Xây dựng phương pháp nghiên cứu tối ưu nhằm phân tích sự đa dạng di truyền của giống loài hoàng liên gai (berberidaceae)

BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cô
giáo ThS. Lưu Thúy Hòa, Viện Sinh – Nông, trường Đại học Hải Phòng và
Ban lãnh đạo Viện Sinh – Nông, trường Đại học Hải Phòng đã nhiệt tình chỉ
bảo, giúp đỡ em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực
tập.
Đồng thời em cũng xin được trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo và
các cộng tác viên hiện đang công tác tại Bộ môn thực vật, Bộ môn Hóa phân
tích của Trường đại học Dược Hà Nội và Bộ môn Kỹ thuật di truyền của Viện
Di truyền nông nghiệp (thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho em thực hiện những công việc liên quan trong quá
trình thực tập.
Cuối cùng, tôi cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đặc biệt là ba mẹ đã
luôn ở bên động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình thực tập này.

Hải Phòng, ngày 2 tháng 6 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Hùng Cường


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

DANH MỤC BIỂU BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Lớp: Công nghệ sinh học K13


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism (Tính đa hình chiều

dài các phân đoạn được nhân bản)
cs

Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotit triphotphat

EDTA

Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid

Kb

Kilobase

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

RAPD

Random Amplified Polymorphism DNA (Phân tích ADN đa

hình được nhân bản ngẫu nhiên)
RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism (Phân tích chiều dải

các phân đoạn ADN cắt hạn chế)
SDS

Sodium Dodecyl Sulphat

SSR

Simple Sequence Repeats

STS

Sequense Tagged Site

TAE

Tris - Acetate - EDTA

TE

Tris - EDTA

Tris

Trioxymetylaminometan

CTAB

Cetyl trimethylammonium bromide

EtBr

Ethidium bromide

ISSRs

Inter Simple Sequence Repeats

rDNA

Ribosomal DNA

HPLC

High Performance Liquid Chromatography


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.Đặt vấn đề

Berberin là alcaloid có nhân isoquilolin (Khosla, 1992; Rastogi và cộng sự,
1993). Đó là hoạt chất được ứng dụng từ lâu đời trong các nền y học truyền thống
trên thế giới để chữa các bệnh của các nước nghèo do đặc tính kháng khuẩn, nấm,
đơn bào (Đỗ Huy Bích, 2006), berberin có thể sử dụng để chống lại
Staphylococcus aureus đã kháng kháng sinh Methicillin (Yu HH và cs, 2005),…và
ngày nay nó có tiềm năng rất lớn trong điều trị các bệnh đang phát triển như hạ
đường huyết (Wang Y và cs 2010, Gu Y và cs 2010...), ung thư (Tang J và cs
2009, Kim JB và cs 2009, Pinto-Garcia L và cs 2010).
Trên thế giới đã xác định khoảng 150 loài thực vật bậc cao có berberin,
thuộc 23 chi và 7 họ, bao gồm: Na (Annonaceae), Hoàng liên (Berberidaceae), Cải
cần (Fumariaceae), Tiết dê (Menispermaceae), Thuốc phiện (Papaveraceae), Mao
lương (Ranunculaceae), Cam (Rutaceae), trong đó các họ chủ yếu là
Berberidaceae, Menispermaceae, Papaveraceae, Ranunculaceae và Rutaceae
(Nguyễn Kim Cẩn, 2002).
Họ Berberidaceae là một họ thực vật có hoa, bao gồm 15-17 chi thực vật có
hoa. Họ này thuộc bộ mao lương (Ranunculales). Họ này phân bố ở các vùng ôn
đới của phía bắc bán cầu (Judd và cộng sự, 1999). Họ Berberidaceae chứa khoảng
570-700 loài, trong đó phần lớn (khoảng 450-600 loài) thuộc về chi Berberis. Các
loài trong họ là các cây thân gỗ, cây bụi hoặc cây thân thảo có nguồn gốc từ các
vùng ôn đới và cận nhiệt đới của châu Âu, châu Á, châu Phi, Bắc và Nam Mỹ
(Ahrendt 1961).
Ở Việt Nam, đã xác định có 26 loài thực vật thuộc 5 họ khác nhau chứa
berberin

