ĐỊNH DANH LOÀI VÀ PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Trichoderma spp. DỰA VÀO TRÌNH TỰ VÙNG ITS và ech42 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….WUX….

HUỲNH THỊ MỸ PHI

ĐỊNH DANH LOÀI VÀ PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG DI
TRUYỀN CỦA NẤM Trichoderma spp. DỰA VÀO
TRÌNH TỰ VÙNG ITS và ech42

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 11/ 2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….WUX….

HUỲNH THỊ MỸ PHI

ĐỊNH DANH LOÀI VÀ PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG DI
TRUYỀN CỦA NẤM Trichoderma spp. DỰA VÀO
TRÌNH TỰ VÙNG ITS và ech42

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Mã số

: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Hướng dẫn khoa học:
TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 11/ 2009


i


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên là Huỳnh Thị Mỹ Phi sinh ngày 18 tháng 11 năm 1983 tại huyện An
Nhơn, tỉnh Bình Định. Con Ông Huỳnh Kim Hùng và Bà Nguyễn Thị Tuyết Mai.
Tốt nghiệp Trung học Phổ thông tại Trường Trung học phổ thông An Nhơn I,
tỉnh Bình Định.
Tốt nghiệp Đại học ngành Công nghệ Sinh học hệ chính quy tại trường Đại
học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh.
Tháng 9 năm 2006 theo học cao học ngành Công nghệ Sinh học tại trường Đại
học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
Tình trạng gia đình: độc thân
Địa chỉ liên lạc: 18 Quang Trung, Thị trấn Bình Định, huyện An Nhơn, tỉnh
Bình Định
Điện thoại: 0983596082
Email:

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác

Ký tên

Huỳnh Thị Mỹ Phi

iii


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn:
TS. Lê Đình Đôn, trưởng Bộ môn Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông
Lâm, đã hướng dẫn tận tình trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp.
TS. Từ Thị Mỹ Thuận, Th.S Lê Cao Lượng cho tôi những ý kiến đóng góp để
hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân và tập thể cán bộ Phòng Đào tạo Sau Đại học
trường Đại học Nông Lâm TP. HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi trong thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
TS. Trần Thị Lệ Minh và tập thể cán bộ, giáo viên Bộ môn Công Nghệ Sinh
học, trường Đại học Nông Lâm TP. HCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi
trong suốt quá trình học tập.
Tập thể cán bộ tại Trung tâm phân tích hóa sinh, Viện Công Nghệ Sinh học và
Công nghệ môi trường, trường Đại học Nông Lâm TP. HCM đã tạo điều kiện hoàn
thành các thí nghiệm liên quan trong luận văn tốt nghiệp.

Ks. Nguyễn Văn Lẫm và Ks. Trần Thị Vân đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm
thí nghiệm liên quan luận văn.
Các anh, chị và các bạn lớp CHSH2006, luôn ủng hộ và động viên trong học
tập và cuộc sống.
Bạn bè và người thân luôn quan tâm, động viên trong suốt quá trình học tập và
làm luận văn tốt nghiệp.
Tác giả luận văn,
Huỳnh Thị Mỹ Phi

iv


TÓM TẮT
Đề tài “Định danh loài và phân tích sự đa dạng di truyền của nấm Trichoderma
spp. dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA và ech42” được tiến hành nhằm xác định mức
độ tương đồng giữa số liệu hình thái và dữ liệu phân tử trong định danh tên loài của
Trichoderma và xem xét mức độ biến đổi giữa các cá thể trong quần thể nấm hiện
diện.
Ba mươi chín mẫu nấm Trichoderma được phân lập từ nhiều vùng địa lý khác
nhau và trình tự vùng ITS – rDNA và ech42 được sử dụng để so sánh phân tích định
danh loài nhờ vào so sánh dữ liệu trên GenBank kết hợp với công cụ TrichOKey
trên www.isth.info. Sự phân nhóm di truyền của 39 MPT được phân tích trên sơ đồ
phân nhóm phân tích bằng ma trận khoảng cách di truyền, Neighbor – Joining.
Kết quả khẳng định được 5 loài Trichoderma hiện diện trong các mẫu phân
tích. Trong đó, 18 MPT là T. asperellum; 4 MPT là T. harzianum; 6 MPT là T.
virens; 3 MPT là T. longibrachiatum và 2 MPT là T. koningii phân bố trong 3
section là Trichoderma, Pachybasium và Longibrachiatum, cùng với 6 mẫu có kết
quả định danh khác biệt giữa hình thái và phân tử.
Có sự biến động di truyền giữa các mẫu Trichoderma trong loài T. asperellum
và T. harzianum đã được ghi nhận trong nghiên cứu. Vùng ITS1 – rDNA cho thấy

sự khác biệt đặc trưng cho từng loài nhiều hơn vùng ITS2, và có thể được sử dụng
như công cụ để phân tích định danh tên loài Trichoderma. Các mẫu Trichoderma
phân nhóm tách biệt với các mẫu Trichoderma so sánh từ dữ liệu từ GenBank.
Chứng tỏ Trichoderma ở Việt Nam là quần thể bản địa và chưa có hiện tượng xâm
lấn ngoại lai.

