LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP PHÁT HIỆN GEN ĐỘC LỰC stx1, stx2, eae, hly CỦA ESCHERICHIA COLI NHÓM STEC VÀ GEN rfbE, fliC CỦA SEROTYPE O157:H7

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
*********

BÙI THỊ THU TRANG

PHÁT HIỆN GEN ĐỘC LỰC stx1, stx2, eae, hly
CỦA ESCHERICHIA COLI NHÓM STEC VÀ GEN
rfbE, fliC CỦA SEROTYPE O157:H7

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

TP. Hồ Chí Minh
07/10/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
*********

BÙI THỊ THU TRANG

PHÁT HIỆN GEN ĐỘC LỰC stx1, stx2, eae, hly
CỦA ESCHERICHIA COLI NHÓM STEC VÀ GEN
rfbE, fliC CỦA SEROTYPE O157:H7
Chuyên ngành: Thú y
Mã số: 60 62 50

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN

TP. Hồ Chí Minh
07/10/2009


PHÁT HIỆN GEN ĐỘC LỰC stx1, stx2, eae, hly CỦA
ESCHERICHIA COLI NHÓM STEC VÀ GEN rfbE, fliC CỦA
SEROTYPE O157:H7
*********

BÙI THỊ THU TRANG

HỘI ĐỒNG CHẤM LUẬN VĂN
1. Chủ tịch:

PGS.TS. TRẦN ĐÌNH TỪ
Hội Thú Y Việt Nam

2. Thư ký:

TS. NGUYỄN THIÊN THU
Công Ty Thuốc Thú Y Trung Ương 2

3. Phản biện 1:

PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN
Đại Học Nông Lâm TP. HCM

4. Phản biện 2:

TS. NGUYỄN TẤT TOÀN
Đại Học Nông Lâm TP. HCM

5. Ủy viên:

PGS.TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN
Đại Học Nông Lâm TP. HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
HIỆU TRƯỞNG

i


LÝ LỊCH CÁ NHÂN

*********
Họ và tên: Bùi Thị Thu Trang
Ngày sinh: 20/02/1981
Nơi sinh: Tiền Giang
Họ tên Cha: Bùi Văn Khiến
Họ tên Mẹ: Lê Thị Siêng
Quá trình học tập
- Năm 1999: Tốt nghiệp phổ thông trung học tại trường PTTT Cái Bè, Tiền Giang
- Năm 2004: Tốt nghiệp ngành Bác sỹ thú y tại Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
- Năm 2005: Học Cao học thú y tại Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Tình trạng gia đình: chưa
Địa chỉ liên lạc
Email:

Điện thoại: 0907 133110

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công
trình nào khác.
Tác giả

iii


LỜI NÓI ĐẦU
Mấy năm cao học đã trôi qua, với hơn 15 tháng thực tập đề tài. Trong những tháng
ngày này, tôi đã học hỏi được rất nhiều kiến thức chuyên môn lẫn trong cuộc sống. Tôi vui
mừng khi biết mình thêm khôn lớn. Để có được như ngày hôm nay làm sao con quên được
công ơn của Cha Mẹ, người đã sinh con ra và vất vả nuôi con ăn học nên người. Một lần
nữa, cho con được khắc ghi lòng kính trọng và nhớ ơn Thầy Nguyễn Ngọc Tuân, người
Thầy thật đáng kính như một người Cha !
Thành kính ghi ơn BGH Trường ĐHNL TP. HCM, BCN Khoa CN-TY, Quý Thầy Cô
trong Khoa luôn hết lòng vì học trò. Chân thành cảm tạ Viện CNSH & MT, phòng thực tập
KNTS & MTSKVN luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành đề tài. Cho em được gửi lời
cảm ơn sâu sắc đến Cô Hồ Thị Kim Hoa, Cô luôn tận tình chỉ dạy và cũng hay chê em
nhiều nhất, nhưng em biết mỗi lần chê là một lần Cô mong em thêm tiến bộ.
Sự biết ơn xin được giữ lại trong lòng với rất nhiều người mà tôi không kịp kể tên,
những anh chị, bạn bè, em út thật dễ thương và vô cùng tốt bụng mà tôi đã may mắn được
gặp trong suốt những tháng ngày học tập.
Bùi Thị Thu Trang