là

Berberidaceae,

Menispermaceae,
6

Ranunculaceae,

Rutaceae


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

Papaveraceae ( Nguyễn Kim Cẩn, 2002). Trong đó, các cây thuộc họ
Berberidaceae bị khai thác triệt để để làm thuốc và buôn bán ở thị trường trong
nước để làm thuốc (Hoàng liên, Hoàng liên ô rô,…) và xuất khẩu qua Trung Quốc.
Điều này dẫn đã dẫn đến sự cạn kiệt nguồn tài nguyên các loài cho berberin ở Việt
Nam và trở thành những cây thuốc quý hiếm được ghi trong sách đỏ (Nguyễn Tiến
Bân, 2007).
Việc phân loại các loài trong chi Berberis, Mahonia, Podophyllum trong họ
Berberidaceae rất phức tạp với những đặc điểm hình thái giống nhau giữa các loài
trong cùng chi. Sự phân biệt giữa các loài khó khăn do phần trăm đa bội cao và do
lai tạo (Cadic và Decourtye 1987). Điều này đã dẫn đến nhầm lẫn trong việc xác
định loài trong thu hái, sử dụng.
Trên thế giới đã có những nghiên cứu phân biệt các loài trong chi ở mức độ
phân tử đối với một số loài B. asiatica Roxb, B. aristata DC., B. lycium Royle
(Subramani Paranthaman Balasubramani và cs, 2011; Vivek Tripathi và cs,
2013,... ), loài Podophyllum hexandrum (Md. Afroz và cs, 2009, Pradeep Kumar
Naik và cs, 2010; Akshay Nag và cs, 2013) hoặc so sánh các loài trong họ
Berberidaceae (C. Roß và W. Durka, 2006, Mehdi Rezaei và cs, 2011) nhưng ở
Việt Nam vẫn chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu đánh giá, tư liệu hoá

ở mức độ phân tử về đa dạng di truyền các tập đoàn cây này một cách sâu rộng và
có hệ thống.
Từ những lý do trên, việc nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của các
giống/loài cho berberin trong họ Hoàng liên ở mức phân tử là cần thiết và cấp bách
để định hướng cho công tác thu thập, bảo tồn khai thác và sử dụng các nguồn gen
cây bản địa quý này một cách có hiệu quả.
2. Mục đích nghiên cứu
Xây dựng phương pháp nghiên cứu tối ưu nhằm phân tích sự đa dạng di truyền
của giống/loài Hoàng liên gai (berberidaceae)
7


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

3. Yêu cầu
- Điṇh danh chính xác các giống/loài Hoàng liên trên đăc c điểm hình thái.
- Xác định các chỉ thị đặc trưng, các alen hiếm nhận dạng chính xác các giống/loài
Hoàng liên gai ưu tú.
- Đánh giá sự khác biệt di truyền giữa các giống/loài Hoàng liên gai qua việc phân
tích RAPD với primer ngẫu nhiên
- Mô tả quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS

8


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.Vị trí phân loại khoa học
Họ Hoàng mộc, còn gọi là họ Hoàng liên gai (Berberidaceae), là một họ
của khoảng 14-15 chi thực vật có hoa. Họ này thuộc bộ Mao lương
(Ranunculales). Họ chứa khoảng 570-700 loài, trong đó phần lớn (khoảng 450-600
loài) thuộc về chi Berberis. Các loài trong họ là các loại cây thân gỗ, cây bụi hoặc
cây thân thảo chủ yếu là thường xanh.
Phân loại khoa học của họ Berberidaceae trong hệ thống phân loại thực
vật như sau (Lê Đình Bích và Trần Văn Ơn, 2007):
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae)
Liên bộ Hoàng liên (Ranunculanae)
Bộ Hoàng liên (Ranunculales)
Họ Hoàng liên gai (Berberidaceae)
Các chi
Achlys
Berberis - hoàng liên gai (hoàng mù), hoàng mộc, tiểu bá, nghêu hoa
Bongardia
Caulophyllum - hồng mao thất
Diphylleia - sơn hà diệp
Dysosma - bát giác liên
Epimedium - dâm dương hoắc
Gymnospermium
Jeffersonia - tiên hoàng liên

9


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

Leontice - mẫu đan (đơn) thảo, không nhầm với các loài hoa mẫu đơn
Mahonia - hoàng liên ô rô, thổ hoàng liên, thổ hoàng bá, thập đại công lao
Nandina - nam thiên trúc
Podophyllum - Podophyllum tonkinense là bát giác liên, hay Podophyllum
hexandrum là bát giác liên sáu nhị.
Ranzania
Vancouveria
2. Đặc điểm thực vật và phân bố họ Hoàng liên gai (Berberidaceae)
2.1. Đặc điểm chung của họ Hoàng liên gai (Berberidaceae)
Hoàng liên gai là loại cây cỏ nhiều năm, cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, thừờng
xanh hoặc rụng lá. Thân có hoặc không có gai. Lá đơn hay kép, mọc so le, đối hoặc
mọc ở gốc. Lá kèm có hoặc không. Gân lá hình lông chim hoặc hình chân vịt. Hoa
đều, lưỡng tính, mẫu 3, mọc thành cụm hoặc đơn độc. Cụm hoa dạng chùm,
bông, tán, xim, hoặc chùy. Hoa có cuống hoặc không. Lá bắc có hoặc không. Đài
6-9, thường dạng cánh hoa, rời, xếp 2-3 vòng. Tràng 6, rời. Tuyến mật có hoặc
không. Nhị 6, đối diện tràng; bao phấn 2 ô, mở bằng 2 van hoặc nứt dọc. Bầu trên,
nhìn bên ngoài như có 1 lá noãn; noãn nhiều, hiếm khi 1, đính noãn mép hoặc gốc;
vòi nhụy có hoặc không, đôi khi tồn tại ở quả.
Quả mọng, quả nang hoặc quả đại. Hạt 1 hoặc nhiều, nội nhũ phong phú.
2.2. Đặc điểm thực vật chi Berberis
Cây bụi thường xanh hoặc rụng lá. Thân cành trơn nhẵn hoặc có lông