v


SUMMARY
The thesis "Species identification and genetic diversity of Trichoderma spp.
based on the ITS – rDNA and ech42 sequences" was conducted to determine the
concurrence of morphological and molecular data in identification the scientific
name of Trichoderma isolates and to evaluate the genetic diversity among
individuals in present fungal populations.
Thirty – nine Trichoderma isolates from different geographical regions and
their ITS – rDNA and ech42 sequences were used for comparison analysis with
reference data on GenBank by using TrichO Key (www.isth.info). The genetic
clustering of the 39 MPT was performed based on the genetic distance matrix and
Neighbor – Joining analyse.
The results confirmed at least five Trichoderma species presenting in which
18 MPT were T. asperellum; 4 MPT, T. harzianum; 6 MPT, T. virens; 3 MPT, T.
longibrachiatum; and 2 MPT, T. koningii, those species belonging to three sections
as Trichoderma, Longibrachiatum and Pachybasium. It was also found that six
isolates were not identified based on morphology and molecules data.
There was a genetic variation among isolates in a species such as in T.
asperellum and T. harzianum. ITS1 - rDNA region showed specific differences to
each species in compared with ITS2 region, and it could be used as a tool to identity
the scientific name of Trichoderma isolates. Studied Trichoderma isolates were
grouped separately from GenBank reference isolates suggesting that Trichoderma

species in the study originated from an indigenous population.

vi


MỤC LỤC
CHƯƠNG ...................................................................................................... TRANG
Trang tựa
Trang chuẩn y.................................................................................................... i
Lý lịch cá nhân ................................................................................................. ii
Lời cam đoan................................................................................................... iii
Lời cảm tạ ....................................................................................................... iv
Tóm tắt ............................................................................................................. v
Mục lục........................................................................................................... vii
Danh sách các chữ viết tắt................................................................................ x
Danh sách các bảng ......................................................................................... xi
Danh sách các hình ........................................................................................ xii
Chương 1 .................................................................................................................... 1
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu .............................................................................................................. 3
1.3. Yêu cầu ............................................................................................................... 3
Chương 2 .................................................................................................................... 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 4
2.1. Tổng quan về nấm Trichoderma......................................................................... 4
2.1.1.

Phân loại và phân bố ...................................................................................... 4

2.1.2.

Đặc điểm sinh học nấm Trichoderma. ........................................................... 4

2.1.2.1.

Đặc điểm hình thái học của tế bào nấm ..................................................... 4

2.1.2.2.

Đặc tính sinh lý và sinh hóa ...................................................................... 7

2.1.2.3.

Cơ chế đối kháng giữa nấm Trichoderma và các nấm gây bệnh ............... 8

vii


2.1.3.

Ứng dụng trong Nông nghiệp, bảo vệ thực vật .............................................. 9

2.2. Tổng quan về các vùng bảo tồn ........................................................................ 10
2.2.1.

Vùng ITS – rDNA ở sinh vật ....................................................................... 10

2.2.2.

Tổng quan về ech42 – Endochitinase 42 ..................................................... 12

2.3. Những nghiên cứu về đa dạng sinh học của nấm Trichoderma. ...................... 15
2.3.1.

Những nghiên cứu trên vùng ITS – rDNA .................................................. 15

2.3.2.

Những nghiên cứu phân tích kết hợp ITS – rDNA và các gen đơn ............. 16

2.4. Ý nghĩa của phân loại nấm Trichoderma ......................................................... 18
Chương 3 .................................................................................................................. 19
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................................... 19
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ....................................................................... 19
3.2. Nội dung nghiên cứu......................................................................................... 19
3.3. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 19
3.3.1.

Các mẫu nấm ............................................................................................... 19

3.3.2.

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ............................................................ 24

3.3.3.

Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm........................................................... 24

3.4. Phương pháp thực hiện ..................................................................................... 24
3.4.1.

Tăng sinh khối và thu nhận sinh khối nấm Trichoderma............................................ 24

3.4.2.

