Chiết tách, tinh chế concanavalin a từ hạt đậu rựa ( canavalia ensiformis l fabaceae ) ở việt nam và nghiên cứu ứng dụng

BỘ Y T Ế
TRƯỜNG ĐẠI HỌC

Dược HÀ NỘI

BÀO THỊ MAI ANH

CHIẾT TÁCH, TINH CHÊ CON CANAVALIN A
Từ HẠT ĐẬU RỰA

[CANAVAUA ENSIFORMISL. FABACEAQ ở ViỆT NAM
VÀ NGHIÊN CỨU ÚNG DỤNG
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ KHOÁ 1996-2001

- Người hướng dẫn: TS. Đào Kim Chỉ
ThS. Nguyễn Văn Lợi
- Nơi thực hiện

: Bộ mơn Hố sinh
Tnrờng ĐH Dược Hà Nội

- Thời gian thực hiện : 3/2001- 5/2001

Xk -J t /
HÀ N Ộ I-2001

/X 51

r

kỉ. 445

PU-LI


LỜI CẢM ƠN

(?H/ riti

tớ íịttự. h iĩt on í ít lí iắíi tó i QỉtS.

JCi,n @ít i ồ

£7//cV. Q íạitự ễn (Z)ản Múi, n ỉtử m / n ạ u ổ i đ ã tậ n tìn h ỉm ó tiụ đ ẫ n , L hu ụ êti

k h íc h ĩtẻ ịtụ aìètt etn tttìtiụ iu â t ụ itá trìn h etti llitic ítièit ếtề tà i này,.

S tn /tin eỉtân th à n h tuítn ổti f p ( ịé ỉ.í J&. ^i)ẫ Qlạoe M iên tm ổ n ụ fí)ụ ì
x
Tĩùtìíi X íto a IttUi t ư a h ỉêtt thuồtt htítìti(J fi)ạ ì Tỉùtìe ÍÌỊiiếe. ụ ia lỉù à QLơỉ,
ttg n ị t i f ã ỉiiâii (Ịiiait tà m ií háo ồ itì em n h iề n lị Ui (ill quý. (ĩúu.

ố m íiũnụ .vin eft à ti th à n h (Ítítn đti (Ị)(Ậeà ttụ to à n th ẻ ấíi thầy, ạlátì (tờ (jiáo, eồ f/)ltạ m Q'Uunh

úă íí eô

Uĩj ỉlm ã t viên h o ta j ^iiỗ m ồ n Jơe)á sìn h ^ y ù ị iiụ ifJili hoe ^Dưđe. Jơ à ( íítìi
(tã n ítiê t tìn h ụỉÚỊt đỏ ồ tạo íTiềít Uiêti th u íịn tời itì em trũttự iu ồ t lliằ ì
t/ỉíin hoe. itỉ/i i)ù h tìà n th à n h tố iítíĩti tế t m jỉtìê ịi.

Tỉơà n ỗ i, ttninij. 5 tiù n i 2 0 0 í

S in h oỉêtt
fjẾ)àờ 07* /.///«/ c/ỉnh


MỤC LỤC
Phần I . Đặt vấn đ ề ......................................................................................................1
Phần II . Tổng quan....................................................................................................3
2.1. Sơ lược về lectin............................................................................................. 3
2.1.1. Tình hình nghiên cứu leclin trên thế giới và ở Việt Nam.................. 3
2.] .2. Các tính chất của lectin....................................... .......... ................. 5
2.1.3. Các phương pháp tinh chế lectin........................................................ 10
2.1.4. ứng dụng của lectin............................................................................. 12
2.2 . Vài nét về Con canavalin A và cíiy đậu rựa (Canavalia ensifonnis
Fabaceae)........................... ................................................................................. 14
2.2.1. Con canavalin A .................................................................................. 14
2.2.2. Cây đậu rựa (Canavalia ensiformis L. Fabaceae)............................ 17
2.3. AFP......... ...... ................................................................................................ 17
Phần III. Thực nghiệm và kết q u ả ......................................................................... 22
3.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiêm.........................................22
3.1.1. Nguyên liệu.............................. ............ ...................................... ......22
3.1.2. Hóa chất và thuốc thử.......................................................................... 22
3.1.3. Thiết bị và máy móc.............................................................................23
3.1.4. Phương pháp nghiên cứu..................................................................... 24
3.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xél...............................................................29
3.2.1. Nghiên cứu khả năng gây ngưng kếl hồng cầu của lectin trong dịch
chiết thô............................................................................................................ 29
3.2.2. Khảo sát sự phân bô của lectin trong hạt đậu rựa (Canavalia
ensiformis)....................................................................................................... 30

3.2.3. Giai đoạn tách chiết ConA .................................................................. 31
3.2.4. Giai đoạn kết tủa protein - lectin........................................................ 33
3.2.5. Giai đoạn tinh chế lectin đậu rựa bằng phương pháp sắc ký ái lực
trên cột Sephađex G 7 5 ................................................................................... 37
3.2.6.Tóm tắt q trình tách chiết và tinh chế C onA .................................40
3.2.7.
Kết quả điện di trên gel polyacrylamid.......................................40
3.2.8. Sử dụng lectin đã tinh sạch để tinh chê AFP huyếl thanh bệnh nhân
UTBMTBG.......................................................................................... .......... 41
3.3. Bàn luận....................................................................................................... 44
Phần IV. Kết luận và đề x u ấ t.................................................................................46
Tài liệu tham khảo................................................................................................... 47


CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

aa
ACD
AFP
AIDS
BSA
CD
CM
Con A
Da
DEAE
ELISA
ELLA
HĐR
HĐTS

HAA
HIV
Ig
OD
PBS
Pi
SDS
TBS
TEMED
UTBMTBG

acid amin
Citrate dextro acid
Alpha -- Fetoprotein
Acquired Immuno deficiency Syndrome
Bovine serum albumin
Cluster of differentiation
Carboxy methyl
Concanavalin A
Dalton
Diethyl amino ethyl
Enzym-Linked-Irnrminosorbent-Assay
Enzym-Linked-Lectinosorbent-Assay
Hoạt độ riêng
Hoạt độ tổng số
Haemato agglutinating activity
Human Immunodeficient Virus
Immuno globulin
Optical density
Phosphate buffered saline

Protein
Sodium dodecyl sulfale
Tris buffered saline
Tetra-methylen-diamin
ưng thư biểu mô tế bào gan


