

Dịch PS
Cô về thể tích nhỏ
o
Tủa bằng EtOH 96 (Vdịch : VEtOH) = 1 : 0.5
o
Làm lạnh – 4 C để qua đêm

PS-E32

Dịch PS1
o
Tủa bằng ethanol 96 C (1:1)

PS-E48

o
Làm lạnh đến - 4 C, để qua đêm
Dịch PS2
o
Tủa bằng ethanol 96 C (1:1)
PS-E68

o
Làm lạnh đến - 4 C, để qua đêm
Dịch PS3

Hình 8. Sơ đồ phân đoạn polysaccharide theo độ phân cực dung môi EtOH.

20


4. Phương pháp phân đoạn PS
theo tương tác điện tích

100 mL PS-E48 5 mg/mL

1.
2.
3.

100 mL (NH4)2SO4 60%
o

Để 24 giờ, 25 C
Ly tâm 6500 vòng/phút, 20 phút

Kết tủa

Dịch

1.
2.
PS-E48a

Thẩm tách
Tủa bằng EtOH 96

o

1.
2.
3.

Hòa tan bằng nước
Thẩm tách
Tủa bằng EtOH 96

o

PS-E48b
21

Hình 9. Sơ đồ phân đoạn polysaccharide theo tương tác điện tích với (NH4)2SO4.

5. Phương pháp xác định cấu trúc PS bằng phương pháp GC-MS
0,5 g PS-E48
1. 25 mL (CH3)2SO
0
2. Khuấy từ 60 C bằng dòng N2
Dịch PS-E48
1. 12,5 g NaOH
2. 20 ml (CH3)2SO4
3. Khuấy từ bằng dòng N2 16 giờ
Hỗn hợp phản ứng

1.
2.

Chiết qua hệ CHCl3:H2O = 2:1
Cô đuổi dung môi

PS-E48 đã methyl hóa
Hình 10. Sơ đồ methyl hóa phân đoạn PS-E48.

22


5 (mg) mẫu PS-E48 đã methyl hóa
0
1. 4 mL TFA 2M/ 2 giờ, 120 C
Thủy phân PS

2. 5 mL MeOH
3. Bay hơi bằng dòng N2/ 2 lần

O-methyl monosaccharide
1. 4 mL NaBH4 0,25 M/ NH4OH 1M
2. 5 mL CH3COOH 10%/MeOH

Khử monosaccharide

3. Bay hơi bằng dòng N2/ 2 lần

O- methyl Alditol
0
1. 2 mL dd anhydride acetic:pyridin = 1:1 (v/v)/100 C, 20 phút
Acetyl hóa alditol

2. 5 mL MeOH
3. Bay hơi bằng dòng N2/ 2 lần

O-methyl - O- acetyl Alditol

Phân tích GC-MS

Hình 11. Sơ đồ acetyl hóa phân đoạn PS-E48 đã methyl hóa.

23


CHƯƠNG 2.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

24


1. Độ ẩm

Bảng 2. Kết quả độ ẩm mẫu nấm Thượng hoàng

Lần TN

mcốc (g)

mtrước (g)

msau (g)

W (%)

1

29,94

32,97

32,37

19,80

2

63,22

66,26

65,66

19,74

3

53,48

56,48

55,87

20,33

WTB

 

19,96
0,81
19,96 0,81

Độ ẩm của nấm Thượng hoàng khá cao  dễ ẩm mốc, bảo quản cẩn thận.
25