DSpace at VNU: Tinh sạch chất ức chế Trypsin (TI) từ hạt đậu tương (Glycine Max L.)

TAP CHỈ KHO A HOC DH Q G H N , KHTN & CN,

T.xx, sỏ' 4,

2004

TINH SẠCH CHẤT ứ c CHE TRYPSIN (TI) TỪ HẠT ĐẬU TƯƠNG
(G L Y C I N E M A X L.)
P h a n T u â n N g h ĩa , Đ ặ n g Q u a n g H ư n g
K hoa S in h học, Trường Đ ại học K hoa học T ự n h iên , Đ H Q G H N

1. Đ ặ t v ấ n đề
H ạt đậu tương 0Glycine m ax L.) có chứa h ai ức chế try p sin điển h ìn h với khôi lượng
p hân tử 8 kDa và 20 kD a và được gọi tương ứng là c h ấ t ức c h ế B ow m an-Birk và ch ất ức chê
K unitz theo cách gọi của các tác giả lần đầu tiên p h á t hiện và tin h sạch chú ng [2, 4,]. Cho
đến nay các tính c h ấ t của cả hai c h ất ức c h ế này đã được nghiên cứu r ấ t kỹ [1, 6]. Cả hai
chất đều đã được một số h ã n g hoá c h ấ t tin h sạch và sả n x u ấ t làm các protein c h u ẩn cho việc
xác định khôi lượng p h â n tử b ằn g sắc ký lọc gel và b ằ n g điện di. Tuy nhiên, ở Việt N am cho
đến nay chưa có công trìn h nào báo cáo về việc tin h sạch các c h ấ t ức chê này. N ghiên cứu
này n hằm mục đích th iế t lập một qui trìn h tương đôi đơn giản, dề áp d ụ n g đê tin h sạch ch ất
ức chê K unitz (KI), với khôi lượng 20 kDa vốn k h á bền với nhiệt, có h à m lượng tương đôi cao
trong nguồn nguyên liệu bột đậu tương dễ kiếm, giá rẻ để có th ế sử d ụn g n h ư một protein
chuấn cho việc đ á n h giá khối lượng của các protein th a y cho việc n h ậ p ngoại giá cao.
2. N g u y ê n liệ u v à p h ư ơ n g p h á p n g h i ê n c ứ u
2.1. N g u yên liệ u
H ạ t đậu tương (G lycine m a x L.) được m ua từ h à n g h ạ t giống Hà Nội và được định tên
khoa học bới chuyên gia p h â n loại thực vật.
Trypsin của h ă n g Sigma (Mỹ), các protein c h u ẩ n của h ã n g P h a rm a c ia (Thụy điển).
Trypsin-Sepharose được ch ú ng tôi tự tông hợp bằng cách gắn try p sin tin h k hiết của hãng
Sigma vào S epharose 4B đã được h o ạt hoá bằn g B rC N của H ã n g P h a rm a c ia. Các hoá chất
còn lại đều đ ạ t độ tin h k h iế t d à n h cho p h â n tích.

2.2. P h ư ơ n g p h á p n g h iê n cứ u
H oạt độ ức c h ế try p sin (TIA) được xác định theo phương ph áp kh uếch tá n trê n đĩa
thạch và phương p h á p được mô tả trorig [7]. Một đơn vị ch ất ức c h ế tryp sin là lượng c h ấ t ức
chê có k hả năng là m giảm 50% h o ạ t độ của 2 mg try p sin tin h k h iế t trong các điều kiện
p hân tích.
P rotein được xác định bằn g hai phương pháp: đo độ h ấ p th ụ á n h sán g ở vùng bước
sóng 280 nm (A2g0) đối với các p h â n đoạn th u qua các cột sắc ký cột và phương pháp Lowry
[5] sử d ụ n g a lbu m in h u y ế t th a n h bò (BSA) làm ch ất chuẩn.

19


Phan Tuấn NíihTa, Đặng Quang Hưng

20

Điện di trê n

gel

pháp của Laem m li

[3].

polyacrylamid có SDS ( SDS-PAGE) được thực hiện theo phương
Trong toàn bộ nghiên cứu này chúng tôi dùn g nồng độ gel

tách là

12,5% và nồng độ gel cô là 4%.