PHẦN I . ĐẶT VẤN ĐỂ
Những chất có hoạt tính sinh học như enzym, hormone, vitamine, kháng
sinh ... có vai trò quan trọng đối với đời sống con người trong nhiều thập kỷ
qua. Lectin cũng là những chất có hoạt tính sinh học đặc biệt. Goldstein và
cộng sự đã định nghĩa: “Lectin là những protein hoặc glycoprotein khơng có
nguồn gốc miễn dịch nhưng có khả năng liên kết với đường hoặc nhiều loại
hợp chất chứa đường, có khả năng ngưng kết nhiều loại tế bào”[28,31]. Mức
độ phân bố rộng rãi trong sinh giới và khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
(nơng nghiệp, sinh hố, huyết học, tế bào học, miễn dịch học, y-dược học ...)
là lý do để thuật ngữ lectin, sau hơn 100 năm kể từ khi ricin (lectin đầu tiên)
được tìm ra( 1888)[31], trở nên quen thuộc và thu hút sự quan tâm, chú ý của
các nhà khoa học trên thế giới.
Trong sơ các leclin thì Concanavalin A (CotiA), lectin của cày đậu rựa
(Cơnavaỉia ensiformis), là lectin Ihực vật được biết đến rộng rãi nhất. Các lính
chất sinh học điển hình của Con A khiến nó trở thành loại lectin thực vật được
nghiên cứu nhiều và kỹ lưỡng nhất. Một khối lượng đồ sộ các cơng trình, các
báo cáo khoa học về Con A đã ra đời cung cấp cho chúng ta những hiểu biết
khá đầy đủ về cấu trúc cũng như các đặc tính lý hố của nó . Đặc biệt, tiềm
năng ứng dụng của ConA là vô cùng to lớn. Ngay lừ đẩu thế kỷ 19 ConA đã
được biết đến như một công cụ hữu hiệu dùng trong nghiên cứu sinh dược học
đo khả năng tương tác đặc hiệu với nhiều hợp chất sinh học chứa đường quan
trọng như các ĩg, tRNAAsp, AFP ....Cấu trúc, vai trò của những hợp chất này
đối với cơ thể đến ngày nay vẫn còn là một đề tài hãp dẫn và những thông tin

về chúng đã giúp các nhà khoa học rất nhiều Irong chẩn đoán, theo dõi các
bệnh lý liên quan . Ở nồng độ thấp Con A có khả năng gây ngưng kết tế bào
ung thư do đổ kìm hãm sự phát triển của lế bào ung Ihư. ConA kích thích sự
phân bào của các tế bào lympho (tế bào T), tăng cường khá năng miễn dịch
[27].


Con A cũng được sử dụng như một chất mang, dãn thuốc tới các tế bào
đích. Gần đây, Con A cịn dược sử dụng dể phát hiện sớm, chính xác HIV,
virus gây đại dịch AIDS [30]. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật,
tiềm năng ứng dụng của Con A vẫn đang được tiếp tục khai thác để phục vụ
tốt hơn cho đời sống con người.
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu lectin vãn đang còn ở nlũrng chặng đường
ban đầu, tuy nhiên những kết quả thu được là rất khả quan : lectin có rất phổ
biến trong các cơ thể động, thực vật Việt Nam, đặc biệt lectin thuộc họ đậu
(Fabaceae) và họ đâu tằm (Moraceae) là đáng chú ý hơn cả.
Để có thể cung cấp mộl lượng chế phẩm lectin có độ linh sạch cao dùng
cho việc nghiên cứu ứng dụng trong y-dược, góp thêm dần liệu khoa học về
tiềm năng to lớn của các lectin có nguồn gốc nội địa, chúng tôi tiến hành dề
tài “ Chiết lách và tinh chế Con A từ hạt đậu rựa Canavalia ensiformis ở Việt
Nam và nghiên cứu khả năng ứng đụng ” với các mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu áp dụng phương pháp sắc ký ái lực để tinh chế Con A chiết
tách từ cây đậu rựa (Cơnavalia ensiformis ) Việt Nam.
2.

Kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm lectin thu được bằng phương pháp điện
di trên gel polyacrylamid (PAGE) có SDS và 2- Mercaptoethanol.

3.

Sử đụng chế phẩm lectin tinh sạch thu được để thử tinh chế AFP từhuyết
thanh của bệnh nhân ung Ihư biểu mô tế bào gan.

2


PHẦN IT . TỔNG QU AN
2.1. S ơ LƯ Ợ C VỂ L E C T IN

2.1.1. Tình hình nghiên cúu lectin trên th ế giỏi và ở Việt Nam
•

Định nghĩa lectin.
Thuật ngữ lectin bắt nguồn từ lectus, dạng quá khứ của động từ ỉegere,

trong tiếng latin có nghĩa là lựa chọn. Chính vì thế, năm 1954, Boyd và
Shapleigh đã sử dụng thuậl ngữ này để chỉ một nhóm các ngưng kết tố thực
vật mà một số trong đó có khả năng ngưng kết đặc hiệu nhóm máu [28]. Đây
có thể coi là định nghĩa đầu tiên về lectin.
Do việc lìm ra nhiều prolein có khả năng liên kết đường ở nhiều loài khác
trong sinh giới (vi khuẩn, cá, ốc sên...), năm 1977, Ashwell đã mở rộng thuật
ngữ lectin chỉ cả những protein liên kết đường từ các nguồn khác nhau chứ
khơng phải chỉ từ thực vật, chúng có thể ở dạng hoà tan hoặc liên kết trên
màng [28].
Năm 1980, Goldstein và cộng sự đưa ra định nghĩa:’’Lectin là những
protein hoặc glycoprotein khơng có nguồn gốc miễn địch nhưng có khả năng
liên kết với đường hoặc nhiều loại hợp chất chứa đường, có khả năng ngưng
kết nhiều loại tế bào”. Định nghĩa này đã được Ủy ban về danh pháp quốc tế
cơng nhận, và có hàm ý lectin là đa hố trị vì chúng phải có ít nhất hai vị trí
liên kết đường để có thể gây ngưng kết tế bào động vật và thực vật, hoặc làm

kết tủa các polysaccarid, glycoprotein, peptidoglycan, và glycolipid [28,31].
•

Nghiên cứu Iectin trên thế giới
Kể tờ khi Stillmark phát hiện ra khả năng gây ngưng kết tế bào hồng c;ìu

người và một số động vật của dịch chiết hạt thầu dầu (Ricinus communis)
(1888) đến nay đã hơn 100 năm. Lịch sử nghiên cứu lectin có thể chia làm 3
thời kỳ chính:
T ừ cuối th ế kỷ X ỈX đến đầu th ế kỷ XX: Đây là giai đoạn mang tính
điều tra cơ bản về lectin trong giới sinh vật. Ngồi các cơng trình nghiên cứu

3


lectin có nguồn gốc thực vật cíia Slillmark (1888), Heỉlin (1891), Lansteinner
(1902), Lansteinner và Raubischeck (1903), cịn có các cơng trình của Mendel
(1909), Kobert (1913) ... trên đối tượng là độngvật, Ludiwing và Kraus
(1902), Kayser (1903), Guyot (1908) trên đối tượng là các loài vi khuẩn. Điều
đổ chứng tỏ sự phân bố rất rộng rãi của lectin trong sinh giới .
Từ 1950 đến 1970: Trong hai thập kỷ này bên cạnh các cơng trình mang
tính điều tra về sự phân bố của lectin, phần lớn các nhà khoa học đã tập trung
tinh chế lectin để nghiên cứu về cấu trúc, ảnh hưởng của mơi trường đến hoạt
tính của leclin, trên cơ sở đó tìm cách sử dụng lectin để phục vụ đời sống con
người. Có nhiều phương pháp đã được sử dụng nhưng phương pháp chủ yếu là
phương pháp sắc ký như sắc ký Irao dổi ion, sắc ký lọc gel... . Đặc biệt, sắc ký
ái lực lần đầu tiên dược sử dụng vào năm 1965 đã lập tức chứng tỏ rằng đó là
một cơng cụ tinh chế lectin có hiệu quả, cho chế phẩm có độ tinh sạch cao.
Đến nay kỹ thuật này vãn được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới.
Từ 1970 đến nay: Trong giai đoạn này, tiến độ nghiên cứu lectin được

