Xây dựng phương pháp nghiên cứu tối ưu nhằm phân tích sự đa dạng di truyền của giống loài hoàng liên gai (berberidaceae)

Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cô giáo
ThS. Lưu Thúy Hòa, Viện Sinh – Nông, trường Đại học Hải Phòng và Ban lãnh
đạo Viện Sinh – Nông, trường Đại học Hải Phòng đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ
em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực tập.
Đồng thời em cũng xin được trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo và các
cộng tác viên hiện đang công tác tại Bộ môn thực vật, Bộ môn Hóa phân tích
của Trường đại học Dược Hà Nội và Bộ môn Kỹ thuật di truyền của Viện Di
truyền nông nghiệp (thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho em thực hiện những công việc liên quan trong quá trình
thực tập.
Cuối cùng, tôi cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đặc biệt là ba mẹ đã luôn ở
bên động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình thực tập này.

Hải Phòng, ngày 2 tháng 6 năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Hùng Cường


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Tính đa hình chiều
dài các phân đoạn được nhân bản)
cs

Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotit triphotphat
3


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

EDTA

Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid

Kb

Kilobase

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

RAPD

Random Amplified Polymorphism DNA (Phân tích ADN đa

hình được nhân bản ngẫu nhiên)
RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism (Phân tích chiều dải

các phân đoạn ADN cắt hạn chế)
SDS

Sodium Dodecyl Sulphat

SSR

Simple Sequence Repeats

STS

Sequense Tagged Site

TAE

Tris - Acetate - EDTA

TE

Tris - EDTA

Tris

Trioxymetylaminometan

CTAB Cetyl trimethylammonium bromide
EtBr

Ethidium bromide

ISSRs

Inter Simple Sequence Repeats

rDNA

Ribosomal DNA

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

4

Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Berberin là alcaloid có nhân isoquilolin (Khosla, 1992; Rastogi và cộng sự,
1993). Đó là hoạt chất được ứng dụng từ lâu đời trong các nền y học truyền
thống trên thế giới để chữa các bệnh của các nước nghèo do đặc tính kháng
khuẩn, nấm, đơn bào (Đỗ Huy Bích, 2006), berberin có thể sử dụng để chống lại
Staphylococcus aureus đã kháng kháng sinh Methicillin (Yu HH và cs, 2005),…
và ngày nay nó có tiềm năng rất lớn trong điều trị các bệnh đang phát triển như
hạ đường huyết (Wang Y và cs 2010, Gu Y và cs 2010...), ung thư (Tang J và
cs 2009, Kim JB và cs 2009, Pinto-Garcia L và cs 2010).
Trên thế giới đã xác định khoảng 150 loài thực vật bậc cao có berberin,
thuộc 23 chi và 7 họ, bao gồm: Na (Annonaceae), Hoàng liên (Berberidaceae),
Cải

cần

(Fumariaceae),

Tiết

dê

(Menispermaceae),

Thuốc

phiện

(Papaveraceae), Mao lương (Ranunculaceae), Cam (Rutaceae), trong đó các họ
chủ yếu là Berberidaceae, Menispermaceae, Papaveraceae, Ranunculaceae và
Rutaceae (Nguyễn Kim Cẩn, 2002).
Họ Berberidaceae là một họ thực vật có hoa, bao gồm 15-17 chi thực vật
có hoa. Họ này thuộc bộ mao lương (Ranunculales). Họ này phân bố ở các
vùng ôn đới của phía bắc bán cầu (Judd và cộng sự, 1999). Họ Berberidaceae
chứa khoảng 570-700 loài, trong đó phần lớn (khoảng 450-600 loài) thuộc về
chi Berberis. Các loài trong họ là các cây thân gỗ, cây bụi hoặc cây thân thảo có
nguồn gốc từ các vùng ôn đới và cận nhiệt đới của châu Âu, châu Á, châu Phi,
Bắc và Nam Mỹ (Ahrendt 1961).
Ở Việt Nam, đã xác định có 26 loài thực vật thuộc 5 họ khác nhau
chứa berberin là Berberidaceae, Menispermaceae, Ranunculaceae, Rutaceae
Papaveraceae ( Nguyễn Kim Cẩn, 2002). Trong đó, các cây thuộc họ
Berberidaceae bị khai thác triệt để để làm thuốc và buôn bán ở thị trường trong
5


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

nước để làm thuốc (Hoàng liên, Hoàng liên ô rô,…) và xuất khẩu qua Trung
Quốc. Điều này dẫn đã dẫn đến sự cạn kiệt nguồn tài nguyên các loài cho
berberin ở Việt Nam và trở thành những cây thuốc quý hiếm được ghi trong
sách đỏ (Nguyễn Tiến Bân, 2007).
Việc phân loại các loài trong chi Berberis, Mahonia, Podophyllum trong họ