măng, có rãnh hoặc không, có gai hoặc không, gai đơn hoặc chia làm 3-5 nhánh.
Lá đơn, mọc so le, mép có gai, nguyên hay cuốn ngoài.
Hoa đơn độc hay mọc thành cụm, dạng chùm, tán hoặc chùy. Hoa màu
vàng bóng, da cam, vàng đo đỏ, hay vàng nhạt, có khi vàng lục. Hoa mẫu 3; lá bắc
con thường 3, sớm rụng, dạng vảy. Đài 6, hiếm khi 3 hoặc 9, màu vàng. Tràng 6,
10


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

màu vàng, móng có mật. Nhị đối diện tràng; bao phấn mở bằng van. Bầu nhụy đối
xứng dạng chùy; noãn 1-12, hiếm khi 15; vòi nhụy rất ngắn. Quả mọng, thường
màu đỏ, đỏ sẫm hoặc đen; hình cầu, hình elip, thuôn dài, hình trứng hoặc trứng
ngƣợc; kích thước 6-20mm; vòi nhụy tồn tại hoặc không. Hạt 1-10, màu nâu đến
nâu đỏ hoặc đen, không có áo hạt (Võ Văn Chi, 2003; Ying Tsunshen, 2011)

Hình 2.1. Chi Berberis
Ở nước ta loài Berberis phân bố chủ yếu ở Sapa, trên núi Phan-xi-păng vùng
Bắc Hà thuộc tỉnh Lào Cai. Cây mọc trong rừng kín thường xanh mưa mùa ẩm,
rừng núi đá, ở độ cao khoảng 1000-1600m. Mùa hoa tháng 5-6, mùa quả tháng 610 (Võ Văn Chi, 2003).
2.3. Đặc điểm thực vật của chi Mahonia
Cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, thường xanh, cao 0,3 – 8 m. Không gai. Lá
kép hình lông chim lẻ, mọc so le, không cuống hoặc có cuống; lá chét 3 -4; lá chét
bên thường không cuống, lá chét tận cùng có cuống hoặc không cuống; mép lá
nguyên hay có khía răng thô hay đẹp. Cụm hoa mọc ở tận cùng, (1-) 3 – 18 chùm
11

BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

đơn hay phân nhánh, dài 3 – 35 cm, mọc đối diện với lá bắc. Cuống hoa dài 1,5 –
24 mm, đối diện với lá bắc, lá bắc ngắn hay dài hơn cuống hoa. Hoa màu vàng, lá
đài xếp ba vòng, cánh hoa xếp một vòng, gốc cánh hoa có hay không có
tuyến. Trung đới không kéo dài, nhọn đột ngột hay kéo dài ra rõ ràng. Bầu hình
gần cầu, noãn 1 – 7, vòi nhụy không có hoặc dài tới 3 mm, tồn tại ở quả. Quả
mọng, hơi xanh hay đen, thường có phấn. Hạt 1 -7 (Prabhakar P.K, Doble M.,
2009).
Chi Mahonia phân bố chủ yếu ở Đông và Đông Nam Á, ngoài ra còn có ở
Tây Bắc Mỹ, Trung Mỹ và Tây Nam Mỹ. Ở Trung Quốc có 31 loài (Ying
Junsheng và cs, 2011), ở Đài Loan có 2 loài (Sheng You Lu and Yuen Po Yang,
2003). Ở Việt Nam, chi Mahonia phân bố ở các khu vực Bắc Kạn, Lai Châu,
Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng,Lâm Đồng