đẩy nhanh. Nhiều kết quả thú vị đã được cơng bố: tìm thấy lectin ở nấm nhầy
(Rosie-1974, Baronđes và Haynoođ-1979), ở trong cơ thể người (Chilads
Feizy-1979, Franklin-1980, Powell-1980) [31]. Lectin từ các cá Ihể có quan
hệ gần gũi có cấu tạo phân tử và đặc tính sinh học khá giống nhau (Soni-1982,
Willy-1984)...[2]. Đặc biệt ứng dụng của lectin là hướng nghiên cứu được
nhiều nhà khoa học quan tâm. Nổi bật trong số dó là: lợi dụng khả năng kích
thích sự phân chia của các tế bào bạch cẩu người của led in lừ đậu thận đỏ
(Phaseolus vulgaris) hay khả năng phân tách bạch cầu và tế bào ung thư máu
của lectin từ huyết thanh của loài sam biển châu Mỹ (Limulus polyphemus) để
phục vụ cho những nghiên cứu y học và miễn dịch học [2,27]; sử dụng kha
năng tương lác đặc hiệu của lectin Con A với AFP, một dấu ấn ung thư của
một sô bệnh ung thư, làm phương liộn chẩn đoán ung lliư [27]; nghiên cứu
hiến các cỉạng lectin của một số lồi mít có khả năng kích thích phân chia tế
bào lympho T -C D / ở người và lectin từ hạt mít mật (Arlocơvpus
heterophỊus) có khả năng tương tác với glycoprotein CD4 ở bề mặt tế bào
lympho T ở người là phân tử kết hợp đặc hiệu với virus HIV trong pha nhiễm

4


bệnh đầu tiên của sự suy giảm miễn địch (AIDS), thành những loại thuốc hĩru
hiệu trong điều trị và chẩn đoán căn bệnh thế kỷ này [39]. Chúng ta tin tưởng
rằng, với sự nỗ lực của các nhà khoa học trên thế giới, trong mội tương lai
khổng xa chắc chắn nhiều giá trị thực tiễn đích thực của lectin sẽ được khẳng
định.
•

Nghiên cứu lectỉn ở Việt Nain
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu lectin đã được triển khai và mở rộng gần 20

năm nay (từ năm 1983) và dược tiến hành theo 3 hướng cơ bản: điều tra sự
phân bố của ỉectin; chiết tách, tinh chế và nghiên cứu tính chất, cấu trúc lectin;
nghiên cứu ứng dụng.
Tuy Ihời gian chưa dài, nhưng những cơng trình nghiên cứu này cũng đạt
được một số kết quả nhất định:
-

Điều tra và khẳng định sự có mặt khá phổ biến của lectin trong các
lồi động thực vật à nước ta [2,6,15].

- Nghiên cứu và hoàn thiện phương pháp chiết tách, tinh chế và nghiên
cứu lính chất, cấu trúc phân tử của nhiều loại lectin có nguồn gốc nội
địa [2,5,11,12],
- Bước đầu đưa một số lectin vào sử dụng trong thực tế: chẩn đoán thai
sớm [2], tinh chế IgA, và nghiên cứu sự biểu hiện bệnh lý của chúng ở
người [9], chẩn đoán bệnh nhiễm sán máng [10].
Triển vọng trong tương lai số lượng lectin tinh chế ở Việt Nam sẽ nhiều
hơn và được sử dụng rộng rãi hơn trong các lĩnh vực khác nhau của y, sinh
dược học.
2.1.2. Cấc tính chất của lectin
•

Tính chất hố lý
- Khối lương phân tử
Các phương pháp sàng lọc phân tử, điện di trên gel polyacrylamicl,

siêu ly tam... cho thấy khối lượng phân tử của leclin rất khác nhau, dao động
từ vài nghìn Da (leclin của rễ cây gai (Urticaceơe)- 8.500 Da) đến vài trăm
nghìn Da (lectin của sam biển ch Au á (Tachypleus triđentatus 700.000 Da).

5


Người ta khơng tìm thấy mối liên hệ nào giữa khối lượng phân tử và hoạt tính
của lectin. Khối lượng phân tử của lectin khơng mang tính đặc trưng cũng như
khơng phụ Ihuộc vào mức độ tiến hố của lồi hay cá thể.
Do phân tử lectin có thể cấu tạo từ nhiều tiểu đơn vị nên khối lượng phân
tử của chúng phụ thuộc rất nhiều vào cấu trúc không gian. Các yếu tố làm thay
đổi cấu trúc không gian của lectin như pH, dung địch urê nồng độ cao, clorua
guaniđin đều có thể ảnh hưởng đến khối krợng phân tử lcclin. Con A ở pH
trung tính có cấu trúc tetramer với phân tử krợng bằng 102.000 Da, nhưng ở
pH < 6 cấu trúc tetramer bị phân ly thành các đimer có phân tử lượng bằng
51.000 Da [28],
-

Tính tan

Lectin có khả năng hoà tan trong nước. Đặc biệt, lectin dễ tan trong mơi
trường muối lỗng, vì vậy trong các qui trình tinh chế người ta thường sử dụng
các dung dịch đệm chứa muối ở nồng độ sinh lý làm dung môi chiết rứt. Do
bản chất protein nên lectin dễ bị kết tủa dưới tác dụng của: aceton, alcol ở
nhiệt độ thấp; một số muối trung tính nồng độ cao và muối kim loại nặng.
Muốn kết tủa thuận nghịch lectin, cách tốt nhất là dùng muối amonisulfat
V đây là muối dễ tan, khơng ảnh hưởng đến hoạt tính lectin và dễ loại bỏ
I
trong quá trình tinh chế. Aceton cũng được sử dụng để kết tủa lectin nhưng
phải được tiến hành ở nhiệt độ thấp vì dễ làm biến lính leclin.
-

Khả năng tươm tác với đường

Khả năng tương tác với dường là một trong những tính chất điển

hình của lectin. Lectin liên kết với cả phân tử đường đơn lẫn các gốc đường
nằm trên bề mặt tế bào. Các loại đường nliư glucose và glucosatnin, ealactose
và galactosamin, fucose, manose... cổ khả năng lương lác với nhiều loại lcclin.
Về bán chất của (ương tác giữa lectin với đường có lất nhiều giá thuyết,
tuy nhiên các nhà khoa học đều Ihống nhất rằng: sự bền vững của phức hợp
lectin-đường dược duy trì bởi cả liên kết phân cực (liên kết hydro giữa các
nhóm OH của đường với các đầu phân cực của các gốc aminoacid trên phan tử
lectin) lẫn liên kết không phân cực hay liên kết không gian (liên kết bằng lực
Vander-Walls) [28]. Liên kết khơng gian có thể có liên quan đến tính đặc