Berberidaceae rất phức tạp với những đặc điểm hình thái giống nhau giữa các
loài trong cùng chi. Sự phân biệt giữa các loài khó khăn do phần trăm đa bội cao
và do lai tạo (Cadic và Decourtye 1987). Điều này đã dẫn đến nhầm lẫn trong
việc xác định loài trong thu hái, sử dụng.
Trên thế giới đã có những nghiên cứu phân biệt các loài trong chi ở mức độ
phân tử đối với một số loài B. asiatica Roxb, B. aristata DC., B. lycium Royle
(Subramani Paranthaman Balasubramani và cs, 2011; Vivek Tripathi và cs,
2013,... ), loài Podophyllum hexandrum (Md. Afroz và cs, 2009, Pradeep Kumar
Naik và cs, 2010; Akshay Nag và cs, 2013) hoặc so sánh các loài trong họ
Berberidaceae (C. Roß và W. Durka, 2006, Mehdi Rezaei và cs, 2011) nhưng
ở Việt Nam vẫn chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu đánh giá, tư liệu
hoá ở mức độ phân tử về đa dạng di truyền các tập đoàn cây này một cách sâu
rộng và có hệ thống.
Từ những lý do trên, việc nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của các
giống/loài cho berberin trong họ Hoàng liên ở mức phân tử là cần thiết và cấp
bách để định hướng cho công tác thu thập, bảo tồn khai thác và sử dụng các
nguồn gen cây bản địa quý này một cách có hiệu quả.
1.2. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU
1.2.1. Mục đích

Xây dựng phương pháp nghiên cứu tối ưu nhằm phân tích sự đa dạng di
truyền của giống/loài Hoàng liên gai (berberidaceae)

6


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

1.2.2. Yêu cầu

+

Điṇh danh chính xác các giống/loài Hoàng liên trên đăc c điểm hình thái.

+

Xác định các chỉ thị đặc trưng, các alen hiếm nhận dạng chính xác các

giống/loài Hoàng liên gai ưu tú.
+

Đánh giá sự khác biệt di truyền giữa các giống/loài Hoàng liên gai qua việc

phân tích RAPD với primer ngẫu nhiên
+

Mô tả quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS

7


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. NGUỒN GỐC PHÂN LOẠI
Họ Hoàng mộc, còn gọi là họ Hoàng liên gai (Berberidaceae), là một họ

của khoảng 14-15 chi thực vật có hoa. Họ này thuộc bộ Mao lương
(Ranunculales). Họ chứa khoảng 570-700 loài, trong đó phần lớn (khoảng 450600 loài) thuộc về chi Berberis. Các loài trong họ là các loại cây thân gỗ, cây
bụi hoặc cây thân thảo chủ yếu là thường xanh.
Phân loại khoa học của họ Berberidaceae trong hệ thống phân loại thực
vật như sau (Lê Đình Bích và Trần Văn Ơn, 2007):
-

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae)
Liên bộ Hoàng liên (Ranunculanae)
Bộ Hoàng liên (Ranunculales)
Họ Hoàng liên gai (Berberidaceae)
Các chi:
-

Achlys
Berberis - hoàng liên gai (hoàng mù), hoàng mộc, tiểu bá, nghêu hoa
Bongardia
Caulophyllum - hồng mao thất
Diphylleia - sơn hà diệp
Dysosma - bát giác liên
Epimedium - dâm dương hoắc
Gymnospermium
Jeffersonia - tiên hoàng liên
Leontice - mẫu đan (đơn) thảo, không nhầm với các loài hoa mẫu đơn
Mahonia - hoàng liên ô rô, thổ hoàng liên, thổ hoàng bá
Nandina - nam thiên trúc
Podophyllum - Podophyllum tonkinense là bát giác liên
Vancouveria

2.2. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ HỌ CỦA HOÀNG LIÊN GAI
2.2.1. Đặc điểm chung của họ Hoàng liên gai (Berberidaceae)

8


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

Hoàng liên gai là loại cây cỏ nhiều năm, cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, thừờng
xanh hoặc rụng lá. Thân có hoặc không có gai. Lá đơn hay kép, mọc so le, đối
hoặc mọc ở gốc. Lá kèm có hoặc không. Gân lá hình lông chim hoặc hình chân
vịt. Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 3, mọc thành cụm hoặc đơn độc. Cụm hoa dạng
chùm, bông, tán, xim, hoặc chùy. Hoa có cuống hoặc không. Lá bắc có hoặc
không. Đài 6-9, thường dạng cánh hoa, rời, xếp 2-3 vòng. Tràng 6, rời. Tuyến
mật có hoặc không. Nhị 6, đối diện tràng; bao phấn 2 ô, mở bằng 2 van hoặc nứt
dọc. Bầu trên, nhìn bên ngoài như có 1 lá noãn; noãn nhiều, hiếm khi 1, đính
noãn mép hoặc gốc; vòi nhụy có hoặc không, đôi khi tồn tại ở quả.
Quả mọng, quả nang hoặc quả đại. Hạt 1 hoặc nhiều, nội nhũ phong phú.
2.2.2. Đặc điểm thực vật chi Berberis

Cây bụi thường xanh hoặc rụng lá. Thân cành trơn nhẵn hoặc có lông
măng, có rãnh hoặc không, có gai hoặc không, gai đơn hoặc chia làm 3-5 nhánh.
Lá đơn, mọc so le, mép có gai, nguyên hay cuốn ngoài.
Hoa đơn độc hay mọc thành cụm, dạng chùm, tán hoặc chùy. Hoa màu
vàng bóng, da cam, vàng đo đỏ, hay vàng nhạt, có khi vàng lục. Hoa mẫu 3; lá
bắc con thường 3, sớm rụng, dạng vảy. Đài 6, hiếm khi 3 hoặc 9, màu vàng.
Tràng 6, màu vàng, móng có mật. Nhị đối diện tràng; bao phấn mở bằng van.