Hình 2.2. Chi Mahonia

12


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

2.4. Đặc điểm thực vật chi Podophyllum
Podophyllum là một chi của các loài cây lâu năm thân thảo trong họ
Berberidaceae có nguồn gốc Đông Á và Đông Bắc Mỹ
Cây thảo sống nhiều năm, cao 30 - 50cm, thân rễ thô to, mọc ngang. Thân
thường mang một đến hai lá, đính lá dạng ngù. Phiến lá rộng đến 30cm, có 4 - 9
thùy nông, thùy dạng tam giác rộng hoặc hình tròn dài dạng trứng, đỉnh nhọn sắc,
mép lá có răng nhỏ. Hoa màu hồng đậm, gồm 5 - 8 hoa mọc tập trung ở gốc lá, hoa
rủ xuống, cuống hoa nhỏ, dài, cong. Lá đài 6, mặt ngoài có ít lông dài. Cánh hoa 6
dài 2cm. Nhị 6. Bầu thượng, đầu nhụy to, quả mọng hình bầu dục hoặc hình trứng.
Hạt nhiều.
Mùa hoa tháng 3 - 5, mùa quả chín tháng 7 - 9. Cây tái sinh bằng chồi từ
thân rễ vào vụ xuân hè. Cây sống dưới tán rừng ẩm trên núi, ở độ cao 800 - 900 m.
Mọc rải rác trên đất rừng nhiều mùn, ẩm, độ chiếu sáng yếu.
Ở Việt Nam các loài Podophyllum phân bố chủ yếu ở Hoà Bình (Đà bắc:
Chợ Bờ), Hà Tây (Ba Vì), Lạng Sơn (núi Khau Khú)

Hình 2.3. Chi Podophyllum
13


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

3. Công dụng và tình hình khai thác sử dụng của các loài chứa berberin
Berberin là alcaloid có nhân isoquilolin, có trong khoảng 150 loài thực vật

bậc cao (Nguyễn Kim Cẩn, 2002; Phạm Thanh Kỳ, 2002).
Nó là hoạt chất được ứng dụng từ lâu đời trong các nền y học truyền thống trên thế
giới để chữa các bệnh của các nước nghèo do đặc tính kháng khuẩn, nấm, đơn bào,
…và ngày nay nó có tiềm năng rất lớn trong điều trị các bệnh đang phát triển như
tiểu đường, ung thư, tăng mỡ máu,… Các tác dụng đã được chứng minh của
berberin bao gồm:
(1) Tác dụng kháng khuẩn (Đỗ Huy Bích, 2006) (Yu HH, Kim KJ, Cha JD
và cs, 2005).
(2) Tác dụng kháng nấm, lợi mật, kháng đơn bào, hạ huyết áp, chống loét
đường tiêu hóa (Đỗ Huy Bích, 2006).
(3) Tác dụng chống ung thư (Sun Y và cs., 2009; Tang J và cs., 2009) (Kim
JB và cs., 2009), (Serafim TL và cs., 2008), (Pinto-Garcia L và cs., 2010),….
(4) Tác dụng hạ đường huyết (Wang Y và cs., 2010; Wang C và cs., 2009) ,
(Gu Y và cs, 2010; Zhang H và cs., 2009; Wang JM và cs, 2009; Zhang Y và cs.,
2008).
(5) Tác dụng bảo vệ gan (Chang XX và cs., 2009) (Sun X và cs, 2009).
.v.v.
Với các tác dụng truyền thống và các các tác dụng mới phát hiện trong điều
trị tiểu đường và ung thư cũng như tính an toàn trong sử dụng, berberin ngày càng
được sử dụng nhiều trên thế giới cũng như ở Việt Nam với hàng chục sản phẩm
đang được sản xuất tại các công ty Dược trong nước. Điều này dẫn đến việc khai
thác ồ ạt nguồn cho thực vật cho beberin tự nhiên. Đó là một trong những nguyên
nhân quan trọng dẫn đến suy kiệt những nguồn gen này.
4. Tổng quan về những chỉ thị phân tử phổ biến dùng để phân tích đa dạng di
truyền
4.1 Phương pháp chỉ thị hình thái