6


hiệu với đường của chúng. Điều này phù hợp với phát hiện của Mankela: sự
khác biệt trong cấu trúc không gian ở vị trí C3, C4 của các loại đường trong
thành phần các loại ỉectin là nguyên nhân dẫn tới lực hố học khác nhau của
chúng với các loại đường [28].
Khả năng tương tác đặc hiệu của iectin với đường đã được ứng dụng nhiều
trong các nghiên cưú (ế bào học, huyết học và miễn dịch học. Đặc biệt gđn
đây khả năng này được ứng dụng để tinh chế nhiều dạng lectin. Cũng từ đó
sắc ký ái lực lectin được sử dụng để tinh chế nhiều glycoprotein có chức năng
sinh học.
•

Đặc tính sinh học của lectin
-

Khả n ă m m v mưng kết tế bào

Ngưng kết tế bào là đặc tính sinh học điển hình của lectin. Dựa vào

đó người ta phát hiện sự có mặt của lectin ở đối tượng nghiên cứu. Đặc tính
này cịn giúp phân biệt lectin với những hợp chất sinh học cũng có khả năng
tương tác với đường như glycosiđase và glycotransfera.se...
Để có thể gây ngưng kết tế bào, lectin phải tạo ra được rất nhiều cầu nối
giữa các tế bào bị gắn kết. Tuy nhiên khả năng ngưng kết không chỉ phụ thuộc
đơn thuần vào lượng lectin mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính phân
tử của leclin (số trung tâm liên kết đường, kích Ihước phân lử...), (lặc tính
màng (số lượng receptor, thể chất màng, tình trạng trao đổi chất của màng...)
. Bên cạnh đó các yếu tố bên ngồi như: nhiệt độ, nồng độ tê bào, mức
độ trộn lằn... cũng ảnh hưởng đến khả năng ngưng kết [26].
Hồng cầu là loại tế bào đầu tiên được phát hiện có khả năng ngưng kếl với
lectin (Stillmark-1888). Hầu hết lectin đều có khả năng ngưng kết hồng cẩu
người, trong đó số lectin đặc hiệu nhóm máu rất ít. Một số lectin có khả năng
ngưng kết hồng cầu của các động vật khác như: thỏ, cừu... [31].
Sự khác biệt giữa khả năng liên kết của lectin với tế bào bình thường và tế
bào ung thư, với tế bào non và tế bào trưởng thành, với tế bào đang phân bào
và tế bào ở giai đoạn nghỉ (Burger-1973, Nicolson-1967) đã thu hút sự đặc
biệt quan tâm của các nhà khoa học.

7


Không chỉ gãy ngưng kết tế bào động vật, lectin còn gây ngưng kết tê bào
vi khuẩn, nấtn, sinh vật đơn bào và các bào quan (ty thể).
Khả năng ngưng kết tế bào của lectin có ý nghĩa lớn trong y học và miễn
địch học.
-

Khả nâng kích thích và kìm hãm phân bào
Kích thích phân bào cũng là một clặc tính quan trọng của leclin

mang lại nhiều ứng dụng thực tiên. Loại tế bào mà lectin kích thích piiíìn bno
mạnh nhất là tế bào lympho. Leclin xâm nhập vào cơ thể có tác dụng như
những kháng ngun kích thích sự phãn chia các tế bào lympho, do vậy chúng
có ý nghĩa trong tăng cường đáp ứng miễn dịch.
Ngoài tế bào lympho người, lectin cịn có khả năng kích thích sự phân
chia của nhiều loại tế bào khác như lế hào bình thường và tế hào phơi già... .
Cơ chế của sự kích thích phân bào vản chưa được làm sáng tỏ. Có ý kiến
cho rằng saccarid trên màng tế bào là yếu tố kìm hãm sự phân chia tế bào. Khi
lectin gắn vào các saccariđ này, sự kìm hãm bị phá vỡ nên khả năng phân chia
tế bào dược tăng lên. Tuy nhiên luận điểm nay chưa đủ sức thuyết phục vì
nhiều lectin cổ khả năng liên kết với các phân tử saccarid trên bề mặt màng
mà vẫn khổng có khả năng kích thích phân bào. Những phát hiện gần đây về
những glycoprotein màng tế hào chỉ liên kết chọn lọc với những lectin cổ khíĩ
năng phân bào (Dillner-Centerlind và cộng sự -1980) dã gợi ý cho các nhà
khoa học về khả năng tồn tại của những receptor màng dặc hiệu với led in
phân bào [26].
Những phát hiện về khả năng kích thích phân bào của lectin được sử dụng
có hiệu quả trong y học và miễn dịch học để nghiên cứu: các biến đổi sinh hố
trong q trình thúc đẩy tế bào từ trạng thái nghỉ sang trạng thái hoạt động
(phân chia tế bào tích cực và đáp ứng miễn dịch), sự bất thường của các nhiễm
sắc thể và các bệnh lý khác ở người [15].
Bên cạnh đặc tính trên, một số lectin lại có khả năng ức chế, kìm hãm sự
phân chia tế bào. Với tế bào ung thư lectin có khả năng kìm hãm sự phát
triển và lây lan của chúng. Brucke đã giải thích cơ chế đó như sau: các phân lử
lectin xâm nhập vào tế bào chủ, tác động đến phân tử ADN, khởi động cho sự

8

tổng hợp Interferon. Interferon từ lế bào chủ được tiết ra xâm nhập vào tế bào
ung thư và ức chế sự phát triển của khối u[2,l 1].
-

Mơt sơ đăc tính sinh hoe khác
Ngồi nhũng đặc tính sinh học nêu trên, lecũn cịn có một số tính chất

sau [26] :
+ Sản sinh những tế bào ức chế.
+ Làm trung gian trong q trình tiêu diệt tế bào đích của lympho bào và
đại thực bào.
+ Thúc đẩy quá trinh thực bào nấm và vi khuẩn của đại thực bào.
+ Có tác dụng tương tự insulin trên các tế bào mỡ.
+ Độc đối với tế bào và động vật.
+ Tham gia phản ứng giải phóng tiểu cáu.
+ ức chế sự thụ tinh của trứng.
+ Tương tác với hormone rau Ihai.
+ ức chế giải phóng Histamin từ các tế bào Mast và tế bào ưa kiềm.
+ ức chế sự phát triển của nấm.
•

Các yếu tơ ảnh hưởng đến hoạt tính lectin
-

Ảnh hưởng của p ỉí
Có hai giá trị pH cần được quan tâm trong q trình tinh chế lectin

đó là pH đẳng điện và pH lối thích.

pH đẳng điện là giá trị pH mà ở đó lectin tồn tại dưới dạng ionlưỡng tính
trung hồ về điện và không di chuyển trong điện trường. Ở pHnày lectin dễ hị
tủa và có hoạt tính nhỏ nhất.
PH tối thích là vùng pH mà trong đó hoạt tính lectin được thể hiện tối đa.
ở môi trường kiềm mạnh hoặc acid mạnh hoạt độ lectin giảm rõ rệt hoặc
mất hồn tồn.
-

Ảnh hưởng của nlĩiêt đơ
Do bản chất là protein, lectin chịu ảnh hưởng của nhiệt độ. Đa sô

lectin bị mất hoạt tính ở nhiệt độ cao do bị biến tính khơng thuận nghịch. Vì
vậy nhiệt độ được coi là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu lectin, ở

9


nhiệt độ thấp hoạt tính của lectin giảm. Nếu nhiệt độ lăng dẩn lên thì hoạt độ
lectin cũng tăng dần và đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp.
-

