Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) ở Việt Nam (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

LÊ CẢNH VIỆT CƯỜNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH
HỌC MỘT SỐ LOÀI THUÔC CHI CHÒI MÒI (ANTIDESMA) Ở
VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ
Mã số

: 62.44.01.14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2017


Công trình được hoàn thành tại: Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS. TS. Phan Văn Kiệm
Người hướng dẫn khoa học 2: PGS. TS. Lê Mai Hương

Phản biện 1:

Phản biện 2:
Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Học
viện, họp tại Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam vào hồi

giờ

, ngày

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học Viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Hà Nội

tháng

năm 2017.


1
MỞ ĐẦU
1.

Tính cấp thiết của luận án
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có khoảng 80% dân số sử dụng

y học cổ truyền, đặc biệt là dược liệu trong chăm sóc sức khỏe ban đầu.
Trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc kinh nghiệm sử dụng
thuốc trong dân gian là một trong những yếu tố quan trọng làm tăng tỷ lệ

thành công trong tìm kiếm các hợp chất dẫn đường (lead compounds) để
tổng hợp thuốc thông qua việc giảm thời gian, tiết kiệm chi phí và ít độc
hại với cơ thể sống. Do đó, cây dược liệu vẫn là đối tượng thu hút mạnh
mẽ sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới trong nghiên cứu tìm
kiếm các hoạt chất mới.
Theo Từ điển cây thuốc Việt Nam, chi Chòi mòi (Antidesma) ở Việt
Nam có đến 11 loài được sử dụng làm thuốc và dược liệu chữa các bệnh
như: ban nóng, lưỡi đóng rêu, đàn bà kinh nguyệt không đều, ngực bụng
đau, đàn ông cước khí thấp tê, giang mai, dạ dày, sởi, thủy đậu, ... Các
nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cho thấy chi
Antidesma chứa nhiều lớp chất đáng quan tâm như alkaloid, terpenoid,
steroid, megastigmane, flavonoid, lignanoid và một số dạng phenolic
khác. Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy dịch chiết và
các hợp chất phân lập từ các loài thuộc chi này có các hoạt tính đáng
quan tâm như: gây độc tế bào ung thư, chống oxi hóa, trị tiểu đường,
kháng vi sinh vật, ....
Do đó, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học
và hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Chòi mòi (Antidesma) ở
Việt Nam”.
2.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu của ba loài A. acidum, A.

hainanensis và A. ghaesembilla ở Việt Nam.


2
Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được để tìm
kiếm các hoạt chất tiềm năng

3.

Các nội dung nghiên cứu chính của luận án:
1.

Phân lập các hợp chất từ lá ba loài A. acidum, A. hainanensis và

A. ghaesembilla ở Việt Nam bằng các phương pháp sắc ký;
2.

Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng

các phương pháp vật lý, hóa học;
3.

Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được;

4.

Đánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập được.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Phần trình bày tổng quan các nghiên cứu trong nước và quốc tế về
thành phần hóa học và hoạt tính sinh học chi Antidesma.
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Lá loài A. acidum thu tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, Việt Nam vào tháng
3/2013.
Lá loài A. ghaesembilla thu tại Buôn Đôn, Đắk Lắk, Việt Nam vào
tháng 3/2013.

Lá loài A. hainanenis thu tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, