DSpace at VNU: Ứng dụng IGG trong nghiên cứu đặc tính Lectin và phân loại tụ cầu khuẩn

TAP CHÍ KHOA H Ọ C ĐHQGHN, KHTN & CN. T.xx, số 2PT-, 2004

Ú N G D Ụ N G IG G T R O N G N G H IÊ N c ứ u Đ Ặ C T ÍN H L E C T IN VÀ
PH Â N L O Ạ I T Ụ C Ẩ U K H U Ẩ N
B ùi Phương T huận
K hoa S in h học, Trường Đại học Khoa học T ự nhiên, Đ HQ GHN
Mở đầu
Một trong n h ữ ng ứng dụng thực tế của láp globulin m iễn dịch IgG là để tách và
nghiên cứu đặc tín h của các hợp chất sinh học như các glycoprotein, đặc biệt là lectin. Nhờ
vào k hả năng gây ngưng k ết và k ết tủ a chọn lọc, lectin đang được sử dụng nhiều trong
nghiên cứu tế bào và miễn dịch, để xác dịnh nhóm m áu ... [2,4,5]. N hững k ết quả nghiên
cứu trước đây của chúng tôi cho thấy IgG có tương tác với lectin từ sam biên và một sô lectin
thực vật. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xem xét ảnh hưởng của IgG lên phản ứng gây ngưng
kết tế bào vi khuẩn của lectin, nhằm mở rộng khả năn g ứng dụng IgG và lectin trên thực tế.
Chi tụ cầu kh u ẩn (Staphylococcus) bao gồm nhiều tác n h ân gây bệnh cho ngưòi và
động vật. Thưòng chúng được chia làm hai loại dựa trên k h ả năn g làm đông huyết tương
(phán ứng coagulase): loại dương tính, chủ yếu là Staph, aureus (tụ cầu vàng) gây bệnh
nhiều nhất, còn loại ám tính là các loài tụ cầu trắn g (trong đó có Staph, negative coagulase
(SNC) và Staph. epiderm idỉs) ít gây tác hại hơn. Tuy nhiên, cách phân chia này không
chính xác và có khi gáy nhẩm lẫn. Do vậy, việc tìm ra một phương thức nhận biết nhanh, nhạy
những khác biệt cơ bản của hai loài tụ cầu này để phân loại chúng có ý nghĩa lớn trong thực tế.
N g u y ê n liệ u v à p h ư ơ n g p h á p
N guyên liêu:
-Dịch chiết lectin thô được chuẩn bị từ các m ẫu thực v ật (hoa, quả, hạt) bằng dung
dịch đệm PBS [2].
Staphylococcus
được nuôi cấy, xử lý, tạo huyền dịch và điều chỉnh đến độ đục thích hợp ỏ bước sóng 540 nm
trên máy đo quang phổ.
- Chê phẩm LgG và huyết tương (tách từ m áu người bình thưòng do T rung tâm huyết
học và truyền m áu T rung ương cung cấp).
P hư ơng p h á p n g h iên cứ u

■ Xác định k h ả năn g gây ngưng kết t ế bào vi kh u ẩn của lectin [1]:
- Sử dụng kỹ th u ậ t ELISA [3] để nghiên cứu tương tác giữa IgG với lectin và vi khuẩn.

-Cácchủngvi khuẩn

(doViệnVệsinhdịchtễTrungươngcungcấp)

K ế t q u ả , t h ả o lu ậ n
1T ác d ụ n g củ a IgG lên p h ả n ứng g â y n gư ng k ế t t ế bào vi k h u ẩ n c ủ a lectin
a- Hoạt tính gãy ngưng kết t ế bào vi khuẩn của lectin
Một sô lectin biểu hiện khả năn g gây ngưng k ết không chỉ trê n t ế bào hồng cầu, mà
cả trê n t ế bào vi k h u ẩn . Đặc tính này có những ứng dụng rấ t qu an trọng trong nghiên cứu
miễn dịch và trong định loại vi sinh v ật [1,6]. Chúng tôi đã sử dụng các vi k h u ẩn có ý nghía
về m ặt dịch tễ đang được qu an tâm là sáu chủng tụ cầu vàng Staph, aureus (S. au) 4, 15,
16, 17, 25923 và 29213,; bốn chủng tụ cầu trắ n g là SNC 20 và 19, Staph, epiderm is (s . ep)
21, Staph, xylusus (S. xy) để nghiên cứu tương tác lectin - vi k h u ẩ n (kết quả ở hàn g trê n của
bảng 1) và tác dụng của IgG lên tương tác này (kết quả trong ngoặc đơn ở hàng dưới của bảng 1).
173