Ảnh hưởng của đường đơn
Các loại đường đơn có ảnh hưởng tới hoạt tính ngưng kết tế bào của

lectin, đó là vì khi có mặt phân tử đường, trung tâm liên kết hydratcarbon của
lectin bị phong toả làm cho nó khơng thực hiện được liên kết với các receptor
trên bề mặt tế bào đo đó tế bào khơng bị ngưng kết [2].
-

Ảnh hưởng của enzvm

Các enzym có khả năng biến đổi tính chất của màng tế bào có thể

gây ra nhũng tác động đến khả năng ngưng kết tế bào của leclin.
Một số enzym có khả năng làm tăng hoạt tính lectin như Trypsin,
papain... . Khi xử lý hồng Cíìu hằng các enzym này, một số protein trcn màng
hồng cầu sẽ bị Ihuỷ phân làm bộc lộ rõ các receptor có bản chất là
glycoprotein, giúp lectin gắn vào màng tế bào hồng cầu dễ dàng hơn.
Trái lại, một số enzym lại làm giảm hoặc mất hoạt lính của lectin. Xử lý
hồng cầu người bằng galactose oxidase làm khả năng gây ngưng kêì của lectin
đậu tương giảm xuống rõ rệt [26].
-

Ảnh hưởns. của ion kim loai
Một số ion kim loại cũng ảnh hưởng đến hoạt độ lectin. Trong nhiều

thí nghiệm, khi có mặt một loại ion kim loại nào đó, hoạt độ leclin sẽ giảm
xuống hoặc tăng lên. Ảnh liưởng của chúng khá phức tạp và hầu như khơng
theo quy luật. Có những ion kim loại ở nồng độ cao thì kìm hãm hoạt độ
lectin, nhưng ở nồng độ thấp lại tăng hoạt tính của chính lectin đó- Trong một
số trường hợp khác đối với cùng một loại ion kim loại và ở cùng mội nồng độ,
với đạng lectin này thì kìm hãtn hoạt độ nhưng với dạng lectin khác lại làm
tăng hoạt độ lên nhiều lẩn.
2.1.3. Cắc phương pháp tinh ch ế lectin
•

Sắc ký ỉọc gel
Đây là phương pháp lách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa trên kích

thước phân tử. Chất giá thường được sử dụng là Sephađex. Mỗi hạt vSephadex

10


có bản chất là polysaccarid liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗ lưới xốp. Có
nhiều loại Sephadex, trong đó inỗi loại có mức độ liên kết khác nhau tạo nên
kích thước của lỗ xốp khác nhau. Mức độ liên kết quyết định khả năng tách
các chất. Để tinh chế lectin, người ta thường dùng loại Sephadex G75 và
Sephadex G I00. [17,37]
Phương pháp sắc ký lọc gel còn được dùng để xác định khối lượng phân
tử của chất cần tách.
•

Sắc ký trao đổi ion
Lectin có bản chất protein nên phân tử của nó mang điện tích. Tuỳ thuộc

vào pH của mơi trường mà lectin mang điện tích dương hoặc âm. Lợi dụng
tính chất này người ta sử dụng CỘI sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin. Các
chất nhựa gắn các ion như DEAE-Sephađex, DEAE-Cellulo.se dược sử dụng
làm chất trao đổi lectin-anỉon. Các chất nhựa gắn các ion như CM- Sephađex,
CM- Cellulose được sử dụng làm chất trao đổi lectin-cation. Mỗi chất, trao đổi
ion đều có khả năng trao đổi một lượng ion nhất định gọi là dung lượng trao
đổi [17,24],
•

Sắc ký ái lực [17; 23; 35]
Nguyên tắc của phương pháp nầy dựa trên khả năng kết hợp đặc hiệu của

lectin với một phân tử khác gọi là chất kết hợp (ligand). Chất kết hợp được gắn
trên một chất giá tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký. Chất giá hay được sử dụng là
một số loại gel như Sepliadex, Sepharose, Sephacryl... . Quá trình sắc ký đirợc

tiến hành qua ba giai đoạn:
-

Gắn ỉectin lên cột: Ở giai đoạn này lectin kết hợp đặc hiệu với chất kết
hợp và được giữ lại trên cột.

-

Rửa cột: Ở giai đoạn này các protein khơng có ái lực với cột và các
protein thừa sẽ bị đẩy ra khỏi cột.

-

Giải hấp phụ lectin ra khỏi cột: Dùng một dung dịch đẩy có ái lực hố
học phị hợp để đẩy lectin ra khỏi cột.

Sắc ký ái lực được sử dụng dể tinh chế lectin lần đầu tiên vào năm 1965
[28]. Cho đến nay kỹ thuật này vẫn được sử dụng có hiệu quả để tinh chê


nhiều loại lectin vì kỹ thuật tinh chế đơn gián mà lại cho chê phẩm lectin có
độ tinh sạch cao.
2. ĩ .4. ứng dụng của lectin
Lectin đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau
của đời sống. Các ứng dụng đó có thể được tóm tắt như sau :
• Trong huyết học: sử dụng lectin để phân loại nhóm máu là ứng dụng sớm
nhất và đến nay vãn còn được áp dụng rộng rãi. Phương pháp xác định
nhóm máu bằng lectin cho kết quả nhanh chính xác. Tuy nhiên phương
pháp này địi hỏi lectin phải tinh sạch và có tính đặc hiệu cao.
•

Trong lố bào học: Lectin được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để
nghiên cứu cấu trúc màng tế bào và màng các bào quan, sắc ký lectin
(Lectin chromatography) giúp khẳng định bản chất glycoprotein của các
receptor màng tế bào.

• Trong lĩnh vực kế hoạch hố gia đình: Lectin có thể dược sử dụng để ngăn
chặn sự thụ thai và chẩn đoán thai sớm do khả năng ngưng kết tinh trùng
và tương tác với hormone rail thai [2],
•

Trong tniễn dịch học: Do lectin lương tác với đường hoặc các chất liên kết
đường tương tự như tương tác giữa kháng nguyên và kháng (hể nên dược
đùng để phát hiện và tinh chế nhiều hợp chất sinh học chứa đường trong đó
có các globulin miễn dịch (Ig). Từ các chế phẩm tinh sạch thu dược, các
nhà khoa học tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc, bản chất, vai
trò của chúng đối với cơ thể.
Lectin cịn có khả năng kích thích phân chia tế bào lympho, kích thích tế
bào B sản xuấl kháng thể nên cỉiúng dược sử dụng để nghicn cứu quá Irình
và khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể.

• Trong y học: Lectin được sử dụng như một cơng cụ chẩn đốn có hiệu quả.
Dựa vào khả năng phân biệt một số vi sinh vật, lectin được sử đụng kết hợp
với các xét nghiệm thông thường khác để nâng cao giá trị chẩn đoán
bệnh[28]. Kỹ thuật ELLA (Enzyme - Linked - Lectino,sorbent - Assay ),
được cải tiến từ kỹ thuật ELTSA, trong đó lectin được gắn với một cn/ym.