Bầu nhụy đối xứng dạng chùy; noãn 1-12, hiếm khi 15; vòi nhụy rất ngắn. Quả
mọng, thường màu đỏ, đỏ sẫm hoặc đen; hình cầu, hình elip, thuôn dài, hình
trứng hoặc trứng ngƣợc; kích thước 6-20mm; vòi nhụy tồn tại hoặc không. Hạt
1-10, màu nâu đến nâu đỏ hoặc đen, không có áo hạt (Võ Văn Chi, 2003; Ying
Tsunshen, 2011)

9


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

Hình 2.1: Chi Berberis
Ở nước ta loài Berberis phân bố chủ yếu ở Sapa, trên núi Phan-xi-păng
vùng Bắc Hà thuộc tỉnh Lào Cai. Cây mọc trong rừng kín thường xanh mưa mùa
ẩm, rừng núi đá, ở độ cao khoảng 1000-1600m. Mùa hoa tháng 5-6, mùa quả
tháng 6-10 (Võ Văn Chi, 2003).
2.2.3. Đặc điểm thực vật của chi Mahonia

Cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, thường xanh, cao 0,3 – 8 m. Không gai.
Lá kép hình lông chim lẻ, mọc so le, không cuống hoặc có cuống; lá chét 3 -4;
lá chét bên thường không cuống, lá chét tận cùng có cuống hoặc không cuống;
mép lá nguyên hay có khía răng thô hay đẹp. Cụm hoa mọc ở tận cùng, (1-) 3 –
18 chùm đơn hay phân nhánh, dài 3 – 35 cm, mọc đối diện với lá bắc. Cuống
hoa dài 1,5 – 24 mm, đối diện với lá bắc, lá bắc ngắn hay dài hơn cuống hoa.
Hoa màu vàng, lá đài xếp ba vòng, cánh hoa xếp một vòng, gốc cánh hoa
có hay không có tuyến. Trung đới không kéo dài, nhọn đột ngột hay kéo dài
ra rõ ràng. Bầu hình gần cầu, noãn 1 – 7, vòi nhụy không có hoặc dài tới 3 mm,

10


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

tồn tại ở quả. Quả mọng, hơi xanh hay đen, thường có phấn. Hạt 1 -7 (Prabhakar
P.K, Doble M., 2009).
Chi Mahonia phân bố chủ yếu ở Đông và Đông Nam Á, ngoài ra còn có ở
Tây Bắc Mỹ, Trung Mỹ và Tây Nam Mỹ. Ở Trung Quốc có 31 loài (Ying
Junsheng và cs, 2011), ở Đài Loan có 2 loài (Sheng You Lu and Yuen Po Yang,
2003). Ở Việt Nam, chi Mahonia phân bố ở các khu vực Bắc Kạn, Lai Châu,
Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lâm Đồng

Hình 2.2. Chi Mahonia
2.2.4. Đặc điểm thực vật chi Podophyllum

Podophyllum là một chi của các loài cây lâu năm thân thảo trong họ
Berberidaceae có nguồn gốc Đông Á và Đông Bắc Mỹ
Cây thảo sống nhiều năm, cao 30 - 50cm, thân rễ thô to, mọc ngang. Thân
thường mang một đến hai lá, đính lá dạng ngù. Phiến lá rộng đến 30cm, có 4 - 9
thùy nông, thùy dạng tam giác rộng hoặc hình tròn dài dạng trứng, đỉnh nhọn
sắc, mép lá có răng nhỏ. Hoa màu hồng đậm, gồm 5 - 8 hoa mọc tập trung ở gốc
11


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

lá, hoa rủ xuống, cuống hoa nhỏ, dài, cong. Lá đài 6, mặt ngoài có ít lông dài.
Cánh hoa 6 dài 2cm. Nhị 6. Bầu thượng, đầu nhụy to, quả mọng hình bầu dục
hoặc hình trứng. Hạt nhiều.
Mùa hoa tháng 3 - 5, mùa quả chín tháng 7 - 9. Cây tái sinh bằng chồi từ
thân rễ vào vụ xuân hè. Cây sống dưới tán rừng ẩm trên núi, ở độ cao 800 - 900
m. Mọc rải rác trên đất rừng nhiều mùn, ẩm, độ chiếu sáng yếu.
Ở Việt Nam các loài Podophyllum phân bố chủ yếu ở Hoà Bình (Đà bắc:
Chợ Bờ), Hà Tây (Ba Vì), Lạng Sơn (núi Khau Khú)