Ly trích DNA tổng số của nấm Trichoderma .............................................. 25

3.4.3.

Quy trình thực hiện phản ứng PCR .............................................................. 25

3.4.4.

Phương pháp định danh và phân tích sự đa dạng loài ................................. 26

3.4.4.1.

Phương pháp định danh các mẫu nấm Trichoderma phân lập ................. 26

3.4.4.2.

Phân tích sự đa dạng loài của nấm Trichoderma ..................................... 28

Chương 4 .................................................................................................................. 29
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................ 29
4.1. So sánh kết quả định danh tên loài theo hình thái và phân tử dựa trên vùng
ITS – rDNA .................................................................................................... 29
4.2. Sự khác biệt di truyền của các loài nấm Trichoderma spp. dựa vào trình tự
vùng ITS – rDNA ........................................................................................... 32

viii


4.2.1. Sự biến động di truyền của các loài Trichoderma dựa trên vùng ITS –
rDNA .............................................................................................................. 32
4.2.3.1. Sự biến động di truyền của loài Trichoderma asperellum ......................... 32
4.2.3.2. Sự biến động di truyền của loài Trichoderma harzianum.......................... 36
4.2.3.3. Sự biến động di truyền của loài Trichoderma virens ................................. 38
4.2.2.

Sự tương đồng trình tự trên vùng ITS – rDNA ............................................ 40

4.2.2.1. Sự tương đồng trình tự trên vùng ITS1 ...................................................... 40
4.2.2.2. Sự tương đồng trình tự trên vùng ITS2 ...................................................... 44
4.2.2.3. Sự tương đồng trình tự trên toàn vùng ITS – rDNA .................................. 48
4.2.3.

So sánh kết quả phân nhóm trên vùng ITS – rDNA với các mẫu so sánh ... 51

4.3. Kiểm tra bằng phân tích trên gen ech42 ........................................................... 56
o

Kết quả định danh tên loài dựa vào hình thái, vùng ITS và ech42 .............. 56

o

Kết quả phân nhóm trên vùng ech42 ........................................................... 56

4.4. Thảo luận chung ............................................................................................... 60
Chương 5. ................................................................................................................. 64

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 65

ix


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Bp

: base pair

cDNA

: Complement Deoxyribonucleic Acid

ctv

: cộng tác viên

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

ech42

: endochitinase 42

ITS

: Internal Transcribed Spacer

LSU

: Large Subunit rDNA

MP

: Maximum Parsimony

MPT

: Mẫu phân tích

NCBI

: Natural Center for Biotechnology Information

NJ

: Neighbor - Joining

nu

: nucleotide

ORF

: Open Reading Frame

PCR

: Polymerase Chain Reaction

PGA

: Potato Glucose Agar

rDNA

: Ribosome Deoxyribonucleic Acid

S. rolfsii

: Sclerotium rolfsii

SSU rDNA

: Small Subunit rDNA

tef1α

: Translation Elongation Factor 1

WA

: Water Agar

x

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Các mẫu nấm Trichoderma được sử dụng trong phân tích ....................... 20
Bảng 3.2 Trình tự các cặp primer tương ứng trong phản ứng PCR ......................... 26
Bảng 3.3 Các loài Trichoderma được sử dụng từ nguồn GenBank ......................... 27
Bảng 4.1 Kết quả định danh theo hình thái và dựa vào trình tự vùng ITS ............... 29
Bảng 4.2 Tỷ lệ tương đồng (%) của 20 MPT cùng loài T. asperellum trên toàn
vùng ITS – rDNA ..................................................................................... 33
Bảng 4.3 Tỷ lệ tương đồng (%) và số nucleotide thay đổi của 20 MPT cùng
loài T. asperellum trên vùng ITS1 ............................................................ 34
Bảng 4.4 Tỷ lệ tương đồng (%) và số nucleotide thay đổi của 20 MPT cùng
loài T. asperellum trên vùng ITS2 ............................................................ 35
Bảng 4.5 Tỷ lệ tương đồng (%) và số nucleotide thay đổi của 4 MPT cùng loài
T. harzianum trên vùng ITS1 và ITS2 ...................................................... 37
Bảng 4.6 Tỷ lệ tương đồng (%) và số nucleotide thay đổi của 8 MPT cùng loài
T. virens trên vùng ITS – rDNA ............................................................... 39
Bảng 4.7 Tỷ lệ tương đồng (%) trình tự DNA trên vùng ITS1 – rDNA giữa các
MPT thuộc 8 loài Trichoderma ............................................................... 42
Bảng 4.8 Tỷ lệ tương đồng (%) trình tự DNA trên vùng ITS2 – rDNA giữa các
MPT thuộc 8 loài Trichoderma ............................................................... 46
Bảng 4.9 Tỷ lệ tương đồng (%) trình tự DNA trên toàn vùng ITS – rDNA giữa
các MPT thuộc 8 loài Trichoderma ......................................................... 49
Bảng 4.10 Kết quả định danh theo hình thái và trình tự vùng ITS và ech42 ........... 57
Bảng 4.11 Tỷ lệ tương đồng (%) trình tự DNA trên vùng ech42 của 12 MPT ........ 58