3. K ế t q u ả v à t h ả o l u ậ n
3.1. C h u ấ n bị d ịc h c h iế t h ạ t đ ậ u tư ơ n g
H ạ t đậu tương được nghiền mịn. 20 g bột nghiền mịn được loại mõ b ằ n g ete etylic
(theo tỷ lệ 1 g bột 5 ml

ete). P h a nổi ở trê n chứa mõ trong ete được gạn bỏ, p h ầ n bột đã loại

mõ được cho làm bav hơi ete ở nh iệ t độ phòng.
Bột đậu tương loại mõ được chiết b ằn g đệm Tris-HCl, 20 mM, pH 7,5 có chứa 50 mM
KC1 (đệm A) theo tỷ lệ 1:5 (khôi lượng:thể tích) trong 1 giò. Dịch đồng th ê được ly tâ m ỏ
14.000 v/ph trong 20 p h ú t ở 4°c. Dịch trê n tủ a được th u lại. Kết tủ a được c hiết lại với cùng
đệm A nhưng theo tỷ lệ 1:3 (w:v) và th u dịch trê n tủ a b ằ n g ly tâm .
3.2. S ắ c kỷ tra o đ ôi ion q u a côt DE-52 cellu lo se
Dịch chiết h ạ t đậu tương của h a i lần được trộn lại và cho lên cột DE-52 cellulose (có
kích thước l,6x 8 cm) đã được cân bằng với đệm A ở trên. Tốc độ lên cột là 20 ml/giờ.
Sau khi cho to àn bộ dịch chiết chảy qua cột, cột được rửa b à n g đệm A cho đên khi
A .,80 của dịch rửa chiết nhỏ hơn 0,005 (khoảng 120 ml) và sau đó được p h ả n hấp th ụ bằng
gradient NaCl từ 0,05-1,0M pha trong cùng đệm A. Tốc độ rử a chiết là 25 ml/giờ vói mỗi
phân đoạn th u là 2ml.
Kết quả cho th ấ y protein và TIA được p h á t hiện ở cả p h ầ n dịch không h ấ p th ụ (phân
đoạn I). Tuy nhiên, qua th ứ nghiệm chúng tôi th ấ y c h ấ t ức c h ế K unitz (Kl) khồng thuộc
p h ân đoạn I nên chúng tôi không tiếp tục tin h sạch KI từ p h â n đoạn này. s ắ c ký đồ của
phần protein hấp th ụ trê n cột (hình 1) cho th ấ y có hai đỉnh protein chính, tro n g đó chỉ đỉnh
thứ n h ấ t được đẩy ra ở nồng độ NaCl từ 0,3 đến 0,5M là có TIA (và được ký hiệu là phân
đoạn II). Còn đỉnh protein th ứ hai được đẩy ra ỏ nồng độ NaCl cao hơn thì không có TIA.
Nhờ loại bỏ được p h ầ n protein không gắn với cột và p h ầ n protein có ái lực cao do đó chê
phẩm KI th u được đã có độ sạch tă n g lên 10,2 lần so với b a n đầu (bảng 1). Kết q u ả SDSPAGE của ph ân đoạn II còn chứa r ấ t nhiều b ăn g protein, tro ng đó có b ăn g với khôi lượng
p hân tử 20 kDa (hình 3).
3.3. S ắ c ký q u a cột lọc g e l S e p h a d e x G-100
Các ph ân đoạn II có TIA của bước sắc ký qua cột DE-52 cellulose được dồn lại, loại

muôi bằng th ẩ m tích, cô đặc đến 2 ml và cho sắc ký qua cột qua cột lọc gel S e p h a d ex G-100
(có kích thưỏc 1x70 cm) đã được cân bằng cùng đệm A. Cột được rử a chiết b ằ n g cùng đệm A
với tốic độ dòng chảy 20 ml/giờ, thu mỗi ông 2,5 ml.

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, KHTN ả CN. T.xx, So 4, 2004


rinh sạch cliàl ức chê Irypsin.

21

Sac ký đồ p h â n đoạn II sau khi qua cột lọc gel có 1 đỉnh pro tein lớn và một vù n g đinh
kéo dài đến ông th ứ 40, tu y vậy chỉ có một đỉnh TIA, ứng với các ông từ 10-22 là có TIA.
N hư vậy bước sác ký lọc gel đã cho phép loại bỏ nhiều protein k hông mong muốn, nhờ đó độ
sạch của ch ế phẩm KI đã được tă n g lên 12,6 lầ n so với b an đ ầu (bảng 1). Tuy vậy, k ế t quả
chạy SDS-PAGE cho th ấ y ch ế phẩm vẫn còn một số b ă n g protein k hác n h a u , chứng tỏ cần
phái được tiếp tục tin h sạch.
3.4. S ắ c ký á i lự c q u a cột T ry p sin -S e p h a ro se 4B.
Đinh TIA từ bước sắc ký lọc gel được th u lại, th ẩ m tích đối đệm A và cho sắc ký qua
cột try psin -sep harose 413 đã được cân b àn g với đệm A có chứa 2 mM CaCl._>. Protein không
hấp thụ và gắn không đặc hiệu được đẩy bằng dung dịch NaCl IM p ha tro n g cùng đệm A.
Phần protein gán đặc hiệu trê n cột được đẩy b ằng d u n g dịch HC1 0,001 M có chứa 2 mM
CaClj. Kết quá ph ản tích cho p h ầ n dịch đẩy bằng NaCl có protein n hư n g không có TIA.
Dịch p hán h ấp th ụ có chứa cả protein và TIA. Độ sạch của c h ế p h ẩ m qua bước này tă n g lên
37,2 lần.
Kết quá p h â n tích SDS-PAGE (hình 3) cho th ấy , ch ế p h ẩ m KI th u được (cột 6 và 8) có
duv n h ấ t một băn g protein với kích thước bằn g 20 kDa, n ằ m đ ún g vị trí của băng c h ấ t ức
chế Kunitz từ đậu tương trê n đường chạy của các protein ch uẩn. K ết quả này chứng tỏ chế
pha 111 Tí thu được là đã tin h sạch. Qui trìn h tin h sạch TI từ đ ậ u tương được tóm t ắ t ở báng
ỉ bao gồm các bước: loại mỡ b ằ n g etylic và chiết b ằ n g đệm Tris-HCl, sắc ký qua cột tra o đối

ion DE-52 cellulose, sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G-100 và sắc ký ái lực qua cột TrypsinSepharose 4B.
4. T h ả o l u ậ n
C h ất ức chê K u n itz (KI) với h o ạ t tính ức c h ế try p sin lần đầu tiên đã được K unitz tách
ra từ h ạ t đậu tương m ột qui trìn h nhiều bước khác n h a u [2]. Sau này F e d u rk in a và Mosolov
111dã p h á t triể n một phương p háp tin h sạch KI từ h ạ t đậu tương r ấ t đơn giản bằng sắc ký
lìấp th ụ miễn dịch, tro n g đó các tác giả đã sử dụng KI thương mại gây k h á n g the k h á n g KI
ỏ thổ và gắn k h á n g th ể th u được lên Sepharose 4B để tạo cột ái lực. Tuy nhiên, bước phức
tạp cua phương p h á p này là phải gây được k h á n g th ê k h á n g KI. Qui trìn h của chúng tôi với
3 bước sác ký phôi hợp ỏ tr ê n là dễ d àn g áp dụ n g với các phòng th í nghiệm hoá sinh thông
thường hiện nay. Qui trìn h cho phép th u được kh o ả n g 6 mg Kĩ từ 20 gam nguyên liệu ban
đẩu. Chê phẩm có độ tin h k h iế t cao, hoàn toàn p h ù hợp với mục đích sử dụng n h ư một
protein c h u ẩ n cho việc đ á n h giá khôi lượng p h â n tử b ằ n g sắc ký h a y điện di. Hơn t h ế nữa,
với hoạt độ riêng 1,17 ĨU /m g protein (bảng 1) và dựa trê n tỷ ]ệ ức c h ế lm ol KI: lm ol trypsin
c ho thây. KI th u được v ẫn giữ nguyên hoạt độ ức chế enzym đích.

Ỉ ỤỊÌ chi Khoa học DIIỌ C Ì/IN . K H IN & CN. T.xx. Sô'4. 2004


0

20

40
60
Sò phán đoạn

80

100

Hình 1: sác ký qua cột DE-52 cellulose dịch chiết hạt đậu tương có chửa chất ức chê trypsin.
Cột có kích thước l,6x8cm được cân bằng với đệm A. Tốc độ rứ a chiết 25 ml/giò, thu
mỗi phân đoạn 2,0 ml
Protein
TIA

«•
X

Hình 2: sắc ký qua cột Sephadex GlOO phân đoạn TI của hạt đậu tương.
Cột có kích thước 1 X 70cm được cân bằng với đệm A. Tốc độ rửa chiết 20 ml/giò, thu
mỗi ph ân đoạn 2,5 ml.

Tạp chí Khoa liọc fíflQ (}ỈIN . K H Ỉ N ấ' CN. 'Ị .XX. So 4. 2004


Tinh sạch chái ức chế trypsin.

