DSpace at VNU: Nghiên cứu đặc tính của các isozym Phootphataza trong tinh dịch người, ứng dụng cho xét nghiệm pháp lý

TAP CHÍ K H O A H Ọ C OHQGHN. KHTN

&CN.

T XX. sỏ' 2PT.. 2004

N G H I Ê N C Ứ U Đ Ặ C T Í N H C Ủ A C Á C IS O Z Y M P H O T P H A T A Z A A X IT
T R O N G T I N H D Ị C H N G Ư Ờ I, Ứ N G D Ụ N G C H O X É T N G H I Ệ M P H Á P LÝ
L ê T rọ n g V ă n , N ghiêm X u â n D ũ n g
Cục K ỹ th u ậ t Hóa sinh và tài liệu nghiệp vụ, Bộ C ông An
Đ ỗ N gọc L iên
K hoa S in h học, Trường Đại học Khoa học T ự n hiên, Đ H Q G H N
1. M ở đ ầ u
Trong khoa học pháp lý, việc xác định chính xác nguồn gô’c m ột số loại dấu vết sinh
học cỏ ý nghĩa đặc biệt quan trọng. Công việc này đòi hỏi phải có những phương pháp xác
dịnh chuẩn xác, độ tin cậy cao và thòi gian xác định n h an h chóng đê tìm ra bằng chứng
khoa học cho các vụ án hình sự. Hiện nay ở nước ta, công việc nghiên cửu vể đặc tính hóa
sinh của tinh dịch người và dấu vết tinh dịch phục vụ cho ng àn h khoa học pháp lý còn gặp
khỏ khăn.
Isozym photphataza axit (ACP, EC 3.1.3.2) có nguồn gốc từ tuyến tiền liệt đặc trưng
cho tinh dịch, có hàm lượng và hoạt độ rấ t cao, trong khi đó h o ạt tính của nó khó phát hiện
trong huyết th an h người khỏe trưởng thành [3,4,5]. Do đó, ngoài kháng nguyên PSA
(Prostatic specific Antigen) được tiế t ra từ tuyến tiền liệt, isozym ACP có thè được coi như
một chi thị hóa sinh đặc trư ng cho tinh dịch của người [2,8],
Xuất p h át từ yêu cầu thực tế, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sự biểu hiện đặc tinh
isQzym photphataza ax it từ tinh dịch người ỏ những điểu kiện môi trường khác nhau bằng
kỹ th u ậ t điện di isozym photphataza ax it trong gel polyacrylam it và m ột số kỹ th u ậ t hóa
sinh khác.
2. N g u y ê n liệ u v à p h ư ơ n g p h á p
42 mầu tinh dịch được lấy từ bệnh viện c , khoa T ế bào học, trường Đại học Y Hà Nội
và một số người khỏe tình nguyện khác. Thể tích mỗi m ẫu là từ 1,8 - 2,5 ml, trong đó 9 mẫu

lấy từ người khỏe có độ tuổi từ 23 đến 30, 22 mẫu từ người có độ tuổi từ 31 đến 40 và 11
m ẫu từ người có độ tuổi từ 41 đến 48 tuổi. M âu huyết th an h của m ột s ố bệnh nhân ung thư
tuyến tiền liệt đă được xét nghiệm lảm sàng lấy từ Bệnh viện U ng th ư T rung ương (Viện K.
Hà Nội), mẫu huyết th an h ngưòi khỏe trưỏng thành lấy từ Viện H uyết học T ruyền máu
T rung ương. T ất cả các m ẫu tinh dịch và huyết thanh dược ph ân tích ngay sau khi láy mẫu,
hoặc dược báo quán dông lạnh - 70°c cho đến khi sử dụng.
Xác định hoat độ photphataza ax it trong các m ẫu tin h dịch vả hu y ết th an h theo
phương pháp của B odansky được mô tả trong các tài liệu [1,2,4]. Điện di phân tích biểu hiện
isozym photphataza ax it từ tinh dịch và huyết thanh theo phương pháp do M anchenko mó

196


Nghicn cứu tlãc linh cua các isOẠin pholphataza axil..

197

tá [6]. Các th iết bị như máy điện di, bộ nguồn và hóa chất được m ua của các hãng có uy tín
như BIORAD và SIGMA.
3. K ế t q u a v à t h ả o lu ậ n
3.1.