12

khi một chất nghiên cứu nào dó, có thể là một kháng nguyên bệnh của vi
khuẩn bị ngưng kết bởi lectin, enzym sẽ hoạt động biến đổi phức hợp này
thành hợp chất có màu, cho phép xác định vi khuẩn một cách nhanh
chóng( khoảng 2 giờ trong khi đó các phương pháp ni cấy thơng thường
khác cần ít nhất 24 giờ ). Trực khuẩn than (Bacillus ơnthracis) có Ihể được
phát hiện nhờ xét nghiệm ELLA với lectin đậu tương (Glycin max L. ). Ở
nước ta,

Đỗ Ngọc Liên và cs đã sử dụng lectin chay Artocơrpus

tonkinensis) để chẩn đoán bệnh sán máng (Schistosoma mansoni) [10].
Dựa vào khả năng phân biệt tê bào bình thường với tê bào ung thư, lectin
có thể được sử dụng để phối hợp chẩn đoán sớm một số bệnh ung thư.
Đồng thời, một số lectin cịn có khả năng nhận biết, sự khác biệt của
glycoprotein màng của tế bào ung thư có khả năng đi căn thấp và tế bào
ung thư có khả năng di căn cao, do đó lectin có thể được sử dụng trong
theo dõi và tiên lượng bệnh. [27]
•

Trong dược học: lectin đùng làm thuốc tuy còn mới mẻ nhưng đã mở ra

nhiều triển vọng trong lương lai. Con A đã được sử dụng ỉàm chấl dẫn
thuốc đưa thuốc tới tế bào đích. Lectin đậu tương có khả năng ngưng kết tế
bào tuỷ xương của người mắc bệnh ung thư dòng bạch cầu làm cho người
bệnh khơng có hiện tượng thải loại mảnh ghép do đó tế bào tuỷ xương
ghép phái huy được chức năng sản sinh dòng bạch cầu và hồng cẩu, kéo
dài thời gian sống cho bệnh nhân [27]. Lectin từ hạt mít mật (Artocarpus
heterophylìus) có khả năng tương tác đặc hiệu với phân tử glycoprotein
CD4 ở bề mặt tế bào lympho T của người, là phân tử kết hợp đặc hiệu với
HIV trong pha đầu tiên của quá trình nhiễm bệnh, do đó có thể kìm hãm

nhiễm HIV, hạn chế khả năng mắc bệnh. Như vậy rất có thể leclin sẽ được
sử dụng làm thuốc điều trị AIDS mà loài người đang mong đợi. Trong
tương lai không xa hy vọng lectin sẽ trở thành một nguồn thuốodược liệu
quí.

13


2.2 . VÀI N É T VẾ C ON C A N A V A L IN A VÀ CÂY ĐẬU RỤA (CAN AVALIA

E N SIF O R M IS 1 ABAC EAE)
<

2.2.1.
•

Con canavalin A

Về iịch sủ
Munk là người đầu liên lách lectin từ dịch chiết cua cây đậu rựa

( Caiiavalìu ensiformis) bảng cách hấp phụ nó lên tế bao hồng cầu thỏ sau đó
■
phán hâp phụ băng dung địch acid. Ơng gọi nó là phasin (1914) [31]. 22 năm
sau (1936), khi chấl dó được Sumner và Howell phân lập, Con A mới chính
thức trở thành tén gọi của lectin đậu rựa (Canavalia ensiformis). Con A là
lectin đầu tiên được tinh chế băng phương pháp sắc ký ái lực. Con A gấn kêi
với các geỉ dexlran có liên kêì chéo (Sephadex G50, G100 ... ) dùng làm pha
tĩnh của cọt săc ký và được phán hâp phụ bằng glucose (Agrawall va
Goldstein-1965,1967) hay bằng acid acetic (Olson và Liener-1967). Từ đó,

bằng nhũng đặc lính sinh học điến hình của mình, Con A dã thu hút sự chú ý
của nhiều,nhà khoa học, trớ thành loại leclin thực vậl nổi tiêng nhấl và được
nghiên cứu nhiều nhấl ị28 ị.
•

Cấu trúc hố học
- Cáu trúc bậc một: Trình tự acid amin của Con A đã được biếl khá

đầy đủ. Khi so sánh với trình lự acid am in của các lecún họ đậu khác (dậu
lương, đậu lens, đậu ịava ... ) người la đã phát hiện ra mộl điều thú vị là có
một sự giông nhau đáng kinh ngạc giữa chúng. Chẳng hạn các aa từ vị 122
đến 137 giơng các aa từ vị trí 1 đến 88 cúa lectin đậu tương, chuỗi a của đậu
lens có các aa giống các aa từ vị trí 70 đến 119 và chuỗi p Ihì có các aa giơng
hệt các aa từ vị trí 120 của Con A. Điều này phù hợp với giả thiết rằng lectin
của các [ồi thực vậl có họ hàng gần gũi có cấu trúc tương tự nhau. Đó có thế
là dấu hiệu phân loại sinh vật ở mức độ phân tứ để nghiên cứu sự tiến hố của
chúng.
- Cáu trúc khơng gian: Bâng phưưng pháp nhiễu xạ tia X người ta đã
xác định dược cấu trúc không gian của Con A (Eđelman và cộng sự-1972,
Hardman và Ainworlh-1972). Con A là mộl protein hình câu có kích thước

14


42X 40 X 39 A°, được cấu tạo từ 4 tiểu đơn vị không chứa các phân lử đường,
giống hệt nhau, cổ khối lượng 26.000 Da. Ngoài bốn tiểu đơn vị ngun vẹn,
ConA cịn có 2 chuỗi polypeptid bổ sung có khối lượng 12.500 và 14.000 Da.
Mỗi tiểu dơn vị của Con A cuộn chặt tạo cấu trúc hình vịm. Hai tiểu đơn vị
kết hợp với nhau ở những đoạn gấp nếp (3 tạo thành cấu trúc đimer dạng
ellipse. Sau đó hai cấu trúc dimer lại liên kết sóng đơi với nhau để tạo thành

cấu trúc Vclramer.

Hình 1 : Sơ đồ biểu diễn cấu trúc tetramer của Con A : Ca, Mỉ ì và s chỉ ra
các vị trí của Ca ++7Mn+ rà vị trí liên kết eỉường đặc hiệu tưong ứng
+
•

Trung tâm hoạt động
Mỗi tiểu đơn vị của Con A có một trung tâm liên kết hydratcarbon được

gọi ỉà trung tâm hoạt động. VỊ trí của trung tâm liên kết này nằm từ acid amin
1 đến acid amin 45 . Vị trí này được bảo tồn ở các lectin họ đậu khác [19]. v ề
mặt không gian các acid amin gần trung tâm hoạt động nhâì là Tyr 12 và 100,
Asp 16 và 208, Asn 14, Leu 99. Ser 168 và Arg 288. Nhóm cacboxyl của
những acid amin này đã được chứng minh Jà có khả năng tham gia vào cấu
trúc của trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt động cách vị trí gắn Ca + 7 A°
+
và cách vị trí gắn Mn+ 11A°.
+

15


Giữa các trung tâm hoạt động trên phân tử Con A có một khoảng cách
tương đối. Trong q trình hoạt động các trung tâm này xích lại gần nhau,
tương tác với nhau tạo ra điểm tiếp nhận hyđratcarbon.
•