iv


TÓM TẮT

Đề tài “Phát hiện gen độc lực stx1, stx2, eae, hly của Escherichia coli nhóm
STEC và gen rfbE, fliC của serotype O157:H7” được thực hiện từ tháng 08/2007 đến
11/2008 tại trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM. Quá trình nghiên cứu bao gồm thu
thập và xử lý 238 mẫu phân bò, phân lập vi khuẩn E. coli, PCR để phát hiện gen, thử
phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính, và giải trình tự nucleotide một số sản
phẩm PCR. Kết quả thu được:
(1) Tỷ lệ phát hiện gen độc lực của nhóm STEC có liên quan đến tuổi, tình
trạng tiêu chảy, giống và mùa. Cụ thể, tỷ lệ phát hiện gen độc lực của E. coli trên
phân bò luôn cao hơn trên phân bê, trong phân tiêu chảy cao hơn phân bình thường,
giống bò sữa cao hơn bò ta, và mùa mưa luôn cao hơn mùa nắng.
Đặc biệt, đã phân lập được 2 gốc vi khuẩn E. coli có mang gen rfbE và fliC mã
hóa kháng nguyên thân O157 và kháng nguyên lông H7. Đồng thời, chúng cho kết
quả dương tính với bộ kháng huyết thanh của serotype O157:H7.
(2) Hai gốc vi khuẩn O157:H7 được phân lập có độ tương đồng cao về gen
eae, rfbE, và fliC (>96%); tương đồng rất thấp về gen stx2 và gen hly (<30%).
Trình tự đoạn nucleotide thuộc gen stx2, hly, và fliC của 2 chủng O157:H7 tại
Việt Nam có độ tương đồng khoảng 30% so với các chủng trên thế giới; trình tự đoạn
nucleotide thuộc gen eae tương đồng khoảng 86% so với chủng E. coli của Thái Lan
và khoảng 96% so với chủng E. coli của Nhật; đoạn nucleotide thuộc gen rfbE được
xếp chung với các chủng của Mỹ và có tỷ lệ tương đồng rất cao (98,9 – 100%) so với
các chủng này.

v

SUMMARY
This thesis describes “Detection of virulent genes stx1, stx2, eae, hly in Shiga
toxin - producing E. coli, and genes rfbE, fliC of the O157:H7 serotype”
A total of 238 fecal samples were collected from cattle, then culturing and
confirming E. coli, using mPCR to detect virulent genes, determination of serotype,
and sequencing. The results showed that:
The age, condition of diarrhea, breed of cattle, and season related to the
frequency of virulent genes detection of the STEC group. Clearly, the rate of virulent
genes detection of the STEC group were higher in adult cattle than young calves, in
diarrhea cases than normal cases, in HF breed than Ta breed, in the rains than the dry
season.
Specially, two E. coli O157:H7 isolates were determined, they contained genes
rfbE and fliC, were positive with E. coli O157:H7 antisera set, simultaneously. The
results of sequencing indicated that the two E. coli O157:H7 strains in Vietnam were
homogeneous over 96% for genes eae, rfbE, fliC; and about 30% for genes stx2 and
hly.
The nucleotide sequences of genes stx2, hly, and fliC of two Vietnam’s
O157:H7 strains were homogeneous about 30% in comparison with the world’s
strains; while the nucleotide sequences of gene eae were homogeneous about 86% to
Thailand strains and about 96% to E. coli strains of Japan; the nucleotide sequences
of gene rfbE were in the same branch as compared to the nucleotide sequences of
American strains (98,9 – 100%).

vi


CÁC TỪ VIẾT TẮT
A/E:

attaching - and - effacing

AMP:

adenosine 5’ monophosphate

BA:

blood agar

BHI:

brain heart infusion

CFA:

colonization factor antigen

CI:

confidence interval

CT - SMAC:

cefixime, potassium tellurite - sorbitol MacConkey

CVP:

cefixime vancomycin peptone

DAEC:

Diffusely adherent E. coli

ddNTP:

dideoxyribonucleotide triphosphate

DNA:

deoxyribonucleotide acid

dNTP:

Deoxyribonucleotide triphosphate

Eae:

E. coli attaching and effacing

EAEC:

Enteroaggregative E. coli

EHEC:

Enterohaemorrhagic E. coli

Ehly:

Enterohemolysin

EIEC:

Enteroinvasive E. coli

EPEC:

Enteropathogenic E. coli

ETEC:

Enterotoxigenic E. coli

Gb3:

globotriaosylceramide 3

GMP:

guanosine 5’ monophosphate

GUD:

β-D-glucuronidase

HC:

haemorrhagic colitis

HF:

Holstein Friesian

HUS:

haemolytic uraemic syndrome

IMViC:

indol, methyl red, Voges Proskauer, citrate

LEE:

locus of enterocyte effacement

LT:

heat-labile

vii


mPCR:

multiplex-PCR

MUG:

4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide

NA:

nutrient agar

NM:

non motility

OR:

odd ratio

PBS:

phosphate buffer saline

PCR :

polymerase chain reaction

PMN:

polymorphonuclear leukocyte

RFLP:

restriction fragment length polymorphism

RR:

risk ratio

RNA:

ribonucleic acid

rRNA:

ribosome RNA

RTX:

repeats in toxin

SLTEC:

