Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học phân đoạn nƣớc cây mỏ quạ cudrania tricuspidata (2017)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

-------------------

NGUYỄN THỊ NGA

KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
PHÂN ĐOẠN NƢỚC CÂY MỎ QUẠ
CUDRANIA TRICUSPIDATA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

PGS.TS NGUYỄN VĂN BẰNG

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS
Nguyễn Văn Bằng ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời
gian hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn TS. Hoàng Lê Tuấn Anh và các anh chị phòng
Nghiên cứu cấu trúc – Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã nhiệt tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong quá trình nghiên
cứu tại Viện.
Qua đây, em cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong khoa
Hóa học, Trƣờng đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ em
trong suốt thời gian học tập ở trƣờng.

Khóa luận tốt nghiệp không tránh khỏi những thiếu sót em rất mong
nhận đƣợc sự góp ý, chỉ bảo của các thầy cô và các bạn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 26 tháng 4 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Thị Nga


LỜI CAM ĐOAN
Đề tài “Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học phân đoạn nƣớc cây Mỏ
quạ (Cudrania tricuspidata) ’’ là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự
hƣớng dẫn khoa học của PGS.TS Nguyễn Văn Bằng. Các kết quả, số liệu
nêu trong khóa luận này là trung thực đƣợc làm từ thực nghiệm tại phòng
Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam. Các kết quả không trùng với các kết quả đã đƣợc công bố
trƣớc đây.
Sinh viên

Nguyễn Thị Nga


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
Nhiệm vụ chính của đề tài là:............................................................................ 2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................. 3
1.1. Nghiên cứu tổng quan về cây Mỏ quạ ................................................. 3
1.1.1. Thực vật học ............................................................................... 3
1.1.2. Mô tả cây .................................................................................... 3
1.1.3. Phân bố và sinh thái ................................................................... 4

1.1.4. Bộ phận dùng .............................................................................. 4
1.1.5. Tính vị và công dụng .................................................................. 5
1.1.6. Thành phần hóa học ................................................................... 6
1.1.7. Hoạt tính sinh học .................................................................... 11
1.2. Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật ............................................... 12
1.2.1 Chọn dung môi chiết.................................................................. 12
1.2.2. Quá trình chiết .......................................................................... 14
1.3. Tổng quan về phƣơng pháp sắc kí ..................................................... 15
1.4. Một số phƣơng pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất
hữu cơ........................................................................................................ 19
1.4.1. Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy – IR) ........................... 19
1.4.2. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy – MS) ............................. 20
1.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy – NMR) ........................................................................... 21
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 24
2.1. Mẫu thực vật ...................................................................................... 24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................... 24
2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu .............................................. 24


2.2.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân
lập các hợp chất.................................................................................. 24
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất .......................... 25
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM ...................................................................... 27
3.1. Phân lập các hợp chất ........................................................................ 27
3.2. Hằng số vật lí và dữ liệu phổ các chất ............................................... 29
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 30
4.1 Xác định cấu trúc hợp chất 1 .............................................................. 30
4.2. Xác định cấu trúc hợp chất 2 ............................................................. 36
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 44


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
13

C-NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13
Carbon - 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H-NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H-1H COSY 1H - 1H Chemical Shif Correlation Spectroscopy

2D-NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều Tow - Dimensional NMR

CC

Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT

Distortionless Ebhancement by Polarisation Transfer

ESI-MS

Phổ khối lƣợng phun điện tử.
Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy

FAB – MS

Phổ khối lƣợng bắn phá nguyên tử nhanh
Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy

FI-MS

Phổ khối lƣợng ion hóa thƣờng Field Ionization

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Connectivity

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence

HR-FAB-MS Phổ khối lƣợng phân giải cao bắn phá nguyên tử nhanh
High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy
IR

Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

MS

Phổ khối lƣợng Mass Spectroscopy

NOESY

Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

TLC

Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography


DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH
BẢNG
Bảng 4.1: Số liệu phổ của hợp chất MQ30 và chất tham khảo ...................... 35
Bảng 4.2: Số liệu phổ của hợp chất MQ4 và chất tham khảo ........................ 42

HÌNH
Hình 1.1: Hình ảnh cây, hoa Mỏ quạ ................................................................ 4
Hình 3.1: Sơ đồ phân lập phân đoạn nƣớc cây Mỏ quạ .................................. 28
Hình 4.1.1: Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất 1 .... 30
Hình 4.1.2: Phổ proton 1H của hợp chất 1 ...................................................... 31
Hình 4.1.3: Phổ cacbon 13C của hợp chất 1 .................................................... 31

Hình 4.1.4: Phổ HMBC của hợp chất 1 .......................................................... 32
Hình 4.1.5: Phổ HMBC của hợp chất 1 (tiếp) ................................................ 33
Hình 4.1.6: Phổ HSQC của hợp chất 1 ........................................................... 34
Hình 4.2.1: Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất 2 .... 36
Hình 4.2.2: Phổ proton 1H của hợp chất 2 ...................................................... 37
Hình 4.2.3: Phổ cacbon 13C của hợp chất 2 .................................................... 37
Hình 4.2.4: Phổ cacbon DEPT của hợp chất 2................................................ 38
Hình 4.2.5: Phổ HMBC của hợp chất 2 .......................................................... 39
Hình 4.2.6: Phổ HMBC của hợp chất 2 (tiếp) ................................................ 40
Hình 4.2.7: Phổ HSQC của hợp chất 2 ........................................................... 40
Hình 4.2.8: Phổ HSQC của hợp chất 2 (tiếp).................................................. 41


MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển của xã hội hiện nay thì con ngƣời cũng đang
phải đối đầu với nguy cơ mắc các căn bệnh hiểm nghèo. Nguyên nhân đó là
do ô nhiễm bầu không khí, ô nhiễm nguồn nƣớc... Từ đó đòi hỏi việc nghiên
cứu tìm ra các loại thuốc có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên cho hiệu
quả cao, ít tác dụng phụ, ít độc tính lại dễ tìm nguồn nguyên liệu để ứng dụng
trong y học, nông nghiệp và các mục đích khác phục vụ lợi ích của con ngƣời
đã và đang là vấn đề đƣợc các nhà khoa học hết sức quan tâm. Hiện nay có
khoảng 60-70% các loại thuốc chữa bệnh đang đƣợc lƣu hành hoặc đang
trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên
nhiên [14].
Nƣớc ta nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa có khí hậu nóng ẩm,
lƣợng mƣa hàng năm lớn nên có rất nhiều điều kiện thuận lợi cho thảm thực
vật phát triển. Nƣớc ta là một nƣớc có nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng
phong phú và đa dạng. Theo ƣớc tính Việt Nam có khoảng 12000 loài thực
vật, trong đó có rất nhiều loại thảo dƣợc quý hiếm [17]. Từ xa xƣa nhân dân
ta đã biết dùng các loại thảo dƣợc để chữa bệnh và cho đến tận bây giờ vẫn

còn nhiều bài thuốc quý đƣợc lƣu truyền. Những bài thuốc cổ truyền này đã
đóng vai trò vô cùng quan trọng với sự phát triển của ngành y học nói chung
và ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
Trong thế giới thực vật, cây Mỏ quạ (tên khoa học là Cudrania
tricuspidata) là một loài cây đƣợc sử dụng nhƣ một dƣợc liệu quý. Theo kinh
nghiệm dân gian, Mỏ quạ thƣờng đƣợc dùng chữa vết thƣơng phần mềm, bổ
thận, lƣơng huyết, hoạt huyết, phá ứ, chữa ứ tích lâu năm, bế kinh, đau lƣng
gối do phong thấp, làm thuốc khƣ phong...[18]. Ngoài ra, trong cây còn chứa
các thành phần hóa học có hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ thần kinh, chống

1


béo phì, kháng viêm hay kháng insulin ở gan. Do vậy, nó nhƣ một loài cây
thuốc quý, cần đƣợc nghiên cứu để giải thích tác dụng chữa bệnh của cây và
tạo cơ sở để tìm kiếm phƣơng thuốc điều trị bệnh.
Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên tôi chọn đề tài cho khóa luận tốt
nghiệp là:
“Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học phân đoạn nƣớc cây Mỏ quạ
(Cudrania tricuspidata)”
Nhiệm vụ chính của đề tài là:
1. Thu mẫu lá cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata), xử lý mẫu và tạo
dịch chiết.
2. Phân lập các hợp chất trong phân đoạn nƣớc từ cây Mỏ quạ.
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập đƣợc.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Nghiên cứu tổng quan về cây Mỏ quạ
1.1.1. Thực vật học
Cây Mỏ quạ đƣợc phân loại thực vật học theo cách xác định nhƣ sau:
Giới

: Plantae
Angiospermae
Eudicots
Rosids

Bộ

: Rosales

Họ

: Moraceae

Tông

: Moreae

Chi

: Cudrania

Loài

: C. Tricuspidata

1.1.2. Mô tả cây [1], [18], [19]
Cây Mỏ quạ hay còn đƣợc gọi với các tên khác nhƣ: hoàng lồ, vàng lồ,
xuyên phá thạch, sọng vàng, gai mang, mỏ quạ ba mũi... Nó có tên khoa học
là Cudrania tricuspidata (Carr.) Bur, thuộc họ Dâu tằm – Moraceae. Mỏ quạ
là loài cây nhỏ, thân mềm yếu, nhiều cành, tạo thành bụi, có khi mọc thành
cây nhỡ, chịu khô hạn rất khỏe, có nhựa mủ trắng, rễ cây hình trụ có nhiều
nhánh, mọc ngang rất dài, nếu gặp đá có thể xuyên qua đƣợc (do đó có tên
xuyên phá thạch có nghĩa là phá chui qua đá). Vỏ thân màu tro nâu, trên có
nhiều biểu bì khổng màu trắng, thân và cành có rất nhiều gai, gai già hơi cong
xuống trông nhƣ mỏ con quạ (do đó có tên là cây mỏ quạ). Lá mọc cách, hình
trứng thuôn, hai đầu nhọn, mặt lá nhẵn, bóng, mép nguyên, có phiến xoan, dài
5-14cm, rộng 3-4,5cm, đầu có mũi dài, gốc tù, gân bên 6-7 đôi, cuống dài 1013mm. Hoa đầu ở nách lá, từng cặp, hoa đực có 4 lá đài, 4 nhị, hoa cái có 4 lá