Bùi Phuơng Thuận

174

Các số liệu thu được cho thấy có sự khác biệt giữa các m ẫu trong biếu hiện hoạt tính
lectin. Các m ẫu từ đậu ván, đậu dải, đậu trạch lai, lá và h ạ t hoè, hoa kim cúc, củ lay ơn đểu
ít tác dụng lẽn vi khuẩn (với số chủng bị ngưng k ết tôi đa chỉ là 10%) tuy có khả năn g gây
ngưng kết hồng cầu m ạnh. Ngược lại, m ẫu từ h ạ t móng bò đỏ, h ạ t gội tía và củ m ã thầy (có
hoạt tính gây ngưng k ết hồng cầu rấ t thấp) lại tác dụng lẽn h ầu h ết (từ 80- 100%) sô chủng
tụ cầu thử nghiệm.

Một sô lectin có tác dụng liên k ết chọn lọc với tụ cầu vàng, điển hình )à lectin từ h ạt
dậu ván (với chủng s . au 17), h ạ t đậu ngự (với mức độ ngưng k ế t khác b iệt rõ rệ t và giảm
dần giữa 5 chủng đầu: từ (3+) với s . au 4 đến (+) với s . au 25923), h ạ t n h ã n ... Ngược lại,
một số lectin khác l ạ i gây ngưng k ết r ấ t đặc hiệu các chủng tụ cầu tráng, ví d ụ nh ư lectin từ
hoa, lá và đặc biệt rõ là chê phẩm lectin vô hoè với mức độ ngưng k ết giảm dần từ (4+) với
s.ep 21 xuống (2+) với S N C 19 và (+) với s.xy , hay nh ư lectin h ạ t hoè có tác dụng phân loại
đặc hiệu hẹp khi gây ngưng k ế t tối đa (4+) và duy n h ấ t chủng s.x y . Do vậy, có th ể sử dụng
nhũng lectin này dể phân biệt giữa h ai loài tụ cầu, th ậm chí giữa các chủng trong từng loài.
B ả n g 1. Tác dụng của IgG lên hoạt độ gây ngưng k ết t ế bào tụ cầu của lectin
Tu cầu vàng
Tu cầu trắng
Lectin
(OD)90nmtrong
s.au S.au15 s.au s.au 17 s.au
s. au SNC19 SNC 20 s.ep
s.xy
ELISAvới IgG)
4
16
29213 25923
21
+
+
+
Hat dánh dành
1
(0,039)
(-)
(-)
(•)

(*)
(+)
(-)
(*)
(->
(’)
(+)
Hat đâu vàn
2
2+
(0.044)
<-)
(')
(•)
(•)
(■)
(•)
(-)
(-)
(-)
(•)
3
Hat dàu dái
(2+)
(0)
(-)
{-)
(•)
(•)
(-)

(-)
(*)
(•)
H
4
+
+
Hat dâu ngư
3+
2+
2+
(0,050)
(+>
(-)
(->
(-)
(•)
(-)
(-)
(+)
(-)
(-)
+
5 Hat đàu trach lai
(Ó,131)
(■)
(•)
(->
(-)
(•)

(•)
(-)
(■>
(-)
(+)
♦
+
+
6
vỏhoè
(0,030)
H
(+)
(•)
(■)
(•)
(+)
<•)
(■)
(•)
(-)
4+
2+
+
7 Vò hoè (chế phầm)
(0,078)
(♦)
(•)
(-)
{")

(•)
(•)
(+)
(■)
{-)
(+)
+
8
Hoa hoè
2+
(0,068)
(-)
(•)
(-)
(-)
(•)
(*)
(•)
(-)
(■)
(-)
Hat hoè
4+
9
(0,032)
(3+)
(-)
(•)
(")
(->

(-)
(*)
(-)
(•)
(-)
+
10
Cù lay ơn
(0)
(■)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(■)
(■)
(*)
(-)
4+
4+
4+
4+
4+
4+
2*
3+
11
Hat gòi (ia
(0,269)

(2+)
<♦)
(*)
(■)
(-)
(-)
(•)
(-)
(-)
(♦)
+
3+
4+
12
Củ mả [háy
2+
2+
4+
3+
2+
2+
3+
(0,095)
(2+)
(2+)
(2+)
(+)
(2+)
(-)
(+)

(3+)
{♦)
{*)
+
+
*
2+
13 Hạl móng bổ dỏ
2+
3+
2+
2+
(4+)
(2+)
(2+)
(3+)
(2+)
(*)
H
(+)
(•)
(•)
14
+
Hạt nhản
2+
(2+)
H
('-)
(-)

(-)
(+)
(•)
(-)
(■)
W
+
+
+
+
2+
15
Hal vải
(o!ũ49)
(2+)
(2+)
(")
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
+
+
+
3+
+
16 Huyết thanh sam

2*
2+
(0,962)
(2+)
(+)
{-)
(3+)
(-)
<♦)
(■)
<■)
(+)
W
Ghi chú'. +. 2+. 3+, 4+ chì mửc độ ngưng kết; - : không ngưng kết; ( ): khi có tác dụng của IgG

TT

s.au: Staphylococcus aureus
SNC: Staphylococcus negative congulase

s.ep: Staphylococcus epìdermidis
s.xy: Staphylococcus xylusus


I Sig dung lg(i Irong nphign cứu dặc lính lectin vã.

175

Sự khác nhau trong h o ạt tính gáy ngưng kết tẽ bào vi khuẩn của các loại lectin cho
thấy có sự không đổng n h ất vể th ụ th ể (các đường - trung tám tương tác với lectin), hoặc về

th àn h phần và kiểu liên k ết củ a thụ thể với các gốc oligosaccharide và polypeptide có trên
bê m ặt các chủng Staphylococcus. Chính vì có khả năng nhận biết sự sai khác này mà lectin
đã trớ th àn h một công cụ đắc lực trong nhận dạng và định loại vi sinh vật, thay th ế cho các
phương pháp phân loại phức tạ p và tốn kém thưòng dùng [1,6].
b-Tác dụng của IgG
Báng 1 củng cho thấy IgG có những tác dụng khác nh au lên phản ứng ngưng k ết giữa
lectin với tế bào lụ cầu. Trong 21% trường hợp, hoạt độ gáy ngưng k ết của lectin lên tê bào
tụ cầu bị giám, cho thấy có tá c dụng ức chẽ của IgG (so vái 75% sô m ẫu bị ức chê hoạt độ
gây ngưng kết hồng cầu). Hiện tượng này có thể do trung tâm liên k ết saccharide của lectin
bị IgG phong toả nên khõng tiệp'xúc được với trung tâm tương tác với lectin trên bể m ặt tế
bào. dần đến m ất khả năng gâỹ-ĩigưng kết t ế bào.
Điểu khá lý th ú là IgG còn làm táng phản ứng ngưng k ế t của lectin vối một sô chủng
tụ cầu vàng, như trưòng.hợp của lectin từ h ạ t móng bò đỏ với các chủng s .a u 4, 29213 và
17, hu y ết thanh sam với s .a u 29213 và 17, mẫu h ạ t vải vối s .a u 4... Đặc biệt, lectin từ một
số m ầu chi biếu hiện khả năng gãv ngưng k ết tê bào tụ cầu vàng khi có IgG: m ẫu h ạ t dành
dành với s .a u 17, mẫu đậu dải vói s .a u 16, mẫu củ lay ơn với s .a u 15 và 29213 ...H iện
tượng này không thấy có ờ các chủng tụ cầu trắng, và cũng khác với thử nghiệm trẽn hoạt
tính gây ngưng kết hồng cầu với các chất ức chế thông thường (như các loại đường đơn). Do
vậy, có thê sử dụng IgG phôi hợp với một số lectin để nh ận dạng các chủng tụ cầu vàng.
Đồng thời điều này còn gợi ra rằ n g phải chảng IgG tự nó cũng có khả năng gây ngưng kết tẽ
bào tụ cầu vàng? Đê khảng định giá th iết này, chúng tôi tiến hàn h khảo s á t khả nảng lương
tác của IgG và tế bào vi k h u ẩn bằng ELISA là một kỹ th u ậ t rấ t nhạy và ít chịu ảnh hưdng
của yếu tô chủ quan.
2- N ghiên cứu tươ ng tá c của IgG với lec tin và vi k h u ẩ n b a n g kỹ th u ậ t EL ISA
a ■Tương tác IgG-lectin
Sô' đo độ hấp thu quang (OD490nm) trên bảng 1 (ỏ phía dưới tên các lectin) biểu th ị mức
độ b ắt giữ kháng th ể IgG của các m ẫu lectin khi được sử dụng làm kháng nguyên gắn bàn.
Tác dụng m ạnh n h ất là của m ẫu huyết thanh sam (OD = 0,921), tiếp theo là m ẫu h ạ t gội tía
(OD = 0,269), đậu trạch lai (OD = 0,131)... trong khi các m ẫu h ạ t đậu dải và củ lay ơn
không nhận biết được IgG. Có th ể thấy sự tương đồng của các k ết quả này với tác dụng ức