Shiga like toxin - producing E. coli

SMAC:

sorbitol MacConkey

STEC:

Shiga toxin producing E. coli

Stx:

Shiga toxin

ST:

heat-stable

Tp. HCM:

thành phố Hồ Chí Minh

UTI:

urinary tract infection

UV:

ultraviolet

VT:

Verotoxin

VTEC:

Vero toxigenic E. coli

viii


MỤC LỤC
Trang chuẩn y ..................................................................................................... i

Lý lịch cá nhân................................................................................................... ii
Lời cam đoan .................................................................................................... iii
Lời nói đầu ........................................................................................................ iv
Tóm tắt ............................................................................................................... v
Summary ........................................................................................................... vi
Các từ viết tắt ................................................................................................... vii
Mục lục ............................................................................................................. ix
Danh sách các hình .......................................................................................... xii
Danh sách các bảng, sơ đồ .............................................................................. xiii
Phần 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu ........................................................................................................ 1
1.3 Mục đích ....................................................................................................... 2
Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1 Vi khuẩn E. coli ............................................................................................ 3
2.1.1 Phân loại E. coli .............................................................................. 3
2.1.2 Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC .......................................................... 5
2.1.2.1 Danh pháp......................................................................... 5
2.1.2.2 Độc tố và các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh
của STEC ...................................................................................... 5
2.1.2.3 Sinh thái, vòng truyền lây của nhóm STEC ...................13
2.1.2.4 Serotype O157:H7 ..........................................................14
2.1.2.5 Tình hình dịch bệnh do E. coli gây ra ............................16
2.2 Những phương pháp phát hiện E. coli thuộc nhóm STEC .........................19
2.2.1 Phương pháp nuôi cấy truyền thống .............................................19
2.2.2 Phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính ............................19

ix

2.2.3 Phương pháp nuôi cấy tế bào........................................................19
2.2.4 Phương pháp tăng sinh chọn lọc E. coli O157:H7 .......................20
2.2.5 Phân tách miễn dịch từ tính (immunomagnetic separation = IMS)
...............................................................................................................20
2.2.6 Phương pháp miễn dịch ................................................................21
2.2.7 Phương pháp lai khuẩn lạc ...........................................................21
2.2.8 Phương pháp PCR ........................................................................21
2.2.9 Phương pháp giải trình tự gen (sequencing) ................................22
Phần 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................27
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện .................................................................27
3.1.1 Thời gian nghiên cứu ....................................................................27
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu.....................................................................27
3.2 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................27
3.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................27
3.3.1 Lấy mẫu ........................................................................................27
3.3.2 Nuôi cấy phân lập vi khuẩn ..........................................................28
3.3.3 Ly trích DNA ................................................................................29
3.3.4 Xác định gen độc lực stx1, stx2, eae, hly của E. coli nhóm STEC,
gen rfbE, fliC của O157:H7 bằng kỹ thuật multiplex-PCR (mPCR) ....29
3.3.5 Thử phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính (thử antisera) ....31
3.3.5.1 Xác định các serotype O .................................................31
3.3.5.2 Xác định các serotype H .................................................33
3.3.7 Giải trình tự nucleotide các sản phẩm mPCR của các serotype
O157:H7 ................................................................................................34
3.3.7 Xử lý số liệu .................................................................................34
Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................35
4.1 Kết quả phát hiện các gen stx1, stx2, eae, hly, rfbE, fliC ...........................35
4.1.1 Gen độc lực chung ........................................................................36
4.1.2 Gen độc lực stx1 ...........................................................................38
4.1.3 Gen độc lực stx2 ...........................................................................39

x


4.1.4 Gen độc lực eae ............................................................................40
4.1.5 Gen độc lực hly .............................................................................41
4.1.6 Gen rfbE, và fliC...........................................................................42
4.1.7 Thảo luận một số yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ phát hiện gen stx1,
stx2, eae, hly, rfbE, và fliC của E. coli ..................................................43
4.2 So sánh tỷ lệ phát hiện gen độc lực theo yếu tố thức ăn hèm mì chua (có bổ
sung, không bổ sung) ........................................................................................48
4.3 So sánh tỷ lệ phát hiện gen độc lực theo màu sắc khuẩn lạc (trắng, hồng) 49
4.4 Kết quả thử phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính ............................50
4.5 Kết quả giải trình tự nucleotide đối với một số sản phẩm PCR .................54
Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...........................................................................62
5.1 Kết luận .......................................................................................................62
5.2 Đề nghị........................................................................................................63
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................64
PHỤ LỤC....................................................................................................................79

xi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cách xâm nhập và tấn công của vi khuẩn E. coli ......................................... 4
Hình 2.2 Tổn thương dạng bám dính và phá hủy (A / E) ............................................ 8
Hình 2.3 Mô tả con đường tấn công và sinh bệnh của STEC và O157:H7 ................. 9
Hình 2.4 Tóm tắt quá trình gây hội chứng huyết niệu (HUS) ................................... 10
Hình 2.5 Mô tả quá trình kết bám, xâm lấn và hình thành biofilm của UPEC .......... 12
Hình 2.6 Sinh thái, vòng truyền lây nhóm STEC ...................................................... 13