3


đài. Cụm hoa hình cầu, đƣờng kính 7-10mm, màu vàng nhạt, mọc thành đôi
hay mọc đơn độc ở kẽ lá. Hoa đơn tính, đực cái khác gốc. Cây ra hoa vào
tháng 4-5, có quả vào tháng 5-7. Mùa hoa đơn tại Hà Nội vào tháng 4. Quả
màu hồng hợp thành quả kép. Mùa quả tháng 10-11.

Hình 1.1: Hình ảnh cây, hoa Mỏ quạ
1.1.3. Phân bố và sinh thái
Chi Cudrania có khoảng 10 loài ở vùng nhiệt đới châu Á và Australia.
Ở Việt Nam, dự đoán có 5 loài. Mỏ quạ là loài quen thuộc, phân bố tƣơng đối
phổ biến ở các tỉnh vùng núi thấp (dƣới 1000m), trung du và đồng bằng nhƣ
Phú Thọ (Chân Mộng), Phú Quốc... Trên thế giới, cây phân bố ở Hàn Quốc
(chủ yếu là ở phía Nam), Trung Quốc, Nhật Bản, Australia...[18], [20].
Mỏ quạ thuộc loại cây bụi gai, ƣa sáng, có khả năng chịu hạn. Cây mọc

rải rác trong các tráng cây bụi ở đồi, đất sau nƣơng rẫy và ven rừng. Ở vùng
đồng bằng, cây thƣờng gặp trong các lùm bụi quanh làng, ra hoa quả nhiều hàng
năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt, tái sinh cây chồi khỏe sau khi bị chặt [3].
1.1.4. Bộ phận dùng
Lá, rễ - Radix et Folium. Rễ và lá thu hái quanh năm. Lá dùng tƣơi, rễ
phơi khô.

4


1.1.5. Tính vị và công dụng
- Tính vị:
Lá cây Mỏ quạ khi nhấm có vị tê tê ở lƣỡi. Cây có vị đắng và tính mát.
- Công dụng:
Mỏ quạ có nhiều tác dụng dƣợc lý đa dạng: chống dị ứng ở mức độ
nhất định, trị đau nhức, tăng cƣờng thực bào, làm lành nhanh vết thƣơng phần
mềm, trị phong thấp, một số chứng ho...
Lá mỏ quạ tƣơi đã đƣợc dùng chữa vết thƣơng phần mềm theo kinh
nghiệm của cụ lang Long (Hải Dƣơng) nhƣ sau: Chủ yếu dùng lá mỏ quạ
tƣơi, rồi tùy theo vết thƣơng, thêm một hai vị khác. Lá mỏ quạ tƣơi lấy về rửa
sạch, bỏ cọng, giã nhỏ đắp vào vết thƣơng. Nếu vết thƣơng xuyên thủng thì
phải đắp cả hai bên, băng lại. Mỗi ngày rửa và thay băng một lần. Thuốc rửa
vết thƣơng là lá trầu không nấu với nƣớc (40g lá trầu, 2 lít nƣớc, nấu sôi để
nguội, thêm vào đó 8g phèn phi, hòa tan, lọc và dùng rửa vết thƣơng). Sau 3-5
ngày đã đỡ, khi đó hai ngày mới cần rửa và thay băng một lần. Trƣờng hợp
vết thƣơng tiến triển tốt nhƣng lâu đầy thịt thì thay thuốc sau: Lá mỏ quạ tƣơi
và lá thòng bong, hai vị bằng nhau, giã lẫn cả hai thứ đắp lên vết thƣơng, mỗi
ngày rửa và thay băng một lần. 3-4 ngày sau lại thay thuốc sau: lá mỏ quạ
tƣơi, lá thòng bong, lá hàn the (Desmodium heterophyllum DC.) ba thứ bằng
nhau, cứ 3 ngày mới thay băng một lần để vết thƣơng chóng lên da non. Sau

2-3 lần thay băng bằng 3 vị trên thì rắc lên vết thƣơng thuốc bột chế bằng
phấn cây cau (sao khô) 20g, phấn cây chè (sao khô) 16g, ô long vĩ (bồ hóng)
8g, phèn phi 4g. Các vị tán mịn, trộn đều rắc lên vết thƣơng rồi để yên cho vết
thƣơng đóng vẩy và róc thì thôi. Rễ đƣợc dùng trong nhân dân ta và ở Trung
Quốc (Quảng Tây) làm thuốc khứ phong, hoạt huyết phá ứ, chữa ứ tích lâu
năm, bị đả thƣơng, phụ nữ kinh bế, phong nhức lƣng gối, xƣơng khớp, hoàng
đản,ung sang thũng độc. Ngày dùng 10-30g rễ dƣới dạng thuốc sắc. Dùng