14

BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

Gen - thể hiện bản chất di truyền, thường thể hiện một hay nhiều tính trạng có thể
đo đếm được – gen đó xem như gen chỉ thị. Chỉ thị hình thái là một trong những
phương pháp sơ khai trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền.
Tuy nhiên, số chỉ thị hình thái hiện diện trong tự nhiên cũng rất ít, không thỏa
mãn yêu cầu của nhiều chương trình chọn giống và chỉ có quy mô hình thái (cơ 19
quan) hoặc ở giai đoạn phát triển đặc biệt của cá thể. Sự thể hiện các chỉ thị hình
thái bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường, điều này làm cho chỉ thị hình thái kém
thu hút trong cải tiến giống cây trồng.
4.2. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism, Đa hình chiều dài các
mảnh phân cắt giới hạn. Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột biến tự nhiên ở
những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen. Mỗi loài sinh vật có một bộ
ADN genom đặc hiệu trong cấu trúc, vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn để
cắt phân tử ADN của hệ gen, người ta có thể nhận biết được những đoạn ADN có
chiều dài khác nhau bằng kỹ thuật lai ADN với những mẫu dò (probe). Đây là
nguyên lý kỹ thuật RFLP.
Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội, nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các
alen của cùng một locus. Do vậy, có thể phân biệt được các cá thể đồng hợp tử
(AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa). Đây là đặc điểm ưu việt của loại chỉ thị
này. Hạn chế của phương pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, đòi hỏi
nhiều trang thiết bị phòng thí nghiệm, đặc biệt là tiêu hao một lượng lớn ADN mà
số lượng đa hình thu được rất ít ỏi, thậm chí ở một số loài khó nhận được đa hình.
4.3. Chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) được Kary

phát minh năm 1985 (Kary Mullis và cs., 1985; 1990). Phương pháp này đã nhanh
chóng được sử dụng hầu hết ở các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới (Nair và cs.,
15


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

1996). Nhờ vào việc phát hiện ra loại enzym chịu nhiệt được tách từ một loại vi
khuẩn sống ở suối nước nóng có tên là Thermus aquaticus hoạt động tốt nhất ở
nhiệt độ 70-800C, người ta đã kết hợp với những tính chất cơ bản của ADN là có
khả năng duỗi xoắn ở một nhiệt độ thích hợp, có khả năng bắt cặp với những đoạn
ADN có trình tự nucleotit bổ sung với đoạn ADN khuôn mẫu và có khả năng nhân
đôi dưới xúc tác của enzym đặc hiệu để nhân bội những đoạn ADN khuôn mẫu.
Phản ứng PCR dựa trên nguyên tắc tổng hợp ADN nhờ enzym ADN Polymerase
chịu nhiệt (Taq, Pfu…) với sự có mặt của đoạn ADN khuôn mẫu, ADN mồi, các
nucleotit (dNTP) gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP và ion Mg 2+ hoạt động như một
chất xúc tác. Tuỳ theo bản chất của những đoạn mồi sử dụng mà có những hệ
thống chỉ thị đặc trưng gồm chỉ thị STS, RAPD, SSR, AFLP,v.v… Việc sáng chế
ra máy PCR sau đó giúp thực hiện được những phản ứng nhân bội AND dễ dàng.
4.4. Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites)
STS Olson nêu ra lần đầu tiên vào năm 1989 để nghiên cứu lập bản đồ gen ở
người ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời (Olson M. và cs., 1989). STS được đưa ra
nhờ việc xác định trình tự 2 đầu các đoạn mẫu dò RFLP, trên cơ sở đó người ra
thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR.
4.5. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic ADN)
RAPD được sinh ra bởi phản ứng PCR, do sự nhân bội những đoạn ADN hệ

gen, sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (random primer) dài khoảng 9-10
nucleotit dưới nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 370C) (Williams và cs., 1990). Sản
phẩm của phản ứng được phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhuộm trong
ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím. RAPD sinh ra những chỉ thị trội bởi
sự có mặt hay vắng mặt những alen ADN đặc trưng. Hạn chế của loại chỉ thị này
so với chỉ thị đồng trội RFLP là không phân biệt được thể dị hợp tử. Mặc dù vậy,
chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ ở những dòng nhị
16


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại. Lợi thế của loại chỉ thị này là
không cần biết những thông tin về trình tự (William và cs., 1993). Chỉ thị RAPD
còn có thể sử dụng trong việc điền vào những chỗ trống trên bản đồ phân tử RFLP
(Chang và Meyerowitz, 1991), lập bản đồ gen kháng đạo ôn ở lúa (Naqvi và cs.,
1995).
- Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD
Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không
cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản,
chất lượng.
ADN khuôn không cần độ tinh sạch cao. Thời gian thực hiện nhanh, khả
năng nhân bản cao.
Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thường được sử
dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và
nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao.

Do chỉ thị RAPD có hạn chế là độ nhạy bị phụ thuộc vào điều kiện của phản
ứng, đôi khi kết quả không lặp lại được, nên người ta đã khắc phục bằng cách nhân
dòng những alen RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết kế những
đoạn mồi dài khoảng 20bp từ cả hai đầu và gọi là chỉ thị SCARs (Sequence
Characterized Amplified Region).
-

Ứng dụng cũa kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời,

mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do ưu điểm
dễ thực hiện và chi phí thấp.
Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD: Đánh giá đa dạng di truyền: đã được áp
dụng trên các đối tượng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây,
khoai tây, cà chua,vv... Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ ADN, điều kiện thí nghiệm,
chương trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao. Đối với
17


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

nấm bệnh thực vật thì kỹ thuật RAPD đã được áp dụng để phân tích đa dạng di truyền
của nhiều loại nấm khác nhau: Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not,
Corynespora cassiicola (Nguồn NUWS20050722.084916/public/04Chapter3.pdf)
Nhận diện chỉ thị phân tử: ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối
tương quan giữa kiểu gen RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số

giống lúa ở Việt Nam (Nguyễn Thị Lang, 2002). Ngoài ra kỹ thuật RAPD còn
được áp dụng xây dựng bản đồ gen (Nguyễn Thị Lang, 2002).
-

Những cải tiến của kỹ thuật RAPD
Đã có vài cải tiến của kỹ thuật RAPD được mô tả. Kỹ thuật thứ nhất là sử

dụng cùng lúc 2 primer khác nhau thay vì sử dụng 1 primer như kỹ thuật RAPD
thông thường. Phương pháp này có thể làm tăng hoặc giảm đi số alen so với khi sử
dụng một primer. Việc lựa chọn, sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau một cách
phù hợp cũng có thể làm tăng tính đa hình của những primer cho sản phẩm ít đa
hình. Cải tiến thứ 2 là cắt ADN bằng các enzyme giới hạn trước hoặc sau khi thực
hiện phản ứng PCR. Sự cắt này cũng có thể tạo ra hai kết quả. Một là có thể làm
giảm số lượng các alen khó xác định (complex band), điều đó làm dễ dàng hơn cho
việc đánh giá đa dạng di truyền. Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu có hạn chế về
sự đa hình. Tuy nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vào chiến lược nhằm
làm tăng số chỉ thị đa hình có thể hoặc đạt được các chỉ thị đồng trội. Những cải
tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuật RAPD cụ thể là tốc độ, giá
thành và sử dụng phức tạp hơn (Kurt Weising và cs, 1995).

18


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

Hình 2.4. Nguyên lí của phản ứng RAPD

4.6. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
AFLP được sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu lập bản đồ gen và xác
định chỉ thị phân tử liên kết gen. Kỹ thuật tạo ra các loại chỉ thị này được gọi là
nhân bội chọn lọc những mảnh cắt giới hạn (Selective Restriction Fragment
Amplication - SRFA). Phương pháp linh hoạt này có thể phát hiện được sự có mặt
của những mảnh cắt giới hạn trong bất kỳ loại ADN nào (Vos và cs., 1995).
Nguyên lý của kỹ thuật SRFA dựa trên cơ sở nhân bội có chọn lọc những
mảnh cắt giới hạn từ ADN hệ gen. Kỹ thuật này bao gồm ba bước:
+ Bước 1: ADN hệ gen được cắt bằng hai loại enzym, một enzym cắt hiếm
(a rare cutter) ví dụ như PstI hoặc EcoRI và một enzym cắt thường (a frequent
cutter) như MseI, TaqI. Kết quả là sinh ra những mảnh cắt có một đầu là trình tự
cắt hiếm và một đầu là trình tự cắt thường. Sau đó gắn bộ thích ứng (adapter) vào
hai đầu mảnh cắt. Các bộ thích ứng AFLP bao gồm hai phần: phần cốt lõi (core
19


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

sequence) và chuỗi trình tự đặc hiệu của enzym. Vị trí nhận biết của enzym giới
hạn trên các bộ thích ứng được loại bỏ bằng cách thay đổi một gốc base ở đầu 5’.
Ví dụ vị trí nhận biết của enzym giới hạn EcoRI là 5’-GAATTC-3’, nhưng G trên
bộ thích ứng được thay bằng C, do vậy mà sau khi đã gắn bộ thích ứng vào mảnh
ADN hệ gen thì vị trí này không thể bị cắt một lần nữa vì đã mất vị trí đặc hiệu.
Tương tự như vậy, vị trí nhận biết của enzym giới hạn MseI là 5’-TTAA-3”.
Nhưng gốc T ở đầu 5’ trên bộ thích ứng được thay bằng G. Nhờ kỹ thuật này mà
ADN hệ gen có thể được cắt và gắn đồng thời. Khi cắt ADN hệ gen bằng hai