Hình 2.7 Công thức cấu tạo của dNTP và ddNTP ..................................................... 23
Hình 2.8 Mô tả quá trình tổng hợp các sản phẩm DNA sợi đơn được đánh dấu huỳnh
quang .......................................................................................................................... 23
Hình 2.9 Mô tả quá trình điện di xảy ra trong máy đọc trình tự ................................ 24
Hình 3.1 E. coli cho phản ứng IMViC (+, +, -, -) ...................................................... 28
Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm mPCR1 ............................................................. 31
Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm mPCR2 .............................................................. 31
Hình 3.4 Bộ antisera (Seiken, Nhật Bản) ................................................................... 32
Hình 3.5 Bộ antisera (Oxoid, Anh Quốc) .................................................................. 32
Hình 3.6 Giấy test O157 (Oxoid) ............................................................................... 33
Hình 4.1 Khuẩn lạc E. coli nhóm STEC trên môi trường CT – SMAC .................... 50
Hình 4.2 Cây di truyền của các đoạn nucleotide thuộc gen stx2 ............................... 55
Hình 4.3 Cây di truyền của các đoạn nucleotide thuộc gen eae ................................ 56
Hình 4.4 Cây di truyền của các đoạn nucleotide thuộc gen hly ................................. 57
Hình 4.5 Cây di truyền của các đoạn nucleotide thuộc gen rfbE ............................... 58
Hình 4.6 Cây di truyền của các đoạn nucleotide thuộc gen fliC ................................ 59

xii


DANH SÁCH CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ
Bảng 3.1 Phân bố mẫu khảo sát ................................................................................. 28
Bảng 3.2 Các primer dùng trong phản ứng mPCR xác định sự hiện diện các gen độc
lực của E. coli ............................................................................................................. 29
Bảng 4.1 Kết quả phát hiện gen độc lực stx1, stx2, eae, hly, rfbE, fliC ..................... 35
Bảng 4.2 So sánh tỷ lệ phát hiện gen độc lực chung theo tuổi .................................. 36
Bảng 4.3 So sánh tỷ lệ phát hiện gen độc lực chung theo tình trạng phân ................ 37
Bảng 4.4 So sánh tỷ lệ phát hiện gen độc lực chung theo giống................................ 37
Bảng 4.5 So sánh tỷ lệ phát hiện gen độc lực chung theo mùa .................................. 37
Bảng 4.6 Mô hình logit về tỷ lệ phát hiện gen độc lực chung ................................... 38

Bảng 4.7 So sánh tỷ lệ phát hiện gen độc lực stx1 .................................................... 38
Bảng 4.8 Mô hình logit về tỷ lệ phát hiện gen stx1.................................................... 39
Bảng 4.9 So sánh tỷ lệ phát hiện gen độc lực stx2 ..................................................... 39
Bảng 4.10 Mô hình logit về tỷ lệ phát hiện gen stx2.................................................. 39
Bảng 4.11 So sánh tỷ lệ phát hiện gen độc lực eae .................................................... 40
Bảng 4.12 Mô hình logit về tỷ lệ phát hiện gen eae .................................................. 40
Bảng 4.13 So sánh tỷ lệ phát hiện gen độc lực hly .................................................... 41
Bảng 4.14 Mô hình logit về tỷ lệ phát hiện gen hly .................................................. 41
Bảng 4.15 So sánh tỷ lệ phát hiện gen độc lực rfbE .................................................. 42
Bảng 4.16 So sánh tỷ lệ phát hiện gen độc lực fliC ................................................... 42
Bảng 4.17 So sánh tỷ lệ phát hiện gen độc lực theo yếu tố bổ sung hèm mì chua vào
thức ăn........................................................................................................................ 49
Bảng 4.18 So sánh tỷ lệ phát hiện gen độc lực theo màu sắc khuẩn lạc .................... 50
Bảng 4.19 Kết quả thử phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính .......................... 53
Bảng 4.20 Những chủng vi khuẩn tham khảo của gen stx2 từ Genebank.................. 54
Bảng 4.21 Những chủng vi khuẩn tham khảo của gen eae từ Genebank .................. 56
Bảng 4.22 Những chủng vi khuẩn tham khảo của gen hly từ genebank .................... 57
Bảng 4.23 Những chủng vi khuẩn tham khảo của gen rfbE từ Genebank ................. 58