Định lượng hoạt độ pho tp h a ta za a xit trong các m ẫu tin h d ịch và huyết thanh

Kết quả xác định hoạt dộ photphataza ax it từ tinh dịch của người cho thấy, hoạt độ
trung bình của các m ẫu tinh dịch người ỏ nhóm tuổi từ 23 • 30 là 658,09, đơn vị Bodansky
(U.B), ỏ nhóm tuổi từ 31 - 40 là 546,95 U.B và â nhóm tuổi từ 41 đến 48 là 663,50 U,B. Nhìn
chung, hoạt độ photphataza axit từ tinh dịch ngưòi ở các nhóm tuổi nam giới đã nghiên cứu
cho thấy có sự biến động tương đối rộng từ 79,4 U.B đến 1.371 U.B. H oạt độ trung bình ACP
của cả 3 nhóm tuổi là 538,6 U.B. Tuy nhiên trong cả 3 nhóm tuổi sự chênh lệch về hoạt độ

trung bình ACP cũng không th ể hiện quá rõ rệt. Mặc dù vậy ở mỗi nhóm tuổi hoạt độ ACP ở
một số cá thổ biểu hiện khá thấp, cụ th ể là khoảng dưới 200 Ư.B và chiếm 11,9% ở tổng sô'
cá ba nhóm. T uy nhiên hoạt độ ACP của tinh dịch ngưòi dù ở mức độ th ấp n h ấ t cũng còn
cao hơn gấp 200 lần so với hoạt độ ACP của huyết th an h người khỏe binh thường. Diều đó
chứng tỏ hoạt độ photphataza axit của tinh dịch người là một dấu hiệu dễ p h át hiện nhất
trong

các mô tế bào của người. Đặc tính này cũng đã được nhác tối trong các công trình

nghiên cửu trước đây của các tác giả Closkey và cộng sự [2], và Schiff [7] (xem biểu dồ cột).

Hình 1. Biểu đồ so sánh hoạt độ ACP cùa tinh dịch (1,2,3) và huyết thanh (4)
cùa người khoẻ trường thành. Giải thích đồ thị ỏ trong bài.
3.2. Biêu hiện p h ố điện d i isozym photphataza axit của tin h dịch và huyết thanh
C húng tôi đã tiến hàn h lựa chọn điều kiện chạy điện di trong gel polyacrylam it ỏ các
nồng độ gel và pH khác nh au đối với các isozym photphataza ax it từ tinh dịch và huyết
thanh người khỏe trưởng thành. Kết quả phân tích cho thấy, ở nồng độ gel polyacrylam it
7,5%, pH 8,6, các băng isozym photphataza axit cũng biểu hiện rõ nhưng riêng các băng
isozym ACP chạy chậm không thấy rõ. Trái lại hai băng isozym ACP chạy nhanh (dược


Lé Trọng Văn. Nghiém Xuân Dũng. Đ ổ Ngọc Liôn

đánh sỗ' là A pl và Ap2 theo quy ước quốc tê) gần nh ư được biểu hiện rõ trê n điện di đồ, nhất
là khi tăng lượng m ẫu phân tích (hình 2, ảnh điện di đồ 1).
Khi thay đổi điều kiện điện di ờ pH 7,8, nồng đồ gel polyacrylam it 8,5%, chúng tôi đã
phát hiện ra 5 bảng isozym ACP từ tinh dịch người được đánh sô' là Ap 1, Ap 2, Ap 3, Ap 4,
Ap 5 trong đó các băng Ap 3, 4, 5 chạy chậm hơn, các băng Ap 1, 2 chạy nh an h hơn. Điều
đáng chú ý là các băng chạy n h an h Ap 1 và Ap 2 có hoạt độ rấ t cao, luôn luôn biểu hiện rấ t
rõ trong tinh dịch người ở tấ t cả các m ẫu phân tích (hình 3, ảnh điện di đổ 2).

Hình 2. Ánh điện di đổ các mẫu tinh dịch ngưòi dược điện di gel polyacrylamit 7,5%; pH 8,6
(giếng 1,2,3,4,5 cùng một thể tách tra mẫu, riêng giếng 6 lượng thể tích tra mẫu tăng lén gấp đôi)

I
1

2

3

4

5

Hình 3. Anh diện di đồ phân tích các isozym ACP từ các mẫu tinh dịch ngưòi trong gel polyacrylamit
8,5%, pH 7,8 (giải thích trong bài)
Kết quả ở trê n cho thấy rằng, các isozym ACP từ tinh dịch người rấ t dễ p h át hiện
bằng kỹ th u ậ t điện di isozym ACP, ở nồng động gel polyacrylam it 7,5 + 8,5% và điểu kiện
pH từ tru n g tính đến hơi kiềm. Do đó phương pháp điện di isozym ACP là một kỹ th u ậ t cho
phép phát hiện dặc hiệu, nhanh chóng và nhậy đôì vối các băng isozym ACP của tinh dịch người.