Một sơ ứng dụng của ConA
ứng dụng đầu tiên của Con A là để khẳng định một polymer sinh học

có chứa đường trong cấu trúc phân tử hay không. VD: dùng Con A để khẳng
định bản chất glycoprotein của invertase nấm men, chứng minh thành phần có
hoạt tính enzym của F l- ATPase của Micrococcus lnleus không pliái là
glycoprotein[27].
Úng dụng lớn nhất của Con A là sử dụng để tinh chế nhiều hợp chất
sinh học chứa đường như : ovalbumin của trứng gà, tARN của gan thỏ, gan
c h u ộ t, AFP bò, AFP nước ối của người, AFP của bệnh nhân viêm gan và ung
thư gan...[27] . Những hợp chất sinh học này được sử đụng với nhiều mục đích
khác nhau. Một số được sử dụng trong lâm sàng để chẩn đoán nhiều bệnh
nguy hiểm. Sự biểu hiện bất thường của AFP nước ối được sử dụng để phát
hiện những dị tật về hệ thần kinh của thai nhi còn sự biểu hiện bất thường của
AFP huyết thanh được sử đụng để phát hiện nhiều bệnh ung thư trong đó có
ung thư biểu mô tế bào gan, ung thư buồng trứng

[2, 7, 25, 3, 45].

ConA kết hợp với các chất chống ung thư như daunomycin (Kitao,
Hattori-1977), chlorambucil (Lin và cộng sự-1981), methotrexate (Lin và
cộng sự-1981, Tsuruo và cộng sự-1980) làm tăng độc tính của những chất này
trên nhiều loại tế bào ung thư trong mơi trường ni cấy [28].
Con A cịn có khả năng ngưng kết tế bào ung thư ở nồng độ thấp. Cơ
chế của hiện tượng này có thể là do số lượng receptor trên màng tế bào ung
thư nhiều hơn trên màng tế bào bình thường hoặc các receptor trên màng tế
bào ung thư ở gần nhau hơn và bộc lộ nhiều hơn [28].
Tuy những thí nghiệm nói trên mới chỉ có kết quả ở qui mơ phịng thí
nghiệm, nhưng chúng cũng mở ra hy vọng trong tương ỉai không xa Con A sẽ
trở thành loại thuốc hữu hiệu để điều trị căn bệnh hiểm nghèo này.

16

2.2.2. Cây đậu rựa (Canavaliơ ensiformis L. Fabaceae)
Đậu rựa (Cơnavơlia ensiformis) ở Việt Nam cịn có tên khác là đậu rạ,
đậu ngựa, đậu tây. Đậu rựa có nguồn gốc từ Trung và Nam Mỹ. Nó được trồng
rộng rãi ở Nam Mỹ từ thời tiền sử và được phát hiện thấy trong khu khảo cổ ở
Mêhicố với niên đại 3000 năm trước cổng nguyên. Hiện nay nó được trổng
phổ biến ở các nước nhiệt đới.
Đậu rựa chủ yếu được sử dụng làm thức ăn cho gia súc, làm pỉiAn bón.
Hạt của nó được sử dụng làm thức ăn hoặc nghiền nhỏ để uống cùng với cà
phê ở một số nước. Lá non và hoa của cây được dùng làm thức ăn ở Indonesia.
Đậu rựa phát triển tốt trong điều kiện nhiệt đới ẩm, cổ khả năng chịu
hạn tốt, thích hợp với nhiều loại đất, khả năng chống chill sau bệnh cao.
Thời gian từ khi gieo hạt tới lúc thu hoạch là 170 ngày. Năng suất hạt
trung bình từ 800 đến 1000 kg/ha, trong điều kiện trồng trọt tốt, năng suất có
thể lên tới 6000 kg/ha [35].
Ở nước ta đậu rựa mọc hoang nhiều trong các khu rừng ở miền Bắc. Hạt
của đậu rựa được nhân dân địa phương đùng để chế biến một số loại bánh.
Gần đây đậu rựa đã được các nhà khoa học Việt Nam chú ý đến bởi có chứa
Con A, một lectin có nhiều ứng dụng, và bước đầu đã được nghiên cứu để gieo
trồng và tỏ ra phát triển tốt. Có thể trong tương lai đậu rựa Việt Nam sẽ trở
thành một dược liệu quí, cung cấp một nguồn nguyên liệu dồi dào để tách
chiết Con A phục vụ cho nhiều cơng trình nghiên cứu khoa học cũng nhu' các
ứng dụng thực tế khác.
2.3. AFP
•

Định nghĩa về AFP đã được cơ quan nghiên cứu ung thư của tổ chức y

tế thế giới đưa ra vào năm 1969: “ Alpha Fetoprotein là Alpha Globulin dầu

tiên xuấí hiện trong huyết thanh động vật có vú trong q trình phát Iriển và là
protein huyết thanh chủ yếu trong giai đoạn sớm của thời kỳ bào thai. Nó xuât
hiện trong huyết thanh cơ thể trưởng thành trong một số tình trạng bệnh lý,
đặc biệt là ung thư biểu mô tế bào gan”.


AFP người là một glycoprotein có trọng lượng phân tử vào khoảng
70.000 Da, trong đó carbohydrate chiếm khoảng 4%. Điểm đẳng điện của
AFP là 4,5 đến 5,2. Độ hấp thụ quang của đung dịch AFP 1% với chiều
đàylcm ở bước sóng 278 nm là 5,3( E lcm =5,3) hằng số kết tủa của AFP là
4,5-5,3 và thời gian bán huỷ của AFP từ 3 đến 5 ngày.
Ở phụ nữ có thai, hàm lượng AFP huyết thanh tăng nhiều vào tháng thứ 2
và thứ 3 của q đầu khi có thai. Hàm lượng AFP huyết thanh ở dây rốn trẻ sơ
sinh Vào khoảng từ 10.000 đến 100.000 ng/ml và nó giảm xuống chỉ còn dưới
10ng/ml 300 ngày sau khi sinh.
Hàm lượng AFP huyết thanh đã được tìm thấy ở người lớn bình thường
dao động từ 0,lng/ml đến 5,8 ng/ml.
AFP được tổng hợp từ nhu mơ UTBMTBG và gan bào thai hồn tồn
đồng nhất về mặt hố sinh cũng như miễn địch học. Người ta không thể phAn
biệt được sự phân bố của các aciđ amin và đặc tính lý học của AFP bào thai
với AFP ở ƯTBMTBG .
•

Cấu trúc chung cho một phân tử AFP ung thư người bao gồm: một

acid amin (Asparagine) liên kết chuỗi phức hợp đường đôi Oligosaccharide.
Cấu trúc này được thể hiện qua các hình vẽ sau:
Gaipi - > 4 G l c N A c p i - > 2M anal \

JCXI

Filed

' N i

a n p i- ► 4G clN A (31-> 4 G c lN A c p i-* ‘Asn
G a ip i- * - 4 G lc N A c p l- V 2Manal

Hình 2 : Câu trúc phân tử A F P ở U TBM TBG
C r a ip i-* 4 G lcN A cP l- > 2M anal ^

Fii^l

GlcN Acp 1- ^ rla n p 1— 4CiclN Ap 1 ► 4GclNAcị31~ ► Asn
►
G al[31-> 4 G lc N A c p i-> 2M anal

Hình 3 : Cấu trúc phân tử AFP ở ung thư túi tinh hoàn
Neu A c a 2 - 6 G a i p 1 ► 4GlcNAcP 1~ ► 2Mana 1.
j^IanP 1-► 4GclNAP 1“ ►4GclNAcP 1— Asn
►
N e u A c a 2 -> ốGa! p 1- > 4CtIcNAcp ỉ -► 2Mana i

Hình 4 : Cấu trúc phân tử AFP ở bệnh gan mãn tính
18


Dựa trên nhũng nghiên cứu về cấu trúc pliftn tử AFP người ở những bệnh
lý khác nhau và đựa trên kết quả nghiên cứu ái lực của AFP với những lectin
khác nhau, các tác giả Yoshima H và cộng sự (1980), Yamashita K và cộng sự
(1983) cho biết:

-

Phân tử AFP ở UTBMTBG ngồi cấu trúc chung, cịn có mặt của
nhóm fucose (Fucal — và nhóm này đóng vai trị quyết định ái lực
>6)
của AFP với lectin, thể hiện ở dải băng AFP-L3.