23

B ảng 1: Tóm tát qui trình tinh sạch chất ức chê trypsin 20 kDa từ hạt đậu tương
Kết quả tin h sạch
STT

Bước tin h sach
Protein
(mg)
1.125

1 Loại mở b ằn g ete etylic và

chiết bằn g đệm A
Sắc ký qua cột DE-52
2 Đ ỉnh th ứ n h ấ t
3
4

Sắc ký qua cột Sephadex G100 đ ỉn h TIA của côt DE-52
s á c ký qua cột TrypsinS e p h a ro se 4B

2

3

TIA
H oạt độ riêng (đơn
(đơn vị)
vị/ mg protein)
33,28
0,0314

Hệ sô tinh
sạch (lần)
1,00

38,4

12,23

0,318

10,2

23,1
6,4

9,13
7,50

0,395
1,170

12,6
37,2

4
kDa

4 97
4 66
i

45

4 30

ém ằầ

< 20

4 14

H ình 3: Điện di gel polyacrylamid 12,5% có SDS chế phẩm chất TI từ đậu tương
1: Dịch chiết hạt đậu tương, 2: Đinh TIA thu từ cột DE-52, 3 và 4: đỉnh TIA thu từ cột
Sephadex G-100, 6 và 8: Chế phẩm TI thu từ cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharose 4B, 7:
Các protein chuẩn bao gồm: Phosphorylase B, albumin huyết thanh bò, ovalbumin,
cacbonic anhydrase, chất ức chê trypsin (KI) đậu tương và lactalbumin.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Fedurkina. N. V. and Mosolov.V.V.,
Purification of soy bean trypsin
immunoabsorption, Applied Biochem. and M ic r o b io l20(1984), 452-457

inhibitor by

2.

Kunitz. M, Crystalline soy bean trypsin inhibitor II. General properties, J
30(1947), 291-310

Gen Physiol

I tip chi Khoa hục DHQCiHN . K H IN & CN, T.XX, So 4, 2004


24

Phan Tuấn NiihTa, Đạiìii Qiumu. Hưim

3.

Laemmli. U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, 227(1970), 680-685

4.

Laskowski. M. Jr. and Kato. I.. Proteinase inhibitors of proteinases, A nna. Rev. Biochem ,
49(1980), 593-676

Õ.

Lowry. O.H., Rousenbrough. N.J., Farr. A.L., Randall. R.J., Protein
the Folin phenol reagent, J. Biol. C h e m 193(1951), 265-275

6.

Park. D.S., Gramham. M.Y., Graham. T.L., Identification of soybean elicitation competency
factor, CF-1, as the soybean Kunitz trypsin inhibitor. Physiol. Mol. Plant P a t h o l 59(2001),
265-273.

7.

Phan. T.N. and Pham. T.C., Trypsin inhibitors in developing seeds oỈ M omordica charantia
L., Proc. N atl Center Sci. Res. V i e t n a m 2(1990), 129-137.

VNU. JO URNAL OF SCIENCE. Nat., S c L & Tech.,

T.xx,

m easurem ent with

N04, 2004

P U R IF IC A T IO N O F T R Y P S I N IN H IB IT O R (TI) F R O M S O Y B E A N S
(G L Y C IN E MAX L.)
P h an Tuan N ghia and D ang Q uang H ung
D epartm en t o f Biology, College o f Science, V N Ư

A protocol for purification of the soybean trypsin inhibitor (SBTI) or K un itz inhibitor
(KI) h a s been reported. The ground powder was extracted with ethylic e th e r to remove fat,
then resu spen ded a n d m agnetically stirre d in 20mM Tris-HCl buffer, pH 7.5 co n tain in g 50
mM KC], followed by cen trifu gatio n to collect the clear s u p e r n a n ta n t fluid. T h e e x tra c t th en
u n d erw en t 3 steps of purification: i) anion exchange column c h ro m a to g ra p h y on DE-52
cellulose, ii) gel filiation on Sephadex GlOO and iii) affinity c h ro m a to g ra p h y on TrypsinSepharose 4B. The obtained TI p re p a ratio n contained only a single protein of a m olecular
w eight of 20 kDa

as shown at the sam e position of

th e s ta n d a rd KI pre sen t in the

molecular weight m a rk e rs on SDS-PAC tE. The protocol allows to obtain

6.4 mg KI from 20

g of soybean ground powder and the purification factor of the KI a fte r the 4 step s increased
37 fold.

Tạp chi Khou học ĐHQGHN. Kin N & CN. I .XX. So 4. 2004