Hình 2.3: Chi Podophyllum

2.3. CÔNG DỤNG VÀ TÌNH HÌNH KHÁ THÁC SỬ DỤNG CỦA CÁC
LOÀI CHỨA BERBERIN
Berberin là alcaloid có nhân isoquilolin, có trong khoảng 150 loài thực vật
bậc cao (Nguyễn Kim Cẩn, 2002; Phạm Thanh Kỳ, 2002).
12


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

Nó là hoạt chất được ứng dụng từ lâu đời trong các nền y học truyền thống
trên thế giới để chữa các bệnh của các nước nghèo do đặc tính kháng khuẩn,
nấm, đơn bào,…và ngày nay nó có tiềm năng rất lớn trong điều trị các bệnh
đang phát triển như tiểu đường, ung thư, tăng mỡ máu,… Các tác dụng đã được
chứng minh của berberin bao gồm:
(1) Tác dụng kháng khuẩn (Đỗ Huy Bích, 2006) (Yu HH, Kim KJ, Cha JD
và cs, 2005).

(2) Tác dụng kháng nấm, lợi mật, kháng đơn bào, hạ huyết áp, chống loét
đường tiêu hóa (Đỗ Huy Bích, 2006).
(3) Tác dụng chống ung thư (Sun Y và cs., 2009; Tang J và cs., 2009) (Kim
JB và cs., 2009), (Serafim TL và cs., 2008), (Pinto-Garcia L và cs., 2010),….
(4) Tác dụng hạ đường huyết (Wang Y và cs., 2010; Wang C và cs., 2009) ,
(Gu Y và cs, 2010; Zhang H và cs., 2009; Wang JM và cs, 2009; Zhang Y và
cs., 2008).
(5) Tác dụng bảo vệ gan (Chang XX và cs., 2009) (Sun X và cs, 2009).
.v.v.
Với các tác dụng truyền thống và các các tác dụng mới phát hiện trong điều
trị tiểu đường và ung thư cũng như tính an toàn trong sử dụng, berberin ngày
càng được sử dụng nhiều trên thế giới cũng như ở Việt Nam với hàng chục sản
phẩm đang được sản xuất tại các công ty Dược trong nước. Điều này dẫn đến
việc khai thác ồ ạt nguồn cho thực vật cho beberin tự nhiên. Đó là một trong
những nguyên nhân quan trọng dẫn đến suy kiệt những nguồn gen này.
2.4. TỔNG QUAN VỀ NHỮNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỔ BIẾN DÙNG
ĐỂ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN
2.4.1. Phương pháp chỉ thị hình thái

Gen - thể hiện bản chất di truyền, thường thể hiện một hay nhiều tính trạng
có thể đo đếm được – gen đó xem như gen chỉ thị. Chỉ thị hình thái là một trong
những phương pháp sơ khai trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền.
Tuy nhiên, số chỉ thị hình thái hiện diện trong tự nhiên cũng rất ít, không
thỏa mãn yêu cầu của nhiều chương trình chọn giống và chỉ có quy mô hình thái
13


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

(cơ 19 quan) hoặc ở giai đoạn phát triển đặc biệt của cá thể. Sự thể hiện các chỉ
thị hình thái bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường, điều này làm cho chỉ thị
hình thái kém thu hút trong cải tiến giống cây trồng.
2.4.2. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN

RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism, Đa hình chiều dài các
mảnh phân cắt giới hạn. Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột biến tự nhiên ở
những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen. Mỗi loài sinh vật có một bộ
ADN genom đặc hiệu trong cấu trúc, vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn
để cắt phân tử ADN của hệ gen, người ta có thể nhận biết được những đoạn
ADN có chiều dài khác nhau bằng kỹ thuật lai ADN với những mẫu dò (probe).
Đây là nguyên lý kỹ thuật RFLP.
Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội, nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các
alen của cùng một locus. Do vậy, có thể phân biệt được các cá thể đồng hợp tử
(AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa). Đây là đặc điểm ưu việt của loại chỉ
thị này. Hạn chế của phương pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, đòi
hỏi nhiều trang thiết bị phòng thí nghiệm, đặc biệt là tiêu hao một lượng lớn
ADN mà số lượng đa hình thu được rất ít ỏi, thậm chí ở một số loài khó nhận
được đa hình.

2.4.3. Chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) được Kary
phát minh năm 1985 (Kary Mullis và cs., 1985; 1990). Phương pháp này đã
nhanh chóng được sử dụng hầu hết ở các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới
(Nair và cs., 1996). Nhờ vào việc phát hiện ra loại enzym chịu nhiệt được tách
từ một loại vi khuẩn sống ở suối nước nóng có tên là Thermus aquaticus hoạt
động tốt nhất ở nhiệt độ 70-800C, người ta đã kết hợp với những tính chất cơ bản
của ADN là có khả năng duỗi xoắn ở một nhiệt độ thích hợp, có khả năng bắt

cặp với những đoạn ADN có trình tự 14
nucleotit bổ sung với đoạn ADN khuôn


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

mẫu và có khả năng nhân đôi dưới xúc tác của enzym đặc hiệu để nhân bội
những đoạn ADN khuôn mẫu. Phản ứng PCR dựa trên nguyên tắc tổng hợp
ADN nhờ enzym ADN Polymerase chịu nhiệt (Taq, Pfu…) với sự có mặt của
đoạn ADN khuôn mẫu, ADN mồi, các nucleotit (dNTP) gồm dATP, dCTP,
dGTP, dTTP và ion Mg2+ hoạt động như một chất xúc tác. Tuỳ theo bản chất của
những đoạn mồi sử dụng mà có những hệ thống chỉ thị đặc trưng gồm chỉ thị
STS, RAPD, SSR, AFLP,v.v… Việc sáng chế ra máy PCR sau đó giúp thực
hiện được những phản ứng nhân bội AND dễ dàng.
2.4.4. Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites)