5


phối hợp với những vị thuốc khác. Theo kinh nghiệm nhân dân, phụ nữ có
thai không dùng đƣợc [19].
Trong thời gian gần đây, dựa vào các bài thuốc từ thiên nhiên. Các nhà
khoa học đã tìm đƣợc chất flavonoid có trong rễ của cây Mỏ quạ có tác dụng
tốt trong việc kháng viêm, giảm đau đặc biệt đối với những bệnh về xƣơng
khớp giúp tái tạo, bảo vệ các tế bào sụn khớp bị tổn thƣờng do gout gây ra.
Quả dùng để ăn hoặc có thể nấu rƣợu.
Bài thuốc dùng để hỗ trợ điều trị bênh về xƣơng khớp, Gout.
Lá Mỏ quạ tƣơi, lấy về rửa sạch rồi bỏ cuống, giã nhỏ rồi đắp vào vết
thƣơng. Dùng hàng ngày [20].
Bài thuốc cây mỏ quạ thƣờng dùng
- Hỗ trợ điều trị ho do lao phổi: rễ mỏ quạ gai 40g, rung rúc 30g, bách
bộ, hoàng liên ô rô, mỗi vị 20g. Tất cả rửa sạch cho vào ấm đổ 700ml nƣớc,
sắc còn 350ml, chia 3 lần uống trong ngày, uống lúc còn ấm. 15 ngày 1 liệu
trình.
- Hỗ trợ điều trị phong thấp: mỏ quạ gai 40g, cành dâu, quế chi, thiên
niên kiện mỗi vị 20g. Cho tất cả các vị vào ấm đổ 550ml nƣớc sắc nhỏ lửa
còn 250ml chia 2 lần uống trong ngày. 10 ngày một liệu trình.
- Phụ nữ bế kinh: lấy 30g rễ mỏ quạ gai rửa sạch, đổ 500ml nƣớc sắc còn

200ml, chia 2 lần uống trong ngày, dùng liền 10 ngày trƣớc chu kỳ kinh [21].
1.1.6. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Mỏ quạ cho thấy, thành
phần hóa học chủ yếu của cây là flavonoid ngoài ra còn có tanin pyrocatechic,
acid hữu cơ và một số hợp chất khác.
Yang Hee Jo cùng các cộng sự đã cô lập đƣợc 30 hợp chất trong đó có
2 hợp chất isoflavonoids mới là hợp chất cudracusisoflavone A và
cudracusisoflavone B. Ngoài ra, hai mƣơi bảy hợp chất đã biết đó là

6


genistein, orobol, 7,4’-dimethoxy-5-hydroxyisoflavone, genistin, oroboside,
3’-O-methylorobol-7-glucoside, sphaerobioside, wighteone, gancaonin A,
4’,5,7-trihydroxy isoflavonone, 5,7,3’,4’ tetrahydroxy-6-8-diprenylisoflavone,
alpinumisoflavone, 4’-O-methylalpinumisoflavone, 5,3’,4’-trihydroxy-6’’,6’’dimethylpyrano-[2’’,3’’;7,6]isoflavone, scandenone, derrone, derrone-4’-Omethylether, isochandalone, ulexin B, ulexone B, (+)-dihydrokaempferol, (+)taxifolin, (2R, 3R)-7-(β-glucopyranosyloxy)-2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-2-(4hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one,
nicotiflorin, và rutin [15].

7

astragalin,

hirsutrin,

populnin,


Jaeyoung Kwon và các cộng sự đã phân lập từ vỏ rễ của cây Mỏ quạ
thu đƣợc 75 hợp chất, bao gồm 21 hợp chất mới có công thức hóa học nhƣ
sau:

31

34 R = CH3

33

32

37

36
35 R = H

38

44

50

39

40

45

41

46

47

43

42

48

49

51

Hợp chất (31) và (32) có cùng công thức phân tử là C23H24O7, hợp chất
(33) có công thức phân tử C23H24O8. Tên gọi của các hợp chất từ 34-42 là:
(34) 16-methoxycudra-trixanthone M, (35) 16-hydroxycudratrixanthone M,
(36)

(cudratrixanthone

R),

(37)

(cudratrixanthone

S),

(38)

7-O-

demethylcudratrixanthone C, (39) cudratrixanthone T, (40) cudratrixanthone
U, (41) cudratrixanthone V và (42) cudratrixanthone W. (43) có công thức
phân tử là C25H26O7. (44) và (45) có tên gọi tƣơng ứng là (2R)- và (2S) cudraflavanones H. Công thức phân tử của hợp chất (46) là C25H22O7, phân
tích dữ liệu phổ NMR thấy có sự giống nhau giữa cấu trúc của (46) và
cudraflavone B, 46 và cudracuspiphenone A cũng có cấu trúc gần tƣơng tự
nhau sự khác biệt duy nhất là một nhóm prenyl đƣợc thay thế bằng nhóm 2-