xi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang

Hình 2.1 Các hình dạng của cuống sinh bào tử của các loài nấm Trichoderma ........ 5
Hình 2.2 Các hình dạng cụm bào tử của các loài nấm Trichoderma ......................... 5
Hình 2.3 Các hình dạng bào tử đính của các loài nấm Trichoderma ......................... 6
Hình 2.4 Cấu trúc của một đơn vị lặp lại rDNA ...................................................... 10
Hình 2.5 Các vị trí của primer trên vùng ITS ........................................................... 11
Hình 2.6 Sơ đồ vị trí primer trên Nu - SSU - rDNA ............................................... 12
Hình 2.7 Cấu trúc gen ech42 .................................................................................... 13
Hình 2.8 Cấu trúc domain chitinase 18 của Hypocrea jecorina. ............................. 14
Hình 4.1 Điểm khác biệt trình tự đặc trưng của các loài Trichoderma trên vùng
ITS1 – rDNA ............................................................................................ 41
Hình 4.2 Sơ đồ phân nhóm của 39 MPT trên vùng ITS1 – rDNA ........................... 43
Hình 4.3 Điểm khác biệt đặc trưng theo loài của các mẫu nấm Trichoderma
trên vùng ITS2 .......................................................................................... 45
Hình 4.4 Sơ đồ phân nhóm của 39 MPT trên vùng ITS2 – rDNA ........................... 47
Hình 4.5 Sơ đồ phân nhóm của 39 MPT trên toàn vùng ITS – rDNA ..................... 50
Hình 4.6 Sơ đồ phân nhóm của 39 MPT và các loài trên GenBank trên vùng
ITS – rDNA với thuật toán NJ.................................................................. 53
Hình 4.7 Sơ đồ phân nhóm của 39 MPT và các loài trên GenBank trên vùng
ITS – rDNA với thuật toán MP ................................................................ 54
Hình 4.8 Sơ đồ phân nhóm của 12 MPT và trên vùng ech42 .................................. 59

xii


0


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

Trichoderma là loại nấm có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật,
thường được tìm thấy trong đất, rễ cây, lá và cả trên thân cây mục (Harman, 2004).
Cùng với đặc tính đối kháng với một số nấm gây bệnh trên cây trồng như
Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia, Sclerotina, Fusarium v.v… Trichoderma có
khả năng tạo ra một số chất kháng sinh gây độc cho những vi sinh vật khác và hoạt
động như vi sinh vật kiểm soát sinh học (Samuels, 2004). Ngoài khả năng hạn chế
vi sinh vật gây bệnh cho thực vật, Trichoderma có những ảnh hưởng tốt lên sự sinh
trưởng và phát triển của cây trồng (Harman, 2005).
Từ những năm 1990 trở lại đây, nhiều nhà khoa học dùng Trichoderma spp.
như là một trong những nguyên liệu chính trong sản xuất chế phẩm sinh học phòng
ngừa các bệnh hại do một số loại nấm ký sinh gây ra cho cây trồng. Tại Việt Nam,
một số chế phẩm chứa Trichoderma đã được thử nghiệm và sử dụng để điều trị một
số bệnh trên cây trồng và có khả năng cải thiện chất lượng môi trường nông nghiệp.
Trên thế giới, nấm Trichoderma được sản xuất với nhiều thương hiệu khác nhau
như BinabT, RootShield/ PlantShield, T – 22G, T – 22 Planter Box, Trichodex đang
được sử dụng rộng rãi ở Mỹ và các nước ở châu Âu (Gardener M.B, 2005).
Hiện nay, nấm Trichoderma được tìm thấy với hơn 100 loài khác nhau
(Druzhinina và ctv, 2008). Điều này cho thấy sự đa dạng loài của nấm Trichoderma
rất lớn. Mỗi loài Trichoderma có những đặc điểm riêng biệt theo loài, cũng như tính
đối kháng và khả năng phân giải enzym của nấm. Nhưng một số loài Trichoderma
có những điểm rất giống nhau, sự khác nhau của các loài này chỉ ở một số điểm
nhỏ, rất khó phát hiện khi phân tích dựa vào các đặc điểm hình thái. Điều này có thể

1


dẫn đến việc nhầm lẫn giữa các loài và gây khó khăn trong sử dụng và khai thác
những loài có ích. Nhưng theo Bisset (1991), định danh dựa vào hình thái vẫn được
xem là nền tảng, là yếu tố ban đầu để có thể nhận dạng về giống và loài của
Trichoderma.