xiii


Bảng 4.24 Những chủng vi khuẩn tham khảo của gen fliC từ Genebank .................. 59
Sơ đồ 3.1 Phân lập E. coli từ mẫu phân và phát hiện gen độc lực ............................. 30

xiv


Phần 1
MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Escherichia coli là một thành viên thường trực trong hệ vi khuẩn đường ruột
người và nhiều loài hữu nhũ khác, hầu hết chúng vô hại trong đường ruột vật chủ.
Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp, một số nhóm E. coli gây độc tăng sinh mạnh,
trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc. E. coli gây
bệnh đường ruột trên người được chia thành nhiều nhóm (EPEC, STEC, ETEC,
EAEC, EIEC, DAEC), và mỗi nhóm đều giữ một vai trò nhất định trong cơ chế sinh
bệnh. Trong đó, nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E. coli) mà nhất là serotype
O157:H7 đặc biệt được quan tâm.
Nhóm STEC mang nhiều gen độc lực mã hóa các độc tố nguy hiểm như độc tố
Shiga, độc tố gây xuất huyết ruột (enterohaemolysin), là nguyên nhân của nhiều vụ
ngộ độc thực phẩm, với các hội chứng lâm sàng như viêm đường dạ dày – ruột, gây
tiêu chảy, gây viêm kết tràng xuất huyết (hemorrhagic colitis); nhiễm trùng đường
niệu (urinary tract infection), gây hội chứng huyết niệu (hemolytic uraemic
syndrome), viêm màng não (Nakasone và ctv, 2005). O157:H7 là một trong những
tác nhân quan trọng gây tử vong cho trẻ em ở những nước đang phát triển (Morin và
ctv, 2004). Chính vì vậy, đề tài “Phát hiện gen độc lực stx1, stx2, eae, hly của
Escherichia coli nhóm STEC và gen rfbE, fliC của serotype O157:H7” được tiến
hành.
1.2 Mục tiêu
Phân tích một số yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ phát hiện gen độc lực stx1, stx2,
eae, hly của E. coli nhóm STEC; và gen rfbE, fliC của serotype O157:H7 bằng kỹ
thuật multiplex-PCR.
Xác định serotype của một số gốc E. coli phân lập được thuộc nhóm STEC.
Xác định mức độ tương đồng về trình tự nucleotide của các gen stx2, eae, hly,
rfbE, fliC thuộc serotype O157:H7 được phân lập tại Việt Nam với nhau và so với

1

một số chủng được công bố trên ngân hàng gen.
1.3 Mục đích
Góp phần chẩn đoán, kiểm soát bệnh do E. coli gây ra cho động vật và người.

2


Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn Escherichia coli được bác sỹ nhi khoa người
Đức Theodor Escherich (1857 – 1911) phân lập và mô tả đầu
tiên vào năm 1885, từ phân của trẻ sơ sinh bị tiêu chảy
(Oberbauer, 1992).
2.1.1 Phân loại E. coli
Những dòng Escherichia coli sinh bệnh có thể gây ra ba
hội chứng bệnh: tiêu chảy đường tiêu hóa, nhiễm trùng đường niệu, nhiễm trùng
máu/gây viêm màng não. Các dòng gây bệnh đường ruột có thể được phân thành 6
nhóm (Kaper và ctv, 2004).
(1) EPEC (Enteropathogenic E. coli) (Hình 2.1a): EPEC bám chặt vào tế bào
ruột non, phá hủy cấu trúc bình thường của vi nhung mao, tấn công và làm tổn
thương bằng cách bào mòn nhung mao ruột. Kết quả là làm biến đổi cấu trúc khung
bên trong tế bào, đồng thời thường kèm theo đáp ứng viêm và tiêu chảy.
(2) STEC (Shiga toxin – producing E. coli) hoặc VTEC (Vero toxigenic E.
coli) hoặc EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli) (Hình 2.1b): tấn công và phá hủy
niêm mạc kết tràng, có thể hình thành màng biofilm để né tránh đáp ứng miễn dịch.
Đặc trưng của EHEC là tiết độc tố Shiga toxin (Stx), độc tố Stx được hấp thu vào
trong tế bào ruột dẫn đến nhiều phản ứng phức tạp xảy ra, gây nguy hiểm cho tính
mạng của vật chủ.
(3) ETEC (Enterotoxigenic E. coli) (Hình 2.1c): bám dính vào tế bào ruột non

nhờ kháng nguyên bám (CFA = colonization factor antigen), sau đó vi khuẩn bài tiết
độc tố ruột kém chịu nhiệt (LT = heat-labile) và / hoặc độc tố ruột chịu nhiệt (ST =
heat-stable, bao gồm STa và STb). LT sẽ liên kết với các thụ thể GM1 hay GD1b để
thâm nhập vào bên trong tế bào ruột, hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm gia tăng
AMP vòng trong tế bào, kích thích tế bào nhung mao ruột tiết Cl-, ngăn cản hấp thu