8


hydroxy-3-methylbut-3-enyl. Các hợp chất từ 47-51 có tên gọi lần lƣợt là (47)
cudraphenone E, (48) cudrachromone A, (49) cudraphenol A, (50)
cudraphenol B, (51) cudraphenol C. Thêm vào đó, 54 chất báo cáo trƣớc đây
đƣợc xác định là dicycloeuchrestaflavanone B, cudraflavone A, 5,7dihydroxychromone, isoimperatorin, xanthyletin, 4-hydroxybenzaldehyde,
glutinol, achilleol A, axit oleic, demethylsuberosin, 5-dehydroxybavachinone
A,

imperatorin,

(methoxymethyl)

isoencecalin,
phenol,

deprenylrheediax-anthone

2,4-dihydroxymethyl-benzoat,

α-amyrin,

B,

gentisein,

toxyloxanthon

4'-O-demethylcrotaramin,

4-

B,

2-

brosimine

B,

pinocembrin, euchrestaflavanone C, 4'-hydroxyisoloncho- carpin, naringenin,
6-prenylnaringenin,

tomentosanol

D,

dalenin,

parvisoflavone

A,

alpinumisoflavone, 8-hydroxygenistein, laburnetin, biochanin A, erythrinin B,
C, và G, cudracuspiphenone A, eriosematin A, decursinol angelate, cis-3',4'diisovalerylkhellactone, 7-hydroxycoumar-in, 8-methoxypsoralen, bergapten,
hyuganin C, 4- hydroxy-3- (4-hydroxybenzyl) benzyl methyl ete, 2,4-bis (4hydroxybenzyl)

phenol,

methoxycarbonylindole,

4-hydroxymethylbenzoat,
4-hydroxybenzalaceton,

vanil-lin,
lanosterol,

3γ-

hexadecanolactone, axit hexadecanoic và 9,12-octadecadienoic [10].
Theo Dong-Cheol Kim và các cộng sự khác thì các cấu trúc của
cudraflavanone

D,

cudraflavanone

B,

euchrestaflavanone

C,

(+)-

dihydrokaempferol, steppogenin, cudraflavone C và kuwanon C đã đƣợc xác
định trong các nghiên cứu trƣớc đó [8].
Bằng một số phƣơng pháp sắc kí và tách phân đoạn trong CH2Cl2 và
EtOAc từ rễ của cây mỏ quạ Yang Hee Jo cùng các cộng sự đã cô lập đƣợc
31 hợp chất xanthones trong đó có 3 prenylated xanthones mới có công thức
hóa học nhƣ sau:

9


52 R1 = H, R2 =OH R3 = H
53 R1 = OH, R2 = OCH3 R3 = H
54 R1 = OH, R2 = OCH3 R3 = OH
55 R1 = OH, R2 =OCH3 R3 = OCH3

62 R = OH
63 R = OCH3

56 R = OH
57 R = OCH3

58
59

64

69

76 R1 = H, R2 = OH
77 R1 = OH, R2 = H

80

81

79

68

73

72

71

75

74

66 R = OH
67 R = OCH3

65

70

60 R1 = OH, R2 = H

61 R1 = H, R2 = OH

78

82

Hợp chất (67) (80) (82) thu đƣợc có tên gọi lần lƣợt

là

cudracuspixanthone E, cudracuspixanthone F và cudracuspixanthone G. Đó là
ba hợp chất mới ngoài ra còn 28 hợp chất đã biết là: 2,6- dihydroxyxanthone
(52),

isogentisin

(53),

alloathyriol

(54),

laxanthone-I

(55),

isocudraniaxanthone A (56), isocudraniaxanthone B (56), 1,3,5-trihydroxy-4prenyl- xanthone (58), cudraxanthone H (59), cudratricusxan- thone K (60),

10

dulxanthone B (61), macluraxanthone B (62), cudracuspixanthone A (63),
cudratricus-xanthone A (64), gerontoxanthone I (65), maclura- xanthone C
(66), alvaxanthone (68), isoalvaxanthone (69), cudraxanthone L (70),
toxyloxanthone C (71), 2-deprenylrheediaxanthone B (72), 8-prenylxanthone
(73), cudraxanthone M (74), cudratrixanthone H (75), cudracuspixanthone B
(76), cudracuspi- xanthone C (77), cudraxanthone B (78), cudracuspixanthone D (79) và cudraxanthone A (81) [16].
1.1.7. Hoạt tính sinh học
Trong cây Mỏ quạ chứa rất nhiều hợp chất flavonoid, những lớp chất
này có rất nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm. Flavonoid là những chất
oxy hóa chậm, ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do gây ra do vậy
các hợp chất flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa là những chất có hoạt tính
chống oxy hóa cao, nó tác dụng đến nhiều hệ enzym và ít độc với cơ thể sống.
Khi đi vào cơ thể sống, flavonoid có thể tác động lên các biến đổi sinh hóa
học một cách trực tiếp hay gián tiếp nhƣ thông qua hoạt động của các enzym
hay hệ thống thần kinh, nội tiết... Các kết quả thực nghiệm cho chúng ta thấy
một số flavonoid có tác dụng chống ung thƣ thông qua khả năng hoạt hóa các
enzym trong gan có nhiệm vụ chuyển hóa các chất gây ung thƣ.
Một nghiên cứu trƣớc đây cho thấy quả của cây mỏ quạ có thể ức chế
sự hoạt động của lipase tụy, một enzym quan trọng trong việc hấp thụ chất
béo. Quả non có hàm lƣợng phenol và flavonoid cao hơn và có sự ức chế
lipase tụy mạnh hơn so với quả chín. Phân tích HPLC cho thấy thành phần
hoá học khác nhau giữa quả xanh và chín. Phân đoạn tiếp tục dẫn đến sự cô
lập của 30 hợp chất bao gồm hai isoflavonoid mới. Phân tích các thành phần
hóa học của quả chín và chín chƣa cho thấy một vòng 2,2-dimetylpyran, một
prenyl xen kẽ, là chuỗi bên cạnh chi phối trong các quả chƣa chín, trong khi
đó là một nhóm prenyl tuyến tính trong quả chín. Ngoài ra, một isoflavonoid