-

Phân tử AFP ở ƯTTNH ngoài cấu trúc giống như phân tử AFP ở
ƯTBMTBG cịn có thêm N-Acetylglucosamine (GclNAc). Nhóm này
có ái lực trung gian với lectin thể hiện bằng dải AFP-L2.

-

Phân tử AFP ở bệnh gan mãn tính thì khơng có mặt của nhóm Fucose
và nhóm N-Acetyl glucosamine, do vậy khơng có ái lực với lectin, íhê
hiện bằng dải AFP-L1.

Sự có mặt và sự thay đổi các thành phần carbohydrate, mà cụ thể là sự
thay đổi các nhóm Fucose và N-Acetylglucosamine có trong chuỗi đường của
AFP sẽ quyết định tới ái lực của nó với lectin. Ở những tình trạng bệnh lý
khác nhau, sự chuyển biến từ bệnh gan lành tính (viêm gan mạn) sang bệnh
gan ác tính (UTBMTBG) có liên quan chặt chẽ tới sự biến đổi cấu trúc phân lử
AFP và có ảnh hưởng tới ái lực của AFP với lectin. Do vậy, sự thay đổi trong
cấu trúc đường của phân tử AFP là cơ sở để chẩn đoán phân biệl giữa
UTBMTBG với các bệnh gan mạn tính.
•

ứng dụng của AFP ái lực lectin trong UTBMTBG [7]

Để nghiên cứu ái lực của AFP à các bệnh lý khíìc nhau với những lcclin

khác nhau người (a sử dụng kỹ thuật: Điện di ái lực lectin và thấm ái lực
kháng thể (Lectin affinity electrophoresis and blotting affinity antibody). Khi
chẩn đoán ƯTBMTBG người ta cũng sử dụng kỹ thuật này.
Trong 8 loại ỉectin được ứng dụng trong điện di ái lực lectin thì Lens
culinaris agglutinin (LCA) và Erylhroaggliitinaling phytohemagghĩlinin A (RPHA) là hai lectin hay dược dùng hơn cả.

19


AFP ái lực mạnh với Lens culinaris agglutinin (LCA) là AFP-L3 còn AFP
ái lực mạnh với Erythroagglutinating phytohemagglutinin A (E-PHA) là AFPP4.
Với tỷ !ệ AFP-L3 >15% được coi là dương tính thì độ nhạy, độ đặc hiệu
và tỷ lệ dự báo của test dương tính tương ứng là 76%,99%, 84,6%.VI vậy
AFP-L3 là marker có độ đặc hiệu cao với ƯTBMTBG. Với tỷ lệ ÁFP-P4
>14% được coi là đương tính thì độ nhạy, độ đặc hiệu và tỷ lệ dự báo của tesí
dương tính tương ứng là 82%, 99,9%, 88,9%. Như thế AFP-P4 cũng là một
marker có độ đặc hiệu cao với UTBMTBG. Khi sử dụng hai marker này cùng
một lúc độ nhạy, độ đặc hiệu, tỷ lệ dự báo của test dương tính tăng lên rất
cao: 95%, 99,7%, 99,6%.
Việc xác định những marker đặc hiệu với ƯTBMTBG như AFP-L3 hoặc
AFP-P4 càng trở nên có ý nghĩa khi bệnh nhân UTBMTBG có AFP ở mức
bình thường, mức tăng nhẹ, hoặc mức tăng của AFP ở ƯTBMTBG tương
đương với hàm lượng AFP huyết thanh ở bệnh gan mãn tính. Vì trong những
trường hợp này mức AFP-L3 hay AFP-P4 vãn tăng có ý nghĩa.
Do đó trong chẩn đốn UTBMTBG nếu chỉ đơn thuần dựa vào AFP huyết
thanh, khả năng chẩn đoán sẽ bị hạn chế. Nhưng nếu ta sử dụng kỹ thuật điện
di ái lực lectin và thấm ái lực kháng thể dể xác định tỷ lệ AFP-L3 và AFP-P4
thì độ nhạy, độ đặc hiệu sẽ tăng lên nhiều lần.

Nhiều nghiên cứu đi sâu tìm hiểu vai trị của các marker AFP-L3 và AFPP4 trong việc giám sát và phát hiện sớm ƯTBMTBG ở những đối tượng có
nguy cơ cao như viêm gan mạn và xơ gan. Người ta thấy rằng AFP-L3 và
AFP-P4 thường dương tính 10 tháng trước khi u gan xuất hiện ở bệnh nhân
viêm gan mạn và dương tính từ 3 đến 10 tháng trước khi 11 gan xuất hiện ở
bệnh nhân xơ gan. Như vậy AFP-L3 và AFP-P4 là những marker hữu ích đế
phát hiện sớm ung thư gan từ những đối tượng có nguy cơ cao.
Mối liên quan của AFP-L3 và AFP-P4 với đặc điểm ở ƯTBMTBG cũng
được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Tỷ lệ AFP-L3 và AFP-P4 thường tăng
cao ở ƯTBMTBG có độ biệt hố thấp hoặc vừa so với tỷ lệ AFP-L3 và AFPP4 ở UTBMTBƠ có độ biệt hố cao. Một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ AFP-L3

20


và AFP-P4 khơng có mối liên quan với hàm lượng AFP huyết thanh, nhưng lại
có mối liên quan nhẹ đến kích thước khối u gan.
Các marker AFP-L3 và AFP-P4 đã được dùng trong theo dõi và đánh giá
kết quả điều trị ở bệnh nhân ƯTBMTBG. Kết quả đã cho thấy có mối liên
quan chặt chẽ giữa tỷ lệ AFP-L3 và AFP-P4 trước và sau điều trị với thời gian
sống sau điều trị, thời gian tái phát ung thư và tiên lượng bệnh ở ƯTBMTBG.
Những bệnh nhân có AFP-L3 và AFP-P4 âm tính sau điều trị thường có tiên
lượng tốt hơn so với bệnh nhAn có AFP-L3 và AFP-P4 dương tính sail điều trị.
Cụ thể thời gian để tái phát ung thư dài hơn và thời gian sống sau điều trị dài
hơn. Tóm lại, AFP-L3 và AFP-P4 là những marker tốt để theo dõi tiên lượng
bệnh ở bệnh nhân UTBMTBG sau điều trị.

21