STS Olson nêu ra lần đầu tiên vào năm 1989 để nghiên cứu lập bản đồ gen
ở người ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời (Olson M. và cs., 1989). STS được
đưa ra nhờ việc xác định trình tự 2 đầu các đoạn mẫu dò RFLP, trên cơ sở đó
người ra thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR.
2.4.5. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic ADN)

RAPD được sinh ra bởi phản ứng PCR, do sự nhân bội những đoạn ADN
hệ gen, sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (random primer) dài khoảng
9-10 nucleotit dưới nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 37 0C) (Williams và cs., 1990).
Sản phẩm của phản ứng được phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhuộm
trong ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím. RAPD sinh ra những chỉ
thị trội bởi sự có mặt hay vắng mặt những alen ADN đặc trưng. Hạn chế của loại

chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP là không phân biệt được thể dị hợp tử.
Mặc dù vậy, chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ ở
những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại. Lợi thế
của loại chỉ thị này là không cần biết những thông tin về trình tự (William và cs.,
1993). Chỉ thị RAPD còn có thể sử dụng trong việc điền vào những chỗ trống
trên bản đồ phân tử RFLP (Chang và Meyerowitz, 1991), lập bản đồ gen kháng
đạo ôn ở lúa (Naqvi và cs., 1995).
-

Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD

15


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không
cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản,
chất lượng.
ADN khuôn không cần độ tinh sạch cao. Thời gian thực hiện nhanh, khả
năng nhân bản cao.
Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thường được sử
dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và
nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao.
Do chỉ thị RAPD có hạn chế là độ nhạy bị phụ thuộc vào điều kiện của
phản ứng, đôi khi kết quả không lặp lại được, nên người ta đã khắc phục bằng
cách nhân dòng những alen RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết
kế những đoạn mồi dài khoảng 20bp từ cả hai đầu và gọi là chỉ thị SCARs

(Sequence Characterized Amplified Region).
-

Ứng dụng cũa kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời,

mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do ưu
điểm dễ thực hiện và chi phí thấp.
Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD: Đánh giá đa dạng di truyền: đã được áp
dụng trên các đối tượng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây,
khoai tây, cà chua,vv... Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ ADN, điều kiện thí
nghiệm, chương trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình
cao. Đối với nấm bệnh thực vật thì kỹ thuật RAPD đã được áp dụng để phân tích
đa dạng di truyền của nhiều loại nấm khác nhau: Leptosphaeria maculans (Desm.)
Ces.etde Not, Corynespora cassiicola.
Nhận diện chỉ thị phân tử: ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và
mối tương quan giữa kiểu gen RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một
số giống lúa ở Việt Nam (Nguyễn Thị Lang, 2002). Ngoài ra kỹ thuật RAPD
còn được áp dụng xây dựng bản đồ gen (Nguyễn Thị Lang, 2002).
16


Đồ án tốt nghiệp

-

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

Những cải tiến của kỹ thuật RAPD
Đã có vài cải tiến của kỹ thuật RAPD được mô tả. Kỹ thuật thứ nhất là sử

dụng cùng lúc 2 primer khác nhau thay vì sử dụng 1 primer như kỹ thuật RAPD
thông thường. Phương pháp này có thể làm tăng hoặc giảm đi số alen so với khi
sử dụng một primer. Việc lựa chọn, sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau một
cách phù hợp cũng có thể làm tăng tính đa hình của những primer cho sản phẩm
ít đa hình. Cải tiến thứ 2 là cắt ADN bằng các enzyme giới hạn trước hoặc sau
khi thực hiện phản ứng PCR. Sự cắt này cũng có thể tạo ra hai kết quả. Một là
có thể làm giảm số lượng các alen khó xác định (complex band), điều đó làm dễ
dàng hơn cho việc đánh giá đa dạng di truyền. Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu
có hạn chế về sự đa hình. Tuy nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vào
chiến lược nhằm làm tăng số chỉ thị đa hình có thể hoặc đạt được các chỉ thị
đồng trội. Những cải tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuật
RAPD cụ thể là tốc độ, giá thành và sử dụng phức tạp hơn (Kurt Weising và cs,
1995).