Với sự tiến bộ của ngành công nghệ sinh học hiện đại, các kỹ thuật sinh học
phân tử đã và đang được ứng dụng rất nhiều trong các nghiên cứu phân loại và định
danh các loài sinh vật. Do đó, việc định danh tới loài của nấm và đồng thời phân
tích được sự đa dạng di truyền, đa dạng loài và cả đa dạng sinh học của nấm trong
tự nhiên có thể được phân tích dựa trên các vùng gen đặc trưng của loài. Với nấm
Trichoderma, phương pháp phân tích di truyền đã và đang được sử dụng rộng rãi và
thường dựa vào sự khác biệt ở các vùng Internal Transcribed Spacer – ITS trên
DNA ribosome của nấm cũng như các vùng gen đơn khác như: tef1α, act1, ech42...
(Samuels, 2004). Tuy nhiên, một số nghiên cứu khi phân tích đơn lẻ trên vùng này
cho kết quả với độ tin cậy không cao và đã được đề nghị cần có sự kết hợp nhiều
vùng gen với nhau để đạt được kết quả chính xác hơn (Druzhinina và ctv, 2004).
Tại Việt Nam, hiện nay các nghiên cứu về nấm Trichoderma chỉ tập trung vào
hướng khai thác sử dụng là chính, chưa có nghiên cứu hệ thống và chưa có sự quan
tâm đến ý nghĩa và vai trò của loài cũng như những tác động bất lợi của
Trichoderma đến sức khỏe cộng đồng. Trên cơ sở đó, đề tài: “Định danh loài và
phân tích sự đa dạng di truyền của nấm Trichoderma spp. dựa vào trình tự
vùng ITS và ech42” được thực hiện. Sự đa dạng di truyền của Trichoderma ở Việt
Nam trên các vùng địa lý khác nhau được phân tích dựa vào sự khác biệt về trình tự
DNA trên vùng ITS và ech42.

2


1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân tích sự đa dạng di truyền của nấm ở các vùng khác nhau ở Việt Nam dựa
vào trình tự các vùng ITS và ech42 và hình thái học.
1.3. Mục đích nghiên cứu
Đánh giá sự đa dạng di truyền của nấm Trichoderma spp. trên toàn lãnh thổ
Việt Nam.
1.4. Yêu cầu

Mẫu nấm được thu thập ở nhiều vùng khác nhau.
Trình tự vùng ITS và ech42 được sử dụng để so sánh.

3


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về nấm Trichoderma
2.1.1.

Phân loại và phân bố

Năm 1801, Persoon ex Gray đã phân loại nấm Trichoderma thuộc giới Fungi,
ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ Hypocreales, họ Hypocreaceae, giống
Trichoderma. Theo Bissett (1991), giống Trichoderma được phân chia thành 5
giống

phụ:

Pachybasium,

Trichoderma,

Saturnisporum,

Longibrachiatum,

Hypocreanum với các loài khác nhau.
Trichoderma phân bố trên toàn cầu (Kulling và ctv, 2000; Kubicek và ctv,

2003; Wuczkowski và ctv, 2003; Druzhinina và ctv, 2005; Zhang và ctv, 2005) và
thường cư trú ở trong đất, rễ cây, thân cây và gỗ mục (Harman, 2004; Samuels,
2004; Druzhinina và ctv, 2005). Trichoderma có mặt ở hầu hết các nơi trừ các cực
Bắc và Nam (Samuel, 2004), và trở thành thành phần chiếm ưu thế trong đất ở các
điều kiện sinh thái khác nhau, ví dụ như: đất nông nghiệp, đất đồng cỏ, đất rừng, đất
vùng đầm lầy nước mặn, đất sa mạc trong các vùng khí hậu khác nhau.
2.1.2.