chế của IgG lên tương tác lectin - tụ cầu. M ẫu h ạt gội tía có mức b ắ t giũ IgG cao n h ấ t (vối
OD = 0,269), đồng thòi có k h ả n ăn g ngưng kết nhiều chủng tụ cầu n h ấ t (8/10), thì 7 trong sô'
8 phản ứng tương tác lectin -tụ cầu này đã chịu tác dụng kìm hãm m ạnh n h ấ t của IgG
(phản ứng ngưng kết giảm từ 4+ xuô'ng (+) và thậm chí là (-)). Tương tự như vặy là các kết
quả của mẫu mă thầy với s . au 17 và 25923, huyết th an h sam với S C N 20 và s.ep ...
6- Tương tác IgG -vi k h u ẩ n


Bùi Phưcmg Thuạn

176

Tiếp theo, để nghiên cứu tác dụng trực tiếp của IgG lên t ế bào tụ cầu, chúng tôi đ ã cài
tiến kỹ th u ậ t ELISA băng cách sử dụng chính các vi khuẩn này làm kh án g nguyên gắn bản.
B ả n g 2. Tương tác IgG - tụ cầu trong xét nghiệm ELISA (OD.ig0nm )
IgG

s.au
4

Chẻ phẩm

0,804

T ucầ
s .a u 15 S .a u l6
1,096

0,758

vàng
s.au
17

s .a u
25923

s .a u
29213

SNC
19

Tu cầu trắ n g
SNC s.ep
s.xy
20
21

0,592

0,650

1,028

0,072 0,087 0,122

0,055

Huyết tương 0,848 0,836

0,446
0,800
1,086
0,632 0,028 0,060 0,027 0/138
Ghi chú: s.au: Staphylococcus aureus
s.ep: Staphylococcus epidermidis
SNC: Staphylococcus negative congulase
s.xy: Staphylococcus xylusus
SỐ liệu trê n bảng 2 cho thấy có sự khốc biệt rõ rà n g giữa hai loài tụ cầu thử nghiệm.
Các chủng tụ cầu vàng b ắt giữ rấ t tốt IgG: kết quả cao n h ấ t là của Staph, aureus lõ (OD =
1,069), còn thấp n h ấ t là của Staph, aureus 17 (OD = 0,592). Trong khi đó, vói tụ cầu trắng
chí có Staph. E piderm idis kết hợp được với IgG nhưng ỏ m ức độ th ấp hơn nhiều (OD =
0,112), các chủng còn lại tác dụng r ấ t yếu. Các k ết quả so s án h th u dược khi SÜ dụng huyết
tương người (với toàn bộ các lóp Ig và protein tạp khác) làm kháng th ể cũng khá tương
đồng, thậm chí còn cho thấy sự khác biệt rõ rệ t hơn giữa h ai loài tụ cầu, và đơn giản hơn
nhiều vì không cần phải tinh ch ế IgG. Nguyên nhân của sự sai khác giữa hai loài tụ cầu có
th ể là do protein A (một kháng nguyên bề m ặt đặc trứng của th à n h tế bào tụ cẩu vàng có
khả năng k ết hợp với vùng Fc của IgG) có trê n bể m ặt Staph, aureus đã n h ặn biết và liên
kết với IgG. Vặy giả th iế t về sự tương tác giữa trực tiếp giũa IgG với các chủng tụ cầu vàng
nghiên cứu đã được khăng định là đúng. Đồng thời cũng có th ể rú t ra k ết luận là do tụ cầu
trắng không tác dụng với IgG, nên trê n bề m ặt của chúng không có protein A. K ết luận này
là phù hợp vái k ết quả nghiên cứu điều tra protein A ỏ các chủng tụ cẩu trắ n g mà chúng tôi
đã tiến hành.
Kếl quả th ử nghiệm còn cho th ấy có th ể dựa vào mức độ tương tá c của các tê bào tụ
cầu trực tiếp gắn bản trong kỹ th u ậ t ELISA cải tiến vổi IgG đê phân b iệt hai loài tụ cầu
vàng và trắng, cũng như để phản biệt giữa các chủng khác n h au của tụ cầu vàng. Bên cạnh
dó, việc nghiên cứu ảnh hưâng của IgG đến hoạt tính gây ngưng k ết t ế bào vi khuẩn của
lectin bằng kỹ th u ậ t k ết tủ a miễn dịch và kỹ th u ậ t ELISA đ ã cho những k ết quả tương
dồng. Điểu này cho thấy kỹ th u ậ t miễn dịch tuy đơn giản nhưng hoàn toàn đáng tin cậy, rấ t
phù hợp cho các nghiên cửu đặc tính của lectin (như tương tác lectin- IgG- vi khuẩn), n h ất