Hình 2.4:Nguyên lí của phản ứng RAPD
17


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

2.4.6. . Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP được sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu lập bản đồ gen và xác
định chỉ thị phân tử liên kết gen. Kỹ thuật tạo ra các loại chỉ thị này được gọi là
nhân bội chọn lọc những mảnh cắt giới hạn (Selective Restriction Fragment
Amplication - SRFA). Phương pháp linh hoạt này có thể phát hiện được sự có
mặt của những mảnh cắt giới hạn trong bất kỳ loại ADN nào (Vos và cs., 1995).

Nguyên lý của kỹ thuật SRFA dựa trên cơ sở nhân bội có chọn lọc những
mảnh cắt giới hạn từ ADN hệ gen. Kỹ thuật này bao gồm ba bước:
-

Bước 1: ADN hệ gen được cắt bằng hai loại enzym, một enzym cắt hiếm (a

rare cutter) ví dụ như PstI hoặc EcoRI và một enzym cắt thường (a frequent
cutter) như MseI, TaqI. Kết quả là sinh ra những mảnh cắt có một đầu là trình tự
cắt hiếm và một đầu là trình tự cắt thường. Sau đó gắn bộ thích ứng (adapter)
vào hai đầu mảnh cắt. Các bộ thích ứng AFLP bao gồm hai phần: phần cốt lõi
(core sequence) và chuỗi trình tự đặc hiệu của enzym. Vị trí nhận biết của
enzym giới hạn trên các bộ thích ứng được loại bỏ bằng cách thay đổi một gốc
base ở đầu 5’. Ví dụ vị trí nhận biết của enzym giới hạn EcoRI là 5’-GAATTC3’, nhưng G trên bộ thích ứng được thay bằng C, do vậy mà sau khi đã gắn bộ
thích ứng vào mảnh ADN hệ gen thì vị trí này không thể bị cắt một lần nữa vì đã
mất vị trí đặc hiệu. Tương tự như vậy, vị trí nhận biết của enzym giới hạn MseI
là 5’-TTAA-3”. Nhưng gốc T ở đầu 5’ trên bộ thích ứng được thay bằng G. Nhờ
kỹ thuật này mà ADN hệ gen có thể được cắt và gắn đồng thời. Khi cắt ADN hệ
gen bằng hai enzym EcoRI và MseI, sẽ có 3 loại mảnh cắt gồm: mảnh có hai đầu
cắt bởi MseI, mảnh có hai đầu cắt bởi EcoRI, mảnh cắt có một đầu là EcoRI và
một đầu là MseI.
-

Bước 2: Nhân bội những mảnh cắt giới hạn sử dụng mồi đặc hiệu bổ sung

với trình tự của bộ thích ứng và trình tự giới hạn của enzym. Bước này được
thực hiện nhằm giảm bớt số lượng quá lớn của các mảnh ADN sau khi cắt và
gắn bộ thích ứng. Sự nhận bội chọn lọc đạt được bởi sử dụng những mồi được
18

Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

kéo dài phía điểm cắt giới hạn bằng cách thêm các nucleotid vào vị trí cắt. Do
vậy mà chỉ có những mảnh ADN có trình tự bổ trợ với các base thêm vào mới
được nhân bội. Phản ứng thứ nhất gọi là nhân bội sơ bộ (pre-amplification) hay
tiền nhân bội. Phản ứng thứ hai gọi là nhân bội chọn lọc (selective PCR). Các
mồi AFLP gồm có ba phần: Chuỗi cốt lõi (CORE), chuỗi đặc hiệu enzym (ENZ)
và phần thêm vào các nucleotit chọn lọc (EXT).
Sử dụng phương pháp này có thể tạo ra một bộ tập hợp những mảnh cắt
giới hạn nhờ PCR mà không cần biết trình tự của chúng, cho phép nhân đặc hiệu
một số lượng lớn những mảnh cắt giới hạn. Một bộ gồm tập hợp lượng lớn
những mảnh cắt ADN có thể phân tích đồng thời, phụ thuộc vào độ phân giải
của hệ thống phát hiện.
-

Bước 3: Điện di các sản phẩm của phản ứng PCR nhờ hệ thống chạy điện

di trên gel polyacrylamit. Thường là từ 50-100 mảnh cắt giới hạn được nhân lên
và phát hiện trên gel polyacrylamit biến tính nhờ sử dụng đồng vị phóng xạ
hoặc nhuộm bạc. Kỹ thuật AFLP cung cấp khả năng nhận dạng ADN lý tưởng
từ ADN của bất kỳ nguồn gốc nào. Đây là một kỹ thuật thiết thực và đáng tin
cậy bởi sự nghiêm ngặt của điều kiện phản ứng.
Tính hợp lý của việc sử dụng hai enzym cắt là ở chỗ: 1) Enzym cắt thường
sẽ sinh ra những đoạn ADN ngắn, nằm trong miền kích thước lý tưởng cho việc
nhân bội và phân tách trên gel polyacrylamit; 2) Số lượng các mảnh ADN được
nhân bội sẽ giảm xuống nhờ sử dụng enzym cắt thường bởi vì chỉ có những
mảnh cắt bởi một đầu là enzym cắt hiếm và một đầu là enzym cắt thường mới
được nhân lên; 3) Việc đánh dấu một đầu của mồi ngăn cản sự xuất hiện alen

kép; 4) Sử dụng hai loại mồi sinh ra tính linh hoạt lớn trong việc điều chỉnh số
lượng ADN nhân bội. 5) Một lượng lớn đa hình khác nhau có thể được sinh ra
khi nhân bội bằng những tổ hợp mồi khác nhau.
Tính đặc hiệu của loại đa hình này còn thể hiện bởi trình tự đặc hiệu và số
lượng của các nucleotit được thêm vào đầu 3’ của mỗi mồi. Theo tính toán, cứ
19