Đặc điểm sinh học nấm Trichoderma

2.1.2.1. Đặc điểm hình thái của tế bào nấm
Nhìn chung, Trichoderma cũng có những đặc điểm cấu tạo tế bào như những
tế bào nấm sợi khác. Sợi nấm có đường kính từ 0,5 – 1,0 μm, được bao bọc bởi một
lớp màng mỏng gọi là thành tế bào. Thành tế bào không chứa cellulose như ở thực
vật mà chứa chitin và một số thành phần: polysaccharid, lipid, protein, hexozamin,
chất màu (melanin). Màng tế bào chất dầy khoảng 7 μm, chứa lipid (40 %) và
protein (38 %). Nhân phân hóa, thường có hình tròn và đôi khi kéo dài, đường kính

4


khoảng 2 – 3 μm. Ty thể có hình elip và luôn di động (T.M. Châu và V.T.V. Hoa,
2000).
Đặc tính hình thái của nấm Trichoderma còn tùy thuộc vào đặc tính của từng
loài, và thường được dựa vào một số đặc điểm chính để nhận biết và phân biệt các
loài với nhau.
a. Khuẩn ty của Trichoderma không màu, có tốc độ phát triển rất nhanh, trên
môi trường PGA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm,
xanh vàng hoặc lục trắng. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm
thạch của môi trường PGA hóa vàng.

b. Cuống sinh bào tử ở các loài Trichoderma còn chưa được xác định rõ, nên
việc xác định cách tạo bào tử cũng gặp nhiều khó khăn. Cuống sinh bào tử đặc
trưng của Trichoderma là một nhóm sợi nấm quấn vào nhau nhiều hay ít, và thường
mọc thành nhóm hay cụm pustules, dọc theo sợi nấm hay trong vùng tỏa ra của tản
nấm. Cuống sinh bào tử có nhiều cách phân nhánh trên trục chính, mọc đối xứng
nhau hay riêng lẻ và độ dài của những lóng giữa các nhánh trên cuống tùy thuộc vào
từng loài.
A

C

B

D

Hình 2.1: Các hình dạng cuống sinh bào tử của các loài nấm Trichoderma
A: T. aggressivum, B: T. harzianum, C: T. fertile, D: T. flavofuscum
( />c. Cụm bào tử – pustules thường có kích thước từ 1 – 7 mm, có hình dạng kết
cụm lại rất chặt và chồng lên nhau ở một số loài như T. hamatum, T. polysprorum,
T. spirale, nhưng một số loài khác thì có hình dạng như bông hoặc liên kết lỏng lẻo
với nhau như T. longibrachiatum, T. harzianum. Đây là một đặc tính rất khó phân
biệt ở các loài với nhau.

5


C

B

A

D

Hình 2.2: Các hình dạng cụm bào tử của các loài nấm Trichoderma
A: T. croceum, B: T. fasiculatum, C: T. hamatum, D: T. longibrachiatum
( />d. Bào tử đính (conidia) thường có màu xanh, một ít có màu trắng, vàng hay
xám xanh, đặc tính này nó còn phụ thuộc vào các loài khác nhau. Bào tử đính là
những tế bào đơn bào, có thể có hình chữ nhật, với tỷ lệ chiều dài/ rộng hơn 1,4
nhưng có một số loài có hình cầu hoặc oval với tỷ lệ dài/ rộng là 1,0 – 1,1 và không
dài hơn 5 μm. Hầu hết các loài Trichoderma đều có bào tử đính trơn láng, ngoại trừ
một số loài: T. nigrovirens, T. viride, T. saturnisporum có bào tử gồ ghề.

A

C

B

D

Hình 2.3: Các hình dạng bào tử đính của các loài nấm Trichoderma
A: T. asperellum, B: T. citrinoviride, C: T. minutisporum, D: T. nigrovirens
( />e. Bào tử vách dày được xem như là dạng chống chịu, làm tăng khả năng tồn
tại trong đất của một số loài Trichoderma, thường được sử dụng làm nguyên liệu
trong sản xuất chế phẩm kiểm soát sinh học. Hầu hết các loài Trichoderma spp. đều
tạo ra nhiều bào tử vách dày trong môi trường nuôi cấy.
Dựa vào các đặc điểm hình thái: màu sắc, hình dạng và sự sắp xếp của bào tử
đính; hình thái của cuống sinh bào tử; đặc tính kéo dài của cuống sinh bào tử; cách

