Tạo dòng phân tử và phân tích chức năng của enzyme bergaptol o methyltransferase (BMT) từ cây bạch chỉ (angelica dahurica) và ứng dụng trong sản xuất một cách có hiệu quả chất bergapten trong e coli

SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT

Nhóm 4

Xin chào thầy và các bạn!

Chiêu Hào Cam

0918040

Đàm Huỳnh Khang

0915215

Phạm Triều Nghi

0915326

L/O/G/O


Tạo dòng phân tử và phân tích chức năng của enzyme bergaptol-O-methyltransferase
(BMT) từ
cây bạch chỉ
(Angelica dahurica)
và
ứng dụng trong sản xuất một cách có hiệu quả
chất bergapten trong E. coli

(Shu-chin LO, pei-en Chung và Co-shine Wang)

L/O/G/O


Nội dung

1

Tổng quan

2

Vật liệu và phương pháp

3

Kết quả

4

Thảo luận


1. Tổng quan
•

Bạch chỉ từ lâu đã được sử dụng làm kem dưỡng trắng da, do có chứa hợp chất 8-hydroxy bergapten, là sản
phẩm hydroxylate từ chất bergapten nhờ enzyme 5-O-methyltransferase (BMT) phân cắt chất bergaptol
trong cây bạch chỉ.

•

Đoạn AdBMT chứa vùng bảo tồn I-V tương tự như OMTs (O-methyltransferase) của những loài khác.

•

Liên kết His-AdBMT được biểu hiện ở E. coli và được làm sạch bằng cách tủa trong ammonium sulfate.

•

Cách sản xuất bergapten đơn giản và hiệu quả là biểu hiện vượt mức AdBMT trong nuôi cấy vi khuẩn E. coli.
Lượng bergapten thu được cao gấp 13 lần lượng hợp chất thu từ sản phẩm làm sạch phân đoạn trong
ammonium sulfate.


Bạch chỉ (Bai Zhi)
Giới:

Plantae

Ngành:

Angiosperms

Lớp:

Eudicots

Bộ:

Apiales

Họ:

Apiaceae

Chi:

Angelica

Loài:

Angelica dahurica (Fish.) BENTH. et HOOK


•

Sự methyl hoá các hợp chất tự nhiên bằng S-adenosyl-L-methionine (SAM) phụ thuộc Omethyltransferases (OMTs) là cách chuyển đổi phổ biến trong các phản ứng tổng hợp trong tự nhiên.

•

Trong thực vật, O-methyl hoá cần thiết cho sự tổng hợp furanocoumarin mạch thẳng.

•

Các hợp chất mạch thẳng phong phú của furanocoumarin có thể kể đến là psolaren, bergapten,
xanthotoxin và isopimpinellin.


•

Bergaptol được BMT chuyển thành bergapten.

•

Bergapten hơn nữa được chuyển thành 8-hydroxybergapten có thể ức chế tyrosinase của nấm, sự sức
chế đó mạnh hơn cả kojic acid và arbutin – hai chất ức chế tyrosinase được sử dụng rộng rãi trong mỹ
phẩm trắng da. (Piao et al, 2004)


OMT

/>


2. Vật liệu và phương pháp
Vật liệu
Cây bạch chỉ Angelica dahurica (Fish.) BENTH. Et HOOK được trồng trên ruộng. Rễ được thu và đựơc bảo
o
quản lạnh ngay trong nitơ lỏng và tất cả phần vật liệu được sử dụng phải cất trữ ở -80 C.


Phương pháp

Nhân bản cDNA

•

Tổng số RNA được phân lập từ rễ 3 tháng tuổi của A. dahurica.

•

Những đoạn cDNA được tạo ra bởi phản ứng RT-PCR được khuếch đại bằng cách sử dụng một cặp
mồi thoái hóa được thiết kế từ 2 trình tự bảo tồn cao của OMTs thực vật:

-

Mồi 5’ - (5'-gtg/tgatgttggc/tggtggg/a/cactgga/t-3') nằm trong vùng bảo vệ I.