enzym EcoRI và MseI, sẽ có 3 loại mảnh cắt gồm: mảnh có hai đầu cắt bởi MseI,
mảnh có hai đầu cắt bởi EcoRI, mảnh cắt có một đầu là EcoRI và một đầu là MseI.
+ Bước 2: Nhân bội những mảnh cắt giới hạn sử dụng mồi đặc hiệu bổ sung
với trình tự của bộ thích ứng và trình tự giới hạn của enzym. Bước này được thực
hiện nhằm giảm bớt số lượng quá lớn của các mảnh ADN sau khi cắt và gắn bộ
thích ứng. Sự nhận bội chọn lọc đạt được bởi sử dụng những mồi được kéo dài
phía điểm cắt giới hạn bằng cách thêm các nucleotid vào vị trí cắt. Do vậy mà chỉ
có những mảnh ADN có trình tự bổ trợ với các base thêm vào mới được nhân bội.
Phản ứng thứ nhất gọi là nhân bội sơ bộ (pre-amplification) hay tiền nhân bội.
Phản ứng thứ hai gọi là nhân bội chọn lọc (selective PCR). Các mồi AFLP gồm có
ba phần: Chuỗi cốt lõi (CORE), chuỗi đặc hiệu enzym (ENZ) và phần thêm vào
các nucleotit chọn lọc (EXT).
Sử dụng phương pháp này có thể tạo ra một bộ tập hợp những mảnh cắt giới
hạn nhờ PCR mà không cần biết trình tự của chúng, cho phép nhân đặc hiệu một số
lượng lớn những mảnh cắt giới hạn. Một bộ gồm tập hợp lượng lớn những mảnh
cắt ADN có thể phân tích đồng thời, phụ thuộc vào độ phân giải của hệ thống phát
hiện.
+ Bước 3: Điện di các sản phẩm của phản ứng PCR nhờ hệ thống chạy điện
di trên gel polyacrylamit. Thường là từ 50-100 mảnh cắt giới hạn được nhân lên và
20


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

phát hiện trên gel polyacrylamit biến tính nhờ sử dụng đồng vị phóng xạ hoặc
nhuộm bạc. Kỹ thuật AFLP cung cấp khả năng nhận dạng ADN lý tưởng từ ADN

của bất kỳ nguồn gốc nào. Đây là một kỹ thuật thiết thực và đáng tin cậy bởi sự
nghiêm ngặt của điều kiện phản ứng.
Tính hợp lý của việc sử dụng hai enzym cắt là ở chỗ: 1) Enzym cắt thường
sẽ sinh ra những đoạn ADN ngắn, nằm trong miền kích thước lý tưởng cho việc
nhân bội và phân tách trên gel polyacrylamit; 2) Số lượng các mảnh ADN được
nhân bội sẽ giảm xuống nhờ sử dụng enzym cắt thường bởi vì chỉ có những mảnh
cắt bởi một đầu là enzym cắt hiếm và một đầu là enzym cắt thường mới được nhân
lên; 3) Việc đánh dấu một đầu của mồi ngăn cản sự xuất hiện alen kép; 4) Sử dụng
hai loại mồi sinh ra tính linh hoạt lớn trong việc điều chỉnh số lượng ADN nhân
bội. 5) Một lượng lớn đa hình khác nhau có thể được sinh ra khi nhân bội bằng
những tổ hợp mồi khác nhau.
Tính đặc hiệu của loại đa hình này còn thể hiện bởi trình tự đặc hiệu và số
lượng của các nucleotit được thêm vào đầu 3’ của mỗi mồi. Theo tính toán, cứ
thêm một nucleotit vào mồi AFLP thì số lượng các chủng loại alen ADN nhân bội
trong phản ứng PCR lại giảm xuống 4 lần vì trong số các mảnh ADN chỉ có một
trong 4 nucleotit được chọn lọc và nhân bội. Như vậy là thêm 2 nucleotit vào đầu
của mỗi mồi thì số lượng các chủng loại alen ADN giảm xuống 16 lần, nếu thêm
vào 3 nucleotit thì số lượng alen giảm xuống 64 lần. Việc thêm các nucleotit vào 2
đầu của các mồi AFLP dẫn đến kết quả là tạo ra những bộ phụ (subset) của bộ đa
hình gốc. Điều này chỉ ra rằng việc cho thêm các nucleotit lựa chọn là con đường
chính xác và có hiệu quả để lựa chọn một bộ đặc hiệu những mảnh cắt cho quá
trình nhân bội. Kỹ thuật AFLP có thể tạo ra số lượng chỉ thị di truyền nhiều nhất so
với các kỹ thuật khác đối với mỗi tổ hợp mồi. Lượng ADN tổng số tiêu tốn cho kỹ
thuật này lại rất ít. Đây là một phương pháp có hiệu quả cả trong nghiên cứu đa
dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen. Tuy nhiên AFLP là chỉ thị di
21


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

truyền trội, do đó không thể phân biệt giữa thể đồng hợp tử và dị hợp tử, và giá
thành cho nghiên cứu là tương đối cao.