6


mọc trên môi trường nuôi cấy và các cụm bào tử, người ta có thể phân biệt được các
loài nấm với nhau trong cùng giống Trichoderma.
2.1.2.2. Đặc tính sinh lý và sinh hóa
Trichoderma có thể thích nghi được dưới mọi điều kiện sống khác nhau. Nấm
phát triển rất nhanh trong điều kiện nhiệt độ từ 25 – 300C, ít loài sống tốt trong ở
350C, có một số loài phát triển được ở nhiệt độ 400C (Samuels, 2004).
Trichoderma có khả năng tạo ra một số chất có tính chất đối kháng với nấm
gây bệnh cho cây trồng như:
- Alkyl pyron, tạo mùi dừa, từ nấm T. atroviride, viride, koningii, hamatum,
ngăn cản sự nảy mầm của noãn bào tử của nấm Phytophthora cinnamoni và các bào
tử Botrytis cinerea. Chỉ có những mẫu thuộc giống phụ Trichoderma có thể tạo ra
6PAP6 (6-n-pentyl-α-pyrone, a δ-lactone) trong môi trường nuôi cấy.
- Gliotoxin và gliovirin, là những hợp chất diketopiperazin, được tạo ra bởi T.
virens, ức chế sự nảy mầm và phát triển của Rhizoctonia solani và Pythium.
- Isonitriles, tạo ra từ T. hamatum, T. harzianum, T. koningii, T. polysporum, T.
viride ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh.
- Peptaibol, từ T. polysporum, T. koningii, T. harzianum, hoạt động trên màng
của tế bào nấm gây bệnh, ngăn cản sự hoạt động của các enzyme màng liên quan
đến sự tổng hợp vách tế bào và trợ giúp các enzyme phân hủy màng tế bào, ức chế
sự phát triển của nấm gây bệnh. Đồng thời peptaibol còn có thể làm kích hoạt tính
kháng của cây trồng đối với các tác nhân gây bệnh.
- Steroid: viridin, từ T. virens, ức chế sự nảy mầm của bảo tử.
Ngoài ra, Trichoderma còn có những khả năng đặc biệt trong quá trình đối
kháng của nấm như: (1) phát triển theo hướng có hóa chất, sự phát triển trực tiếp
theo một sự kích thích của hóa chất, giúp định hướng sự phát triển trong một
khoảng cách, là một đặc tính có lợi trong tính đối kháng; (2) nhận dạng và phân biệt
các phân tử đối kháng và ký sinh, có thể theo tính vật lý hay hóa học và nhận dạng

hóa học thường qua trung gian lectin trên bề mặt của nấm đối kháng hay nấm ký

7


sinh; (3) tấn công trực tiếp, bao vây và bắt giữ sợi nấm theo sự nhận biết đặc hiệu
giữa những cấu trúc và những thể bám.
Hơn nữa, Trichoderma có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng, vị trí kết tập trên
các mô hoại tử và cả chất tiết từ thực vật với các loài nấm gây bệnh ở xung quanh
môi trường sinh sống của nấm.
2.1.2.3. Cơ chế đối kháng giữa nấm Trichoderma với các nấm gây bệnh
Trichoderma là nấm có tính chất đối kháng cao với một số nấm gây bệnh cho
cây trồng, với một số cơ chế đối kháng trực tiếp và gián tiếp như sau:
- Ký sinh trên nấm gây bệnh, phát triển theo hướng hóa chất do nấm ký chủ

tiết ra, phân biệt các phân tử đối kháng và ký sinh.
- Cạnh tranh về dinh dưỡng, nơi ở, chất tiết từ cây với các nấm gây bệnh.
- Tự tạo kháng sinh: Gliotoxin và gliovirin, alkyl pyrones, 6PAP6, peptaibol,
steroid, sesquiterpenes, polyketides ngăn cản sự nảy mầm của các bào tử nấm gây
bệnh trên cây trồng.
Theo Harman (2005), quá trình đối kháng của nấm Trichoderma diễn ra
theo một loạt các hoạt động như: phát triển về hướng có các sợi nấm khác, cuộn
chúng lại trong phản ứng lectin làm trung gian và phá vỡ thành tế bào của nấm
mục tiêu. Quá trình này làm hạn chế sự phát triển và hoạt động của các nấm
gây bệnh trên cây trồng.
Có thể cơ chế duy nhất của sự kiểm soát sinh học của Trichoderma là ảnh
hưởng trực tiếp tới tác nhân gây bệnh cho cây. Nhưng thực tế thì Trichoderma hoạt
động theo một số cơ chế khác nhau. Một số nấm ảnh hưởng trực tiếp trên tác nhân
gây bệnh, đồng thời có một số ít ảnh hưởng gián tiếp qua rễ cây, chúng cạnh tranh
vị trí với tác nhân gây bệnh và loại bỏ các tác nhân tiềm năng, cung cấp dinh dưỡng

cho cây trồng (Samuels, 2004).

8


2.1.3.