là trong điều kiện tra n g th iết bị còn h ạn chê nh ư ỏ Việt nam .
K ết lu ậ n
IgG có khả năng kìm hãm hoạt độ của 72% số m ẫu lectin trong ph ản ùng gây ngưng
kết hồng cầu và 21% sô m ẫu trong ph ản ứng gây ngưng kết tụ cầu.
Có th ể sử dụng kỹ th u ậ t ELISA cải tiến bằng gắn bản trực tiếp vi khuẩn, các lectin
đặc hiệu và kháng th ể IgG (riêng rẽ hoặc kết hợp vối nhau) để phán biệt các chủng tụ cầu
vàng và tran g thử nghiệm .


111

ủhg dung IgO tmnÿ ng CIIcứu tlàc lính leclin vã...______________________________________________ 177

So với kỹ th u ậ t ELISA, kỹ th u ậ t kết tủ a miễn dịch đ ạt độ chính xác tương đương,
nhưng đơn gián và đõ tốn kém hơn, th u ận tiện cho nghiên cứu đặc tính của lectin (như
tương tác lectin -(IgG)- vi khuẩn).
T À I L IỆ U THA M K HẢ O
1. Doyle R.J., Introduction to lectin and their interaction with microorganisms. Lectin microorganism interactions (eds. Doyle R.J and Slifkin M. M. ), Marcel Dekker Publisher,
Inc, New York, 1994.
2. Goldstein I.J., & Poretz R. D., Isolation and chemical properties of lectins. The lectins:
properties, functions, and applications in biology and medecine (eds. Liener 1. E., Sharon N.
and Goldstein I.J.). Academic Press, Orlando, 1986.
3. Engvall E., Perlm ann p., Enzyme linked immunoabsorbent assay (ELISA), Quantitative
assay of immunoglobulin G"- Immunochemistry, New York, 8. 1971, pp. 871- 873.
4. Kilpatrick D. c , Handbook o f animal lectins: properties and biomedical applications, John
Wiley & sons Publisher, LTD, New York, 2000.
5. Peum ans w. J . and Van Damme E. J. M., Lectins as plant defense proteins, Plant
Physiology, New York, 109, 1995, pp. 347- 352.
6. Slifkin M., Application of lectin in clinical bacteriology, Lectin ■microorganism interactions,
(eds. Doyle R.J and Shfkin M. M.) Marcel Dekker Publisher, Inc, New York, 1994.

VNU JOURNAL OF SCIENCE. N at. Sci. & Tech.. T XX. Np2AP, 2004

S T U D Y O N T H E IG G E F F E C T S O N L E C T IN A C T IV IT Y A N D T H E
S T A P H Y L O C O C C U S I D E N T IF IC A T IO N
B ui P h u o n g T h u an
D epartm ent o f Biology, College o f Science, VN U
The

study

revealed

th a t

21%

vegetal

lectin

sam ples

with

Staphylococcus

agglutinating activity are inhibited by IgG, compare w ith 72% for th e hum an red blood cells
agglutinating activity. Beside th e modified ELISA assay (using directly bacteria to coat the
plate wells), th e lectins w ith proper specificities and IgG can be used (separately or
combined w ith each other) for th e recognition of Staphylococcus aureus Strains, based on

their ability to ag g lu tin ate selectively cells.
In com parison with ELISA assay, immunoprecipitaion m ethods provide similarly
exact results, b a t are sim pler and less expensive, th a t is suitable for th e lectin
characterization studies (as th e interactions between lectins- (IgG)- bacteria).