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

thêm một nucleotit vào mồi AFLP thì số lượng các chủng loại alen ADN nhân
bội trong phản ứng PCR lại giảm xuống 4 lần vì trong số các mảnh ADN chỉ có
một trong 4 nucleotit được chọn lọc và nhân bội. Như vậy là thêm 2 nucleotit
vào đầu của mỗi mồi thì số lượng các chủng loại alen ADN giảm xuống 16 lần,
nếu thêm vào 3 nucleotit thì số lượng alen giảm xuống 64 lần. Việc thêm các
nucleotit vào 2 đầu của các mồi AFLP dẫn đến kết quả là tạo ra những bộ phụ
(subset) của bộ đa hình gốc. Điều này chỉ ra rằng việc cho thêm các nucleotit lựa
chọn là con đường chính xác và có hiệu quả để lựa chọn một bộ đặc hiệu những
mảnh cắt cho quá trình nhân bội. Kỹ thuật AFLP có thể tạo ra số lượng chỉ thị di
truyền nhiều nhất so với các kỹ thuật khác đối với mỗi tổ hợp mồi. Lượng ADN
tổng số tiêu tốn cho kỹ thuật này lại rất ít. Đây là một phương pháp có hiệu quả
cả trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen.
Tuy nhiên AFLP là chỉ thị di truyền trội, do đó không thể phân biệt giữa thể
đồng hợp tử và dị hợp tử, và giá thành cho nghiên cứu là tương đối cao.

20

Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

Hình 2.5: Nguyên lí của phản ứng AFLP
2.4.7. Chỉ thị vi vệ tinh (SSR)

Chỉ thị vi vệ tinh, là những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm
những đơn vị lặp lại gồm từ 1 đến 6 nucleotit, theo kiểu lặp lại ngắn. SSR đã
được nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Hamada và Kakunaga, 1982; Weber và
cs., 1989), và cho đến nay nó được tìm thấy trong các hệ gen của một số cơ thể
Eukaryot khác như các gia cầm, động vật có vú (Cheng và cs., 1994; Love và
21


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

cs., 1990; Moran, 1993; Serikawa và cs., 1992), cá và trên vài loài cây một lá
mầm và hai lá mầm (Morgante và cs., 1993; Wang và cs., 1994). Bản chất đa
hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen
nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Giá
trị của SSR là ở chỗ nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ
rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR. Những
chuỗi đa hình đơn giản này đã được ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối
tượng động vật và thực vật (Tautz và Renz, 1984). Ở người, SSR được gọi là thế
hệ thứ hai của các chỉ thị phân tử. Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đã được
xác định trên các cây rừng nhiệt đới, cây bắp cải (Lagercrantz và cs., 1993), lúa
mì (Roder và cs., 1995) và 34 giống cây trồng khác (Morgante và Oliveri, 1993).

Những kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra rằng ở thực vật, SSR mang trình tự lặp
lại (AT)n nhiều hơn so với ở động vật, trong khi ở những loài động vật thì lại
giàu SSR kiểu (GT)n hơn. Những nghiên cứu trên lúa (Wu và Tanksley, 1993),
ngô (Senio và Heun, 1993) và Arabidopsis cũng cho kết quả tương tự. Nghiên
cứu sàng lọc thư viện genome lúa cho thấy có khoảng 5.700-10.000 vi vệ tinh ở
lúa (McCouch và cs., 1997).

Hình 2.6: Nguyên lí của phản ứng microsatellite
22


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

2.5. CÁC KĨ THUẬT PHÂN TỬ
2.5.1. Phương pháp CTAB( Hexadecyl trimethyl ammonium

bromid).
2.5.1.1.Tách chiết DNA
-

-

-

Nguyên lý chung:
Bước 1: phá vỡ màng tế bào và màng nhân.
Bước 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, như các protein,
polycharide.

Bước 3: tủa axit nucleic.
Bước 4: hòa tan cặn DNA .
Yêu cầu:
+
DNA đảm bảo độ tinh khiết.
+
Đảm bảo nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp.
Tách chiết DNA mô thực vật bằng phương pháp cơ học:
Bước 1: phá vỡ màng tế bào và màng nhân bằng cách cho dung dịch phá tế bào
và protenase K.
Bước 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, như các protein,
polycharide. Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch(phenol: chloroform:
isoamylalcohol), lắc mạnh cho đến khi dung dịch có màu trắng sữa.
Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha:
+

Pha trên là dung dịch lỏng chứa DNA

+

Pha giữa là phần dung dịch chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa.