Hình 2.4. Nguyên lí của phản ứng AFLP
4.7. Chỉ thị vi vệ tinh (SSR)
22


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

Chỉ thị vi vệ tinh, là những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm
những đơn vị lặp lại gồm từ 1 đến 6 nucleotit, theo kiểu lặp lại ngắn. SSR đã được
nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Hamada và Kakunaga, 1982; Weber và cs.,
1989), và cho đến nay nó được tìm thấy trong các hệ gen của một số cơ thể
Eukaryot khác như các gia cầm, động vật có vú (Cheng và cs., 1994; Love và cs.,
1990; Moran, 1993; Serikawa và cs., 1992), cá và trên vài loài cây một lá mầm và
hai lá mầm (Morgante và cs., 1993; Wang và cs., 1994). Bản chất đa hình của SSR
có thể được sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn
mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Giá trị của SSR là ở chỗ nó
sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản
chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR. Những chuỗi đa hình đơn giản này đã
được ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tượng động vật và thực vật

(Tautz và Renz, 1984). Ở người, SSR được gọi là thế hệ thứ hai của các chỉ thị
phân tử. Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đã được xác định trên các cây rừng
nhiệt đới, cây bắp cải (Lagercrantz và cs., 1993), lúa mì (Roder và cs., 1995) và 34
giống cây trồng khác (Morgante và Oliveri, 1993). Những kết quả nghiên cứu này
đã chỉ ra rằng ở thực vật, SSR mang trình tự lặp lại (AT)n nhiều hơn so với ở động
vật, trong khi ở những loài động vật thì lại giàu SSR kiểu (GT)n hơn. Những
nghiên cứu trên lúa (Wu và Tanksley, 1993), ngô (Senio và Heun, 1993) và
Arabidopsis cũng cho kết quả tương tự. Nghiên cứu sàng lọc thư viện genome lúa
cho thấy có khoảng 5.700-10.000 vi vệ tinh ở lúa (McCouch và cs., 1997).

23


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

Hình 2.6. Nguyên lí của phản ứng microsatellite
5. Các kĩ thuật phân tử
5.1. Phương pháp CTAB( Hexadecyl trimethyl ammonium bromid).
Tách chiết DNA
•
•

Nguyên lý chung:
Bước 1: phá vỡ màng tế bào và màng nhân.
Bước 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, như các

•
•
•
•
•

protein, polycharide.
Bước 3: tủa axit nucleic.
Bước 4: hòa tan cặn DNA .
Yêu cầu:
DNA đảm bảo độ tinh khiết.
Đảm bảo nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp.
Tách chiết DNA mô thực vật bằng phương pháp cơ học
Bước 1: phá vỡ màng tế bào và màng nhân bằng cách cho dung dịch phá tế
bào và protenase K.

24


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

•

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

Bước 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, như các
protein, polycharide. Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch(phenol:
chloroform: isoamylalcohol), lắc mạnh cho đến khi dung dịch có màu trắng

sữa.
Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha:
Pha trên là dung dịch lỏng chứa DNA
Pha giữa là phần dung dịch chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa.
Pha dưới đáy chứa hóa chất

•

Bước 3: tủa axit nucleic.
Tủa bằng cồn tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt nhất ở -20 oC trong 30 phút hoặc 0
o

C qua đêm. Hầu như các phân tử DNA đều bị kết tủa.

Tủa bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1) ở 0oC các phân tử DNA có trọng lượng phân
tử thấp không bị kết tủa.
Sau đó ly tâm sẽ thu được cặn(DNA và RNA) và cặn được rửa bằng cồn
70% để loại bỏ muối và isopropanol còn lại.
•

Bước 4: hòa tan cặn và xử lý loại bỏ RNA bằng enzyme Rnase. Sau đó kết

-

tủa lại được DNA.
b.2 Tủa và tinh sạch DNA bằng muối natri acetate và ethanol
Nguyên lý: khi có mặt của cation đơn hóa trị và 2-3 lần thể tích cồn tuyệt
đối thì các axit nucleic trong dung dịch sẽ tủa xuống ở nhiệt độ thấp từ 0 oC70 oC. Thời gian ủ càng lâu thì hiệu suất thu hồi axit nucleic càng lớn. Thông
thường ta ủ qua đêm ở nhiệt độ -20 oC. Axit nucleic sẽ lắng xuống khi ly tâm
ở nhiệt độ 4 oC. Tiếp theo là rửa tủa ở cồn 70%. Sau khi ly tâm ngắn, lượng

•

muối dư và nước được gạn bỏ.
Phương pháp tiến hành:
Thêm 1/10 lần thể tích dung dịch muối natri acetate(NaOAc) và 2 lần thể

•

tích cồn tuyệt đối vào dung dịch axit nucleic để tủa
Ủ 30 phút ở nhiệt độ -70 oC hoặc qua đêm ở nhiệt độ -20 oC.
25