Ứng dụng trong nông nghiệp, bảo vệ thực vật

Ngày nay, Trichoderma thường được sử dụng như chất kiểm soát sinh học,
bảo vệ thực vật để chống các loại nấm gây bệnh: Phytophthora, Pythium,
Rhizotonia, Sclerotina, Botrytis, Fusarium và Crinipellis trên cây bông vải, nho,
bắp, rau diếp, hành, táo, cà rốt và ca cao. Một số nghiên cứu cho thấy các loại bào
tử đính hay chlamydospores có hiệu quả đối kháng cao khi đưa vào đất trồng có tác
nhân gây bệnh. Hai loài được coi là có nhiều ứng dụng nhất là T. harzianum, nấm
ký sinh và kích thích cây phát triển, và T. virens, tác nhân hóa học bằng cách tạo ra
gliotoxin (Samuels, 2004).
Trichoderma được nghiên cứu rất kỹ về các cơ chế cạnh tranh cũng như là
đặc điểm bám dính trên các ký chủ của nó. Harman (2005) tạo ra một loại nấm
dung hợp giữa 2 mẫu nấm T. harzianum (mẫu T22), mang các đặc tính tăng
trưởng mạnh và khả năng cạnh tranh vị trí kết tập ở rễ với hoạt tính chống nấm
rất mạnh. Mẫu này được thử nghiệm cho kết quả khá tốt và đang được đưa ra thị
trường thương mại hóa như là một chất bảo vệ cho rễ ở Mỹ và một số nước ở
Châu Âu.
Bên cạnh đó, Lê Đình Đôn và ctv (2006) đã đánh giá hiệu quả phòng trừ
nấm bệnh hại cây trồng trong điều kiện đồng ruộng của T. virens, T. harzianum
và T. asperellum. Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học của ba loại
nấm này đã được thiết lập khá hoàn chỉnh và đã đăng ký tên thương mại cho ba
chế phẩm “Trichoderma cho cây sầu riêng”, “Trichoderma cho cây rau xanh” và
“NLU – Tri” góp phần tạo sản phẩm nông nghiệp an toàn trong sử dụng.

Hiện nay, có rất nhiều loài chế phẩm chứa Trichoderma được thương mại hóa
tại Việt Nam, chẳng hạn như: Vi – ĐK của Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Trico
– ĐHCT của Đại học Cần Thơ, BIOPROMOT của Viện Sinh học Nhiệt đới, TriB1
của Viện Bảo Vệ Thực Vật và hơn 10 sản phẩm khác. Các chế phẩm này đang được
nông dân ở khu vực TP. Hồ Chí Minh, Đồng bằng sông Cửu Long và Đông Nam
Bộ sử dụng rộng rãi trong việc ủ phân chuồng bón cho cây trồng. Việc sử dụng các
chế phẩm này đã đẩy nhanh tốc độ ủ hoai phân chuồng từ 2 – 3 lần so với phương

9


pháp thông thường, giảm thiểu ô nhiễm môi trường do mùi hôi thối của phân
chuồng. Người nông dân vừa tận dụng được nguồn phân tại chỗ, vừa đáp ứng được
nhu cầu ứng dụng tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng do tác dụng của nấm đối
kháng Trichoderma có chứa trong phân ủ.
2.2. Tổng quan về vùng gen ITS – rDNA và ech42
2.2.1.

Giới thiệu vùng ITS – rDNA ở nấm

rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong
các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài, vì có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa
cho protein nào. Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật
thiết tới quá trình tiến hóa. Ribosome hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng
nguồn gốc tiến hóa, tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương
đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau trong cùng một loài hoặc
khác loài.

Hình 2.4: Cấu trúc của một đơn vị lặp lại rDNA.
( />

Theo White và ctv (1989), rDNA có thể chia thành 2 nhóm: rDNA nhân và
rDNA ty thể. Trong đó, rDNA nhân (nu – rDNA) gồm nu – SSU – rDNA (17 –
18S) mã hóa rRNA tiểu đơn vị nhỏ (small subunit rDNA) và nu – LSU – rDNA (26
– 28S) mã hóa rRNA tiểu đơn vị lớn (large subunit rDNA). Nu – SSU – rDNA tiến
hóa tương đối chậm, thường được sử dụng trong nghiên cứu các sinh vật có ít quan
hệ về mặt di truyền. Nu – LSU – rDNA mặc dù có ít vùng biến đổi nhưng lại rất có
ý nghĩa trong nghiên cứu so sánh và phân loại ở nhiều mức độ (Guarro, 1999).
Riêng rDNA ty thể (mt – rDNA) cũng được phân chia thành: mt – SSU – rDNA

10