+

Pha dưới đáy chứa hóa chất

Bước 3: tủa axit nucleic.
Tủa bằng cồn tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt nhất ở -20 oC trong 30 phút hoặc
0 oC qua đêm. Hầu như các phân tử DNA đều bị kết tủa.
Tủa bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1) ở 0 oC các phân tử DNA có trọng lượng

phân tử thấp không bị kết tủa.
Sau đó ly tâm sẽ thu được cặn(DNA và RNA) và cặn được rửa bằng cồn 70% để
loại bỏ muối và isopropanol còn lại.
23


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

Bước 4: hòa tan cặn và xử lý loại bỏ RNA bằng enzyme Rnase. Sau đó kết tủa
lại được DNA.
2.5.1.2.Tủa và tinh sạch DNA bằng muối natri acetate và ethanol
-

Nguyên lý: khi có mặt của cation đơn hóa trị và 2-3 lần thể tích cồn tuyệt đối thì
các axit nucleic trong dung dịch sẽ tủa xuống ở nhiệt độ thấp từ 0 oC- 70 oC. Thời
gian ủ càng lâu thì hiệu suất thu hồi axit nucleic càng lớn. Thông thường ta ủ
qua đêm ở nhiệt độ -20 oC. Axit nucleic sẽ lắng xuống khi ly tâm ở nhiệt độ 4 oC.
Tiếp theo là rửa tủa ở cồn 70%. Sau khi ly tâm ngắn, lượng muối dư và nước

-

được gạn bỏ.
Phương pháp tiến hành:
+ Thêm 1/10 lần thể tích dung dịch muối natri acetate(NaOAc) và 2 lần thể +
+
+

tích cồn tuyệt đối vào dung dịch axit nucleic để tủa

Ủ 30 phút ở nhiệt độ -70 oC hoặc qua đêm ở nhiệt độ -20 oC.
Ly tâm 15 phút ở nhiệt độ 4 oC với tốc độ 14000 vòng/phút. Gạn bỏ từ từ

dịch nổi và úp ngược ống xuống khăn giấy để làm khô.
+ Thêm 2 lần thể tích ethanol 80%, ủ 5-10 phút ở nhiệt độ phòng . Sau khi ly
tâm 5 phút, gạn bỏ và làm khô ống ly tâm như trên.
+ Đặt máy ly tâm vào máy đông khô chân không, làm khô axit nucleic
khoảng 5-10 phút hoặc cho tới khi mẫu khô hoàn toàn.
+ Hòa tan axit nucleic trong đệm TE.
2.5.2. . Điện di.

Phương pháp điện di trong gel(keo) thường được sử dụng để phân li DNA,
RNA,oligonucleotide,protein… Sau đó có thể tinh chế các chất đó. Việc phân li
các chất dựa trên hình thái và độ lớn các chất.

Thông thường sử dụng gel agarose và polyacrylamide nhưng gel agarose
cho phép phân li nucleic acid lớn hơn 1kb còn polyacrlamide dùng để phân li
các đoạn acid nucleic nhỏ hơn 1kb.
-

Nguyên lý:
24


Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13

Khi ở trong điện trường, do tích điện (-) nên các phân tử DNA dịch chuyển
về phía cực(+) và với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào khối lượng phân tử. Các

đoạn DNA càng lớn thì dịch chuyển càng chậm. Kết quả là từ một điểm chung
các đoạn DNA khác nhau dịch chuyển về một hướng tạo thành một làn, và trên
làn đó có các đoạn DNA khác nhau phân bố ở các vị trí khác nhau tương ứng
với độ lớn của chúng.
+

Quy trình điện di:
Chuẩn bị gel: Cho 0.8 g agaroza vào 100 ml dung dịch đệm TAE 1x. Đun

cho agaroze tan hoàn toàn. Để nguội 50 – 600C, đổ dung dịch agaroza vào khuôn
gel đã cài sẵn răng lược. Sau 30 – 60 phút, khi gel đã đông cứng đặt vào bể điện
di. Đổ đệm TAE 1x ngập cách mặt gel từ 1 – 2 mm, rút lược ra.
+

Tra mẫu agaroza: Mẫu ADN trộn 1.5 ml màu bromophenol blue và được

tra vào các giếng trên gel. Chạy điện di cùng thang marker chuẩn để xác định
kích thước phân tử
+

Chạy điện di: 100V-40mA. Quan sát màu bromophenol blue để xác định

thời gian dừng
+

Nhuộm ADN: Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn gel và ngâm vào dung

dịch EtBr nồng độ 0.5 mg/ml trong 10 phút và được lắc nhẹ trên máy lắc. Sau đó
rửa sạch bản gel bằng nước cất.
+

Quan sát và chụp ảnh: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254

nm và trên máy soi ADN. Quan sát thấy ADN hiện lên dưới dạng các vạch sáng
và được chụp trên máy GDS 8000.
2.5.3. Phương pháp PCR

2.5.3.1.Khái niệm chung
Kỹ thuật PCR do Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Đây là kỹ thuật
của sinh học phân tử cho phép nhân bản một đoạn ADN mong muốn từ hệ gen
ADN của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao.
25