-

Mồi 3' – primer (5'-ggg/atgcatcg/t/cc/tca/gac/tg/a/cacgtga/
ggg-3') trong vùng bảo vệ II.



Biểu hiện vượt mức AdBMT và động năng chuyển hoá từ bergaptol thành
bergapten trong E. coli

•

Đoạn cDNA AdBMT mã hóa kích thước đầy đủ bao gồm một mẫu và một cặp mồi đặc hiệu cho gen:

-

AdBMT-over-f (5’- GTCGACCATATGGCAGAAATGAAAACTAG-3’) có chứa một vị trí SalI, và

-

AdBMT-over-r (5’-GCGGCCGCCTTCGAAAATTCCATAATC-3’) có chứa một vị trí NotI đã được sử dụng để

khuyếch đại PCR.

•

Mảnh AdBMT 1,077bp do đó đã được tạo dòng bằng trình tự cắt giới hạn SalI/NotI vào vector biểu hiện
pET32a.


Biểu hiện vượt mức AdBMT và động năng chuyển hoá từ bergaptol thành
bergapten trong E. coli


•

Sau khi ly tâm, phần nổi được sử dụng để trích xuất bergapten để đo bằng phương
pháp sắc ký lỏng siêu hiệu suất (UPLC).

•

Chỉ có E. coli mang gene biểu hiện vượt mức AdBMT phát triển ở nhiệt độ cảm ứng
tối ưu đã được thực hiện để phân tích động học. Thời gian ủ kéo dài từ 24 đến 48h.


Sắc ký lỏng siêu hiệu suất – UPLC
(Ultra performance liquid chromatography)
dịch nổi   dịch nổi   chấtrắn (bergaptol + bergapten) 
•Ly tâm
 
phântíchbằnghệthống UPLC

Hệ thống
WatersACQUITYTMUPLC

Figure 1: An Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) instrument.


Schematic of an HPLC or UPLC system operating in isocratic mode.
/>

Tinh chế enzyme và thử hoạt tính

••

o
Các tếbào ở 16 C  phámàng thudịchnổi  tủaammonium sulfate  protein (bãohoà 40-50%)

 

 hoà tan trongphosphate kali (pH 7,5)  khửmuối qua cột PD-10  protein phânđoạn 
côđặcbởi Centricon-30  Khảo nghiệm hoạt tính củaBMT.


pH, nhiệt độ tối ưu và
yêu cầu kim loại của AdBMT

•

Độ pH tối ưu: từ 4.0 tới 10.0 (acetate, pH 4,0-5,5; phosphate, pH 5,5-9,0;
Tris-HCl, pH 7,0 -8,5; cacbonat, pH 8,5-10,0).

•
•

o
Nhiệt độ tối ưu: từ 16-42 C.
Ảnh hưởng của các ion kim loại khác nhau: ở nồng độ 0,1-1,5 mM.


3. Kết quả

•

Tạo dòng và đặc tính của cDNA BMT từ Bạch chỉ

- Sử dụng khuyếch đại RT-PCR, một dải duy nhất của đoạn DNA 107 bp tương ứng
với trình tự AdBMT thu được.



•

Bởi vì kích thước cDNA chỉ là một phần, phương pháp 5’ – và 3’-RACE PCR được sử dụng để có
được toàn bộ chiều dài 1.259 bp cDNA AdBMT (accession no. JN585954) ngoại trừ đuôi poly (A).

•

Chuỗi acid amin liên kết của AdBMT cho thấy rằng polypeptide AdBMT có tất cả 5 vùng được bảo tồn, IV (Ibrahim et al, 1998) đã được tìm thấy, chia sẻ 28%-91% sự tương đồng với OMTs thực vật và xác
định ít nhất là đối với OMT của người (13%).

Biểu hiện vượt mức AdBMT trong
E. coli tái tổ hợp