3


NaCl từ lòng ruột, dẫn đến hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng, kết quả là nước
được vận chuyển thụ động từ tế bào vào lòng ruột, và gây tiêu chảy nhiều nước.
Trong khi đó, ST lại liên kết với enzyme xuyên màng guanylate cyclase để vào bên
trong tế bào. Tại đó, nếu là STa sẽ làm gia tăng GMP vòng trong tế bào, kích thích
tiết Cl-, ngăn cản hấp thu NaCl và gây tiêu chảy tương tự như LT; trong khi STb
không làm tăng AMP vòng hay GMP vòng mà kích thích tiết bicarbonat (HCO3-) vào
lòng ruột và gây tiêu chảy (Nataro và Kaper, 1998; Hitotsubashi, 1992).
(4) EAEC (Enteroaggregative E. coli) (Hình 2.1d): bám dính biểu mô ruột non
lẫn ruột già, hình thành màng biofilm dày, bài tiết độc tố ruột và độc tố tế bào.

Hình 2.1 Cách xâm nhập và tấn công của vi khuẩn E. coli (Kaper và ctv, 2004)
(5) EIEC (Enteroinvasive E. coli) (Hình 2.1e): xâm lấn tế bào biểu mô ruột
kết, phân giải thể thực bào (phagosome), sau đó di chuyển xuyên qua tế bào nhờ vào
việc hình thành vi sợi actin giống như cái đuôi để giúp vi khuẩn di cư sang tế bào
khác. Vi khuẩn có thể di chuyển một cách trực tiếp từ tế bào biểu mô này sang tế bào

4


biểu mô khác, cũng có thể thoát ra và xâm nhập trở lại màng tương của tế bào kế cận.
(6) DAEC (Diffusely adherent E. coli) (Hình 2.1f): thường làm cho tế bào biểu

mô ruột non biến dạng thành hình giống như ngón tay bao quanh vi khuẩn.
2.1.2 Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC
2.1.2.1 Danh pháp
Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những danh pháp khác
nhau để đặt tên cho nhóm E. coli này. Tên Verotoxigenic E. coli hoặc Vero cytotoxin
producing E. coli (VTEC) được Konowalchuk và ctv đặt cho nhóm này khi phát hiện
chúng sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào Vero vào năm 1977. Tên gọi VTEC
được sử dụng rộng rãi ở Anh và nhiều tổ chức khoa học châu Âu. Tên gọi
enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) bắt nguồn từ triệu chứng gây viêm kết tràng xuất
huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS: haemolytic uraemic
syndrome) (Nataro và Kaper, 1998). Tên Shiga toxin - producing E. coli (STEC)
(trước đây gọi là Shiga like toxin - producing E. coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh
độc tố gây độc tế bào giống như độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1997) của Shigella
dysenteriae. Tên gọi STEC được sử dụng nhiều trong các tạp chí khoa học ở Mỹ.
STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau và cả hai đều chỉ ra rằng
nhóm E. coli sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào. Mặc dù vậy, không
phải có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có các yếu tố độc lực khác.
Những dòng E. coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe
mạnh với một số lượng rất ít, nhưng những dòng này thiếu một hay nhiều yếu tố độc
lực khác nhau của STEC (Beutin và ctv, 1995). Do đó, không phải tất cả STEC đều
có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998).
2.1.2.2 Độc tố và các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC
STEC có các độc lực: độc tố Shiga (Stx), yếu tố bám (Eae), độc tố gây xuất
huyết ruột (enterohemolysin = Ehly); và trong thực tế chỉ cần 1-100 tế bào vi khuẩn
trên liều gây nhiễm là có thể gây bệnh với nguy cơ rất cao (Paton và Paton, 1998).
™ Độc tố Shiga (Shiga toxin)
STEC sản sinh độc tố (Stx), hay còn được gọi là Verotoxins (VT) hoặc Shiga –
like toxins (Slt). Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính là Stx1 và Stx2, chúng giống

5

nhau khoảng 55% trình tự amino acid, được mã hóa bởi gen stx1 và stx2. Cả hai gen
stx1 và stx2 được định vị trên thực khuẩn thể (bacteriophage) ôn hòa, thực khuẩn thể
này được chèn vào trong nhiễm sắc thể của STEC. Một dòng STEC chỉ sản xuất độc
tố Stx1, hoặc Stx2, hoặc cả hai, hoặc thậm chí nhiều dạng Stx2. Ba loại Stx2 được
xác định là Stx2, Stx2c, và Stx2e (Pierard và ctv, 1998). Có thể thay thế giữa thuật
ngữ Stx và VT (ví dụ: Stx1 = VT1 = Slt1, Stx2e = VT2e = Slt2e) (Caldervood và ctv,
1997). Theo Paton và Paton (1998), tất cả độc tố Stx đều gồm hai thành phần cấu tạo:
(1) Tiểu đơn vị A, 32 kDa, gồm peptide A1 28 kDa và peptide A2 4 kDa nối với nhau
bằng cầu nối disulfit, peptide A1 có hoạt tính enzyme và peptide A2 có nhiệm vụ gắn
kết tiểu đơn vị A vào những tiểu đơn vị B; (2) Năm tiểu đơn vị B có trọng lượng phân
tử là 7,7 kDa. Các tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với thụ thể đặc hiệu của nó, ví dụ
thụ thể Gb3 (globotriaosylceramide), hay Gb4. Tùy theo sự phân bố của các thụ thể
trên từng loại tế bào mà cách sinh bệnh có thể khác nhau. Có khoảng trên 200
serotype E. coli có thể sản sinh độc tố Stx (Shiga toxin) (Lingwood, 1996).
Trong tiến trình sinh bệnh của STEC gồm 4 giai đoạn (thâm nhập, bám dính,
nhân lên và tiết độc tố) (Qadri và ctv, 2005). Khi thâm nhập được vào đường ruột, vi
khuẩn bám dính, nhân số lượng tế bào, sản sinh độc tố Stx. Stx xuyên qua hàng rào
biểu mô ruột, thâm nhập vào máu. Để gây bệnh, Stx phải được tiếp nhận bởi các thụ
thể đặc hiệu, thường là thụ thể Gb3 (globotriaosylceramide), dạng thụ thể glycolipid
này có trên bề mặt tế bào biểu mô ruột ở lớp dưới niêm, tế bào não, bạch cầu đa nhân
(PMN = polymorphonuclear leukocyte), bạch cầu đơn nhân lớn, tế bào biểu mô thận,
tế bào Vero, tế bào Hela. Sau khi các tiểu đơn vị B giúp cho độc tố Stx gắn kết với
các thụ thể đặc hiệu, độc tố Stx sẽ đi vào bên trong tế bào, tiểu đơn vị A đến tế bào
chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome, rồi cắt một gốc adenin khỏi rRNA
28S của ribosome, vì thế gây trở ngại cho sự tổng hợp protein. Vì không tổng hợp
được protein nên những tế bào bị Stx tác động sẽ chết (đây được xem là nguyên nhân
của hiện tượng chết theo chu trình - apoptosis). Hầu hết những phương pháp chẩn
đoán phân tử đều có mục tiêu phát hiện gen mã hóa Stx của nhóm STEC (Cocolin và

ctv, 2000).

6


™ Enterohaemolysin (Ehly)
Enterohaemolysin (Ehly = Hly) tồn tại ở nhiều dạng (ví dụ α, β). Gen mã hóa
cho độc tố Ehly có tên là hly. Gen hly nằm trên plasmid 60 Mda, plasmid này được
tìm thấy trên nhiều dòng O157:H7 và cũng hiện diện ở các dòng STEC không phải
O157 (STEC-non O157, ví dụ như O26, O111, O153). Ehly là nguyên nhân làm hư
hại tế bào Vero, hep-2 hoặc Hela in vitro (Beutin và ctv, 1989). Enterohaemolysin
thuộc nhóm độc tố RTX (Repeats in toxin), gây dung giải tế bào tạo thành lỗ như lỗ
chân lông (RTX family of pore forming cytolysin). RTX thường hiện diện trong
những dòng E. coli gây bệnh đường niệu và thường cho kiểu dung huyết αhaemolysin (α-Hly) (Paton và Paton, 1998). Khảo sát của Beutin và ctv (1989) khẳng
định đa số các dòng STEC đều cho kiểu dung huyết α (α-Hly). Tuy nhiên, cơ chế
sinh bệnh cụ thể của độc tố Hly vẫn chưa được biết rõ, nhưng Law và Kelly (1995)
kết luận rằng chính sự dung huyết đã trở thành nguồn cung cấp Fe kích thích sự phát
triển của STEC trong ống tiêu hóa. Bauer và Welch (1996) cho biết những dòng E.
coli sản sinh độc tố haemolysin gây bệnh đường niệu thỉnh thoảng còn được gọi là
uropathogenic E. coli = UPEC. Các E. coli này có thể bị lây nhiễm từ ruột, ban đầu
sự nhiễm xảy ra ở bên ngoài ống dẫn tiểu. Sau đó, vi khuẩn đi vào bên trong ống dẫn
tiểu đến bàng quang. Khoảng 4 – 24 h sau khi nhiễm, vi khuẩn bám vào các tế bào
biểu mô bàng quang. Bám dính đóng vai trò quan trọng của vi khuẩn trong quá trình
nhiễm trùng đường niệu. Vi khuẩn bắt đầu xâm lấn vào bên trong tế bào biểu mô
bàng quang, nhân lên, tiết độc tố haemolysin, gây ra hiện tượng apoptosis, gây tróc
từng mảng các tế bào biểu mô bàng quang. Vi khuẩn cũng có thể đi theo ống dẫn tiểu
để đến thận, bám vào tế bào biểu mô thận, tiếp tục nhân lên và tiết độc tố haemolysin.
Haemolysin còn có tác dụng tạo ra sự giao động của Ca2+ trong tế bào biểu mô thận,
kết quả là làm tăng IL-6 và IL-8, gây hóa hướng động bạch cầu; gây phá hủy quản
cầu thận nên không bài tiết được các chất độc trong máu, gây dung giải tế bào tạo

thành lỗ như lỗ chân lông giúp vi khuẩn thoát ra khỏi tế bào và đi theo dòng máu, gây
nhiễm trùng huyết (Cegelski và ctv, 2008). Có nhiều nghiên cứu di truyền cho biết
gen hly của những dòng STEC có trình tự giống nhau trên 98%, nhưng vẫn có sự
khác nhau lớn ở một số đoạn trình tự chuyên biệt (Feng và Monday, 2000).

7


™ Yếu tố kết bám intimin

Hình 2.2 Tổn thương dạng bám dính và phá hủy (A / E) (Kaper và ctv, 2004)
Để quá trình tấn công tế bào vật chủ xảy ra, trước tiên vi khuẩn cần phải định
vị được trên tế bào biểu mô ruột. Do vậy, yếu tố kết bám của STEC đóng vai trò rất
quan trọng trong việc giúp vi khuẩn bám chặt vào tế bào nhung mao ruột, vì thế yếu
tố kết bám này còn được xem là một yếu tố độc lực của vi khuẩn. Đó là intimin - một
loại protein màng ngoài có trọng lượng phân tử 94 - 97 kDa, được mã hóa bởi gen
eae (E. coli attaching và effacing), gen eae nằm trên nhiễm sắc thể. Intimin gây tổn
thương dạng bám dính và phá hủy (attaching - and – effacing, A/E) ở ruột do vi
khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv, 1993). Gen eae là một trong
số các gen nằm trong vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột locus of enterocyte effacement, vùng LEE). Gen eae cũng có thể được tìm thấy ở
nhóm EPEC, tồn tại ở hầu hết các dòng STEC, nhưng không phải tất cả các dòng
STEC đều có gen eae (Nataro và Kaper, 1998).
E. coli nhóm STEC có mang độc tố bám dính - phá hủy (A / E), sẽ tấn công và
bào mòn vi nhung mao ruột, tổ chức lại khung sợi actin của tế bào. Bám dính - phá
hủy mô gây ra do STEC sẽ dẫn đến hình thành những cấu trúc giống như một cái bệ
và trên cái bệ là một cái cột nhô lên. Tổn thương này xảy ra trên tế bào biểu mô ruột,
đó là nơi mà vi khuẩn trú ngụ để né tránh miễn dịch của vật chủ. Vi khuẩn nhân lên

8

và được bài thải ra môi trường theo phân tiêu chảy. Cơ chế tiêu chảy không được biết
rõ, nhưng có liên quan đến sự mất cân bằng của hệ thống tế bào biểu mô ruột (Kaper
và ctv, 2004). Sandhu và ctv (1996) cho biết có sự liên quan chặt chẽ giữa gen eae
của nhóm STEC với những ca viêm kết tràng xuất huyết (HC) và hội chứng huyết
niệu (HUS).
™ Hội chứng huyết niệu (HUS)

Hình 2.3 Mô tả con đường tấn công và sinh bệnh của STEC và O157:H7 (George,
2000)
Ghi chú:
1: E. coli O157:H7 liên kết với riềm bàn chải của màng nhày ruột non;
2: E. coli O157:H7 sản sinh độc tố Vero phá hủy vi nhung mao;
3: độc tố Vero xâm nhập vào máu, gây hư hại biểu mô mạch máu và làm tăng
sự kết tập tiểu cầu;
4: hình thành các cục huyết khối, gây ra hiện tượng thiếu máu cục bộ, làm hư
hại kết tràng, thận và các mô bào khác; gây viêm kết tràng xuất huyết; và hội chứng
huyết niệu
Hoạt động của độc tố Stx sẽ gây ra hội chứng HUS. Các dòng E. coli thuộc
nhóm STEC, đặc biệt là những dòng O157:H7 sẽ bám vào màng nhày ruột nhờ yếu tố
kết bám intimin. Sau đó, vi khuẩn sẽ sản sinh độc tố Shiga (Shiga toxin = Stx =
Verotoxin = VT), Shiga toxin được xem là chìa khóa độc lực của STEC. Độc tố Shiga

9