11

mới từ quả chƣa chín cho thấy sự ức chế mạnh nhất trên lipase tụy. Kết hợp
với nhau, giai đoạn chín là một yếu tố quan trọng để đạt đƣợc hiệu quả tối đa
và trái chƣa chín của C. tricuspidata là một nguồn tốt về các thành phần hoạt
tính sinh học mới để điều chỉnh chứng béo phì [10].
Hoạt tính kháng viêm, một số nghiên cứu về tác dụng của anthocyanin,
leucoanthocyanin và axit phenolic lên vi khuẩn Salmonella cho thấy có tác
dụng kìm hãm rõ rệt. Hầu hết các chất này có khả năng kìm hãm sự hô hấp hay
phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucoza. Pilar và các cộng sự đã nghiên cứu
và thấy đƣợc rằng: hầu hết các polyphenol đều có khả năng chống khuẩn.
Trong các nghiên cứu gần đây cho thấy chiết xuất từ C.tricuspidata có
nhiều hoạt tính sinh học nhƣ bảo vệ gan, chống oxi hóa.
1.2. Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật [7], [9], [11]
1.2.1 Chọn dung môi chiết
Tùy thuộc vào đối tƣợng chất có trong các mẫu mà ta chọn dung môi và
hệ dung môi khác nhau. Các dung môi dùng cho quá trình chiết phải đƣợc lựa
chọn một cách cẩn thận.
Yêu cầu với dung môi dùng trong quá trình chiết
Nó phải hòa tan đƣợc những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu,
có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, khó bốc cháy.
Trƣớc khi đƣợc sử dụng làm dung môi chiết những dung môi này nên đƣợc
chƣng cất để loại bỏ tạp chất ta sẽ thu đƣợc dạng sạch trƣớc khi sử dụng nếu
chúng có lẫn các chất có thể gây ảnh hƣởng tới chất lƣợng của quá trình chiết.
Có một số chất dẻo thƣờng lẫn trong dung môi nhƣ điankyl phtalat, tri-nbutyl-axetylcitrat và tributylphotphat (bị lẫn trong quá trình sản xuất dung
môi hoặc khâu bảo quản dung môi do các dung môi thƣờng đƣợc đựng trong
các thùng chứa bằng nhựa hoặc các nút nhựa).

12

Một số dung môi thường được sử dụng:
Ngƣời ta hay sử dụng clorofom, metylen và metanol là những dung môi
trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây nhƣ lá, thân, dễ, củ, quả, hoa.
Tuy nhiên, metanol và clorofom thƣờng chứa điotylphtalat [đi-(2-etylhexyl)
phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat], nó sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong
quá trình nghiên cứu hóa thực vật. Ngoài ra chất này còn thể hiện hoạt tính
trong quá trình thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây.
Những tạp chất thƣờng lẫn trong clorofom nhƣ CH2Cl2, CH2ClBr có
thể phản ứng với một số hợp chất nhƣ các ankanoit tạo muối bậc 4. Tƣơng tự
nhƣ vậy sự có mặt của HCl có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nƣớc hay sự
đồng phân hóa các hợp chất khác. Do clorofom có thể gây tổn thƣơng cho gan
và thận nên khi sử dụng nó các thao tác phải cẩn thận khéo léo làm ở những
nơi thông thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và
dễ bay hơi hơn clorofom.
Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn clorofom. Do
khả năng phân cực của clorofom thấp hơn nên nó có thể rửa giải các chất nằm
ngoài tế bào. Trái lại các dung môi thuộc nhóm rƣợu phân cực hơn nên sẽ
thấm tốt hơn qua màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
đƣợc lƣợng lớn các thành phần trong tế bào. Phần lớn các ancol là các chất
chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp do
vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hòa tan đồng thời. Thông
thƣờng dung môi cồn trong nƣớc có thể đƣợc xem là dung môi có những đặc
tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên khi dùng metanol trong suốt quá trình chiết cũng có một vài
sản phẩm mới đƣợc tạo thành. Ví dụ nhƣ trechlonolide A thu đƣợc từ
Trechonaetes laciniata đƣợc chuyển hóa thành trechonolode B bằng quá trình
metyl hóa khi đun nóng với metanol chứa một ít axit và quá trình phân hủy

13

1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi Erythroxylum novogranatense đƣợc
chiết trong metanol nóng.
Ngƣời ta thƣờng ít sử dụng nƣớc để thu dung dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nƣớc của metanol.
Đietyl ete là chất rất dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc đồng thời nó có xu
hƣớng tạo ra peroxit dễ nổ, peroxit của đietyl ete dễ gây ra phản ứng oxi hóa
với những hợp chất không có khả năng tạo cholesterol nhƣ các carotenoid. Do
vậy mà rất hiếm khi đietyl ete đƣợc sử dụng cho các quá trình chiết thực vật.
Ngoài ra axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong
môi trƣờng axit. Quá trình chiết dƣới điều kiện axit hoặc bazơ thƣờng đƣợc sử
dụng đối với các quá trình phân tách đặc trƣng, cũng có khi xử lý các dịch
chiết bằng axit-bazơ có thể tạo ra các sản phẩm mong muốn.
Trong cây thƣờng các chất chuyển hóa thứ cấp sẽ có độ phân cực khác
nhau. Khi biết và hiểu đƣợc những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ
cấp trong cây đƣợc chiết sẽ rất quan trọng để từ đó có thể lựa chọn dung môi
thích hợp cho quá trình chiết tránh đƣợc sự phân hủy chất bởi dung môi và
quá trình tạo thành chất mong muốn.
Sau khi chiết dung môi đƣợc cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không
quá 300C – 400C, với một vài hóa chất có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
1.2.2. Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản đƣợc phân loại nhƣ sau:
- Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
- Chiết sắc với dung môi nƣớc
- Chiết lôi cuốn theo hơi nƣớc.
Một trong những phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong quá
trình chiết thực vật là chiết ngâm bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời

14

gian. Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh có khóa ở dƣới đáy để tạo tốc độ
chảy cho quá trình tách rửa dung môi, dung môi nóng hoặc lạnh. Trƣớc kia,
máy chiết ngâm thƣờng đƣợc làm bằng kim loại nhƣng hiện nay có thể dùng
bình thủy tinh.
Mẫu thực vật đƣợc ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ
và sau đó chất chiết đƣợc lấy ra. Lƣu ý rằng sau một quá trình chiết 3 lần
dung môi, cặn thu đƣợc không còn chứa những chất giá trị nữa. Có thể xác
định sự kết thúc quá trình chiết bằng một số cách nhƣ: khi chiết các ankaloit
ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của nhiều hợp chất này ra khỏi bình chiết bằng
sự tạo thành kết tủa với các tác nhân đặc trƣng nhƣ Dragendorff và Mayer.
Hay các flavoloid thƣờng là những chất màu bởi vậy khi dịch chảy ra mà
không có màu sẽ đánh dấu là đã rửa hết những chất này trong quá trình chiết.
Hoặc khi chiết các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự
xuất hiện của cặn tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết. Trong
trƣờng hợp các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng
Kedde có thể đƣợc sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho
phản ứng với anilin axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và
từ đó có thể biết đƣợc khi nào quá trình chiết kết thúc.
Nhƣ vậy tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi chiết thích hợp và lựa chọn phƣơng pháp chiết hợp lí để đạt kết quả cao
trong quá trình nghiên cứu. Ngoài ra có thể dựa vào mối quan hệ của dung
môi và chất tan của các hợp chất mà ta có thể thu đƣợc một số hợp chất ngay
trong quá trình chiết.
1.3. Tổng quan về phƣơng pháp sắc kí [2], [7]
Phƣơng pháp sắc kí (chromatography) là một trong những phƣơng pháp
phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, đƣợc sử dụng trong việc phân lập các hợp
chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.

15


Nguyên tắc của phƣơng pháp này là dựa vào sự khác nhau về ái lực
giữa các chất cần tách với chất hấp thụ. Độ phân cực của dung môi tăng dần
từ ete dầu hỏa đến nƣớc.
Sắc kí bao gồm pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tƣơng ứng với các tính
chất của chúng (tính bị hấp thụ, tính tan...). Trong quá trình pha động chuyển
động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, quá trình
hấp phụ và phản hấp phụ sẽ lặp đi lặp lại. Kết quả là chất có ái lực lớn với pha
tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với chất tƣơng tác yếu
hơn với pha này. Dựa vào đặc điểm này mà ngƣời ta có thể tách các chất qua
quá trình sắc kí. Trên thế giới hiện nay chủ yếu sử dụng pha tĩnh là chất rắn
(bao gồm các loại chất hấp phụ nhƣ silicagel, YMC, ODS, Al2O3 ...) còn pha
động đƣợc sử dụng là các chất lỏng (sắc kí lỏng), hay chất khí (sắc kí khí).
Pha động đƣợc dùng trong sắc kí lỏng là các dung môi hữu cơ, trên nguyên
tắc là chất phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi phân cực hơn và ngƣợc lại
chất ít phân cực sẽ tan tốt hơn trong dung môi kém phân cực hơn.
Phân loại các phương pháp sắc kí
Tùy thuộc vào trạng thái tập hợp của pha động, ngƣời ta chia sắc kí
thành 2 loại chính:
- Sắc kí khí.
- Sắc kí lỏng.
Còn dựa vào cách tiến hành sắc kí ngƣời ta chia ra thành các phƣơng
pháp sắc kí chủ yếu sau:
Sắc kí cột (CC)
Đây là phƣơng pháp sắc kí phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh bao
gồm các loại silicagel (có độ hạt khác nhau) pha thƣờng cũng nhƣ pha đảo
YMC, ODS, Dianion... Chất hấp phụ đƣợc nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy

16


tinh hay kim loại nhƣng phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp
phụ hết sức quan trọng nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của
chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn
do đó khả năng tách càng cao và ngƣợc lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có độ
hạt càng nhỏ thì tốc độ dòng chảy càng giảm. Trong một số trƣờng hợp lực
trọng trƣờng không đủ lớn sẽ gây ra hiện tƣợng tắc cột (dung môi không chảy
đƣợc) khi đó ngƣời ta phải sử dụng áp suất với áp suất trung bình (MPC) hoặc
áp suất cao (HPLC).
Trong sắc kí cột, tỉ lệ chiều cao cột (L) so với đƣờng kính cột (D) rất
quan trọng, tỉ lệ này còn thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc
vào yêu cầu tách nghĩa là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc kí tỉ
lệ giữa quãng đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi của dung môi
đƣợc gọi là Rf, các chất khác nhau sẽ có Rf khác nhau. Dựa vào sự khác nhau
về Rf mà ngƣời ta tách đƣợc từng chất ra khỏi hỗn hợp chất. Ngoài ra tỉ lệ
chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu
tách. Chẳng hạn nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5-1/10), còn nếu tách tinh
thì tỉ lệ này cao hơn và tùy vào hệ số tách (tức là phụ thuộc vào sự khác nhau
Rf của các chất) hệ số này dao động trong khoảng 1/20 – 1/30.
Việc đƣa chất lên cột hết sực quan trọng trong sắc kí cột tùy thuộc vào
lƣợng chất và dạng chất mà ngƣời ta có thể đƣa chất lên cột bằng các phƣơng
pháp khác nhau. Nếu lƣợng chất nhiều và chạy thô thì ngƣời ta phải tẩm chất
vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn sau đó mới đƣa lên cột. Nếu tách tinh
thì ngƣời ta thƣờng đƣa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng
dung môi chạy cột với một lƣợng tối thiểu. Việc nhồi cột (bằng chất hấp phụ)
cũng hết sức quan trọng.
Có hai phƣơng pháp đƣa chất hấp phụ lên cột:

17


1. Phƣơng pháp nhồi cột khô:
Chất hấp phụ đƣợc đƣa trực tiếp vào cột (cột đã rửa sạch bằng hỗn hợp
sunfocromic, sấy khô và lót bông thủy tinh ở dƣới) sau đó dùng đũa thủy tinh
có bọc cao su gõ nhẹ lên thành cột đến khi chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột
không nén xuống đƣợc nữa. Tiếp đến dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến
khi cột trong suốt.
2. Phƣơng pháp nhồi cột ƣớt:
Cho chất hấp phụ vào dung môi (thƣờng dùng là dung môi rửa cột sau
này) trộn thành bột nhão sau đó đổ vào cột đến khi đủ lƣợng cần thiết.
Phƣơng pháp này có ƣu điểm là dễ đồng đều trên cột, không hay bị nứt cột
khi chạy. Lƣu ý khi chuẩn bị cột phải không có bọt khí trong cột (nếu có bọt
khí sẽ gây nên hiện tƣợng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và dung môi
phải khô, cột không đƣợc nứt, gãy, dò, thời gian để cột ổn định phải mất 1012 giờ mới dùng đƣợc.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hƣởng đến kết quả tách. Nếu tốc
độ chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ chảy quá nhỏ sẽ
kéo dài thời gian tách ảnh hƣởng đến tiến độ công việc.
Ngày nay để chạy nhanh, tách nhanh các chất ngƣời ta dùng phƣơng
pháp sắc kí cột nhanh có hệ thống bơm đẩy trộn dung môi tự động, lấy mẫu tự
động dựa vào phổ tử ngoại. Thời gian để tách rất nhanh, chính xác.
Sắc kí bản mỏng (TLC)
Phƣơng pháp dùng chất hấp phụ tráng thành lớp trên kính để phân tích
hay tinh chế các chất gọi là sắc kí bản mỏng. Sắc kí bản mỏng đƣợc dùng để
phân tích định tính, định lƣợng và tinh chế các chất hay cũng có thể dùng để
theo dõi quá trình chạy cột sắc kí. Chất hấp phụ thƣờng là silicagel.
Việc sử dụng sắc kí bản mỏng điều chế (bản đƣợc tráng sẵn silicagel
dày hơn) có thể đƣa lƣợng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc kí có

18