PCR (polymerase chain reaction)

PCR
(Polymerase Chain Reaction)


NỘI DUNG
GIỚI THIỆU VỀ PCR
NGUYÊN TẮC CỦA PHẢN ỨNG PCR
TIẾN HÀNH PHẢN ỨNG PCR
ỨNG DỤNG PƯ PCR TRONG CHẨN ĐOÁN
BỆNH NHIỄM VSV


GIỚI THIỆU VỀ PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng hợp
dây chuyền nhờ polymerase) do Kary Mullis & cs phát
minh năm 1985


Chỉ 8 năm sau
1993: Nobel
hóa học


PP khuếch đại in vitro để tạo ra nhiều bản sao của
1 đoạn DNA đích
 Mô phỏng bộ máy sinh TH DNA của TB sống.
 là công cụ mạnh để , nghiên cứu Y- Sinh
học, đặc biệt trong  các tác nhân VSV gây bệnh


Trình tự đích

Chuỗi DNA
Chuỗi DNA
siêu cuốn

Nhiễm sắc thể

Chuỗi DNA
xoắn đôi


NGUYÊN TẮC CỦA PƯ PCR
 PCR dựa trên qt sao chép DNA trong tb


Cấu trúc DNA
(C-G, A-T)

Cầu Hydro

Cytosine (C)
Adenine (A)

Guanine (G)

Thymine (T)

Thymine (T)

Guanine (G)

Adenine (A)
Cytosine (C)

Deoxyribose
(phân tử đường)

Phosphoric Acid
(phân tử phosphate)



Chuoãi xoaén keùp DNA


5’ đầu tận

Hướng 5’ đến 3’ của
khung Đường- Phosphate

3’ đầu tận



Quy trình PCR: 20-40 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước:
•

Biến tính DNA:

94-96oC/1-2’  tách mạch đôi DNA

•

Bắt cặp mồi:

45-60oC/1-2’  khởi đầu khuếch đại gen

•

Kéo dài:

- t0  DNA polymerase,
- t  độ dài DNA mẫu (30’’  vài phút)

Z = m x 2n

Z: số bản sao đạt được
m: số DNA mẫu ban đầu
n: số chu kỳ khuếch đại


Chu kyø PCR
Böôùc 1 - Biến tính do t0

Trình töï ñích

Trình töï ñích


Chu kỳ PCR - Bước 2

Bắt cặp mồi đến đầu tận của trình tự đích
(theo chiều 5‘  3‘)


Chu kyø PCR - Böôùc 3
Taq DNA polymerase Keùo daøi Primer


Kết thúc chu kỳ PCR đầu tiên
 Tạo 2 copies của Trình tự đích


Khueỏch ủaùi ủớch

1 chu kyứ = 2 Amplicon

Soỏ
chu kyứ

Soỏ copies
cuỷa ủớch

2 chu kyứ = 4 Amplicon

1

2

3 chu kyứ = 8 Amplicon

2

4

4 chu kyứ = 16 Amplicon

3

8

5 chu kyứ = 32 Amplicon

4

16

5

32

6

64

20

1.048.576

30

1.073.741.824

6 chu kyứ = 64 Amplicon

7 chu kyứ = 128 Amplicon


* Các pp SHPT dựa trên PCR

• PCR (Polymerase Chain Reaction)
* RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)
* Real-time PCR
* Multiplex-PCR
* Nested PCR
• Lai phân tử (Dot-Blot)
• Giải trình tự chuỗi (Sequencing)
• RFLP


RT- PCR
(Reverse Transcription PCR)
Muùc ủớch: phaựt hieọn 1 trỡnh tửù ủớch tửứ RNA


Reverse Transcription - Bửụực 1
moi baột caởp vụựi trỡnh tửù RNA


Reverse Transcription - Böôùc 2
rTth DNA Polymerase keùo daøi Primer

Kết thúc Reverse Transcription - Bước 3
Tổng hợp DNA bổ sung (cDNA) với trình tự đích RNA


Real-Time PCR
Là 1 kỹ thuật PCR sử dụng chất huỳnh quang để
đồng thời phát hiện & đònh lượng
1 hoặc nhiều trình tự DNA đích trong phản ứng PCR