Nghiên cứu dặc tính cùa các isozvm pholphataza axil.

199

Khi so sánh phổ điện di isozym ACP từ tinh dịch, hu y ết th a n h người bình thường và
huyết th an h bệnh nhân ung th ư tuyến tiền liệt, chúng tôi n h ận th ấy các isozym ACP của
huyết th an h người bình thường và bệnh nh ân un g thư tuyến tiền liệt luôn luôn chỉ biểu

hiện 2 băng chạy nh an h là Ap 1 và Ap 2. Thêm vào đó các nghiên cứu của King - Am strong
[4] còn cho biết hoạt độ p h otphata 2a ax it :ổng số từ huyết th an h ngưòi bình thường chỉ là từ
1 - 2 đơn vị King - Am strong (U.K.A)/100 ml huyết th an h v à tăn g lên từ 50 - 250 lần ở bệnh
nh ân ung th ư tuyến tiền liệt đã di căn, trong đó 90% h o ạt độ biểu hiện là photphataza axit
kém bển với axit xitric. Nhờ kỹ th u ậ t điện diện di isozym ACP chúng tôi cũng đã p h á t hiện
ra các băng isozym ACP chạy nhanh từ huyết th an h người bình thưòng và bệnh lý nhưng
củng không p h á t hiện được rõ các băn g isozym ACP chạy chậm . T rong khi đó ở tin h dịch
người được điện di so sánh luôn luôn x u ất hiện từ 4 - 5 băng isozym ACP đặc b iệt biểu hiện
rõ là các băng Ap 1, Ap 2 (hình 4 ảnh điện di đồ 3).

Ap5
Ap4
Ap3
Ap2
A pl

1
2
3
4
5
Hình 4. Ánh điện di đổ trong gel polyacrylamit 8,5%; pH 7,8 cho biết phố điện di của
các mẫu tinh dịch (1,2,3) và các mẫu huyết thanh người bình thường (4) và huyết thanh
bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt (5) (giải thích trong bài).
3.3. M ột sô' tín h c h ấ t củ a isozym p h o tp h a ta za a x it từ tin h d ịch

Hình 5. Đồ thị biểu diễn hoạt độ ACP bị giảm rấ t nhanh khi xử lý tinh dịch ở nhiệt độ
55°c trong thòi gian từ 1 ■phút.

Lẽ Trọng Vãn. Nghiém Xuũn Dũng. D ỏ Ngọc Liên

C húng tôi đã tiến hàn h khảo s á t hoạt độ isozym ACP â diều kiện 55°c (là mô hình
nhiệt độ tinh dịch có th ể bị phơi ngoài tròi nắng gắt dễ gặp trong thực tê th u thập m ẫu phân
tích), và m ẫu tinh dịch được thấm trên vải trong vài ngày ỏ n h iệt độ phòng (30 - 35°C). Kết
quả phân tích cho thấy nếu m ẫu tinh dịch bị xủ lý ỏ nhiệt độ 55", hoạt độ ACP bị giảm r ấ t
nhanh sau 1 phút thí nghiệm (còn lại 39 - 40% hoạt độ) và sau 2 phút hoạt độ chì còn lại õ - 6%
(hình 5, đồ thị 1)
Khi phân tích điện di isozym ACP ở diều kiện đã lựa chọn đối với tin h dịch thấm trên
vải sau 3 ngày để ỏ nhiệt độ phòng, chúng tôi vẫn phát hiện đuợc 2 băng isozym ACP chạy
nhanh là Ap 1, Ap 2 ở các m ẫu vải th í nghiệm. Phân tích này cũng được so sánh với các mẫu
tinh dịch tươi trong cùng một điểu kiện điện đi (hình 6, ảnh điện di đồ 4)

Hình 6. Ảnh điện di đồ isozym ACP từ tinh dịch (1) từ tinh dịch thấm vải của
người bình thường (2) và huyết thanh bệnh nhân ung thư tuyết tiền Hệt sau (3)
4. K ết lu ậ n
1. Hoạt độ isozym ACP từ tinh dịch người có sự biến động tương đôi rộng từ 79,4 Ư.B
đến 1.351 U.B đã đuợc phản tích ờ 42 cá th ể thuộc vể 3 nhóm tuổi khác nhau vã có trị sô
trung bình là 538,6 U.B trong đó số cá th ể có trị sô' dưới 200 U.B chiếm 11,9% tổng số các cá
thê đã phân tích.
2. Phổ điện đi isozym ACP từ tinh dịch người của các cá th ể khác nh au đểu biểu hiện
rõ từ 4 - 5 băng isozym ACP và đặc biệt là các băng isozym chạy nhanh Ap 1 và Ap 2 khi
tiến hành phản tích bằng kỹ th u ậ t điện di trong gel polyacrylam it 8,5%, pH 7,8.
3. Các isozym ACP r ấ t kém bền ở nhiệt độ cao và ỏ pH kiềm , nhưng vẫn có th ể p h át
hiện dễ dàng hoạt tính cũng như các băng isozym chạy nh an h Ap 1 và Ap 2 từ tinh dịch
thấm trên vải sau 3 ngày bằng kỷ th u ậ t điện di trong gel polyacrylam it và bằng các kỹ
th u ật hóa sinh định lượng và định tính khác nhau.


Nghiên cứu dặc lính của các iso/ym phoiphataza axil..

201

TÀILIỆUTHAMKHẢO
1.

Nguyền Vãn Mùi, Xác định hoạt độ enzym, NXB Khoa học kỹ th u ật Hà Nội, 2001, tr. 304

2.

Closkey MC., Muscillo KL., Noordewier B., Prostatic acid phophatase activity in postcoiltal
vagina. Journal o f forensic science, Vol. 20 1975, pp. 630 - 636.

3.

Goldsberg A. F., Takakura K., Rosenthal R. L., Electrophoretic separation of serum acid
phosphatase isozyme in Gaucher's disease, prostatic carcinoma and multiple myeloma, Clin.
Chem, Vol. 19, (10) 1973, pp. 316 - 318.

4.

King, E. J., Jegatheesan X. A.. A method for the determ ination of tartrate labile, prostatic
acid phosphatase in serum. Journal o f Clinical Pathology, (12) 1959, pp. 85 - 87.

5.

Lam, K. w ., Li, 0-, Li, CY., Yam, L.T.. Biochemical properties of hum an prostatic acid
phosphatase. Clinical Chemistry, Vol. 19, (5) 1973. pp. 20 - 22.

6.

Manchenko GP., Handbook o f detection o f enzymes on Electrophoresis, CRC Press, 1994.

7. Mary - Elen c . s., Michol L. c ., Robert J . s . s .. High sensitivity of Phenolphatalein
monophosphate in detecting acid phosphatase isozymes, Analytical Biochemistry 64, 1975,
pp. 316 - 318.
8.

Schiff, A. F., Reliability of acid phosphatase test for the identification of seminal fluid.
Journal o f forensic science, Vol. 23, 4, 1978, pp. 833 - 844.
VNU JOURNAL OF SCIENCE. Nat., Sci., A Tech.. T.xx. N„2AP., 2004

S T U D Y O N P R O P E R T I E S O F A C ID P H O S P H A T A S E IS O Z Y M E S FR O M
H U M A N S E M E N F O R U S IN G T O F O R E N S IC A N L Y S IS .
L e T ro n g V an, N g h iem X u a n D u n g
M inistry o f Public Security
Do N goc L ie n
D epartm ent o f Biology, College o f Science, V N U
Some properties of acid phosphatase isozymes from hu m an sem en were studied by
gel polyacrylam ide electrophoresis technique and by qu an titativ e analysis. R esults obtained
showed that:
- Activity of ACP from hum an semen was varied widely from 79.4 U.B to 1351 U.B
and has average value to be 538.6 U.B analyzed from th e sem ens of 42 subjects belonging to
three different age groups. The subjects having ACP activity value sm aller th an 200 U.B
were 11.9%.
- S pectrum of ACP isozymes from hum an sem en analyzed by polyacrylam ide gel
electrophoresis w as showed to be five ACP isozyme bands, especially ra p id running
isozymes Ap 1, Ap 2.
R esults showed th a t ACP isozymes from hum an sem en is not stable a t high
tem perature (55"C), b u t ACP activity after for th ree days a t 30 - 35°c room tem perature

was still revealed by polyacrylam ide gel electrophoresis and by other specific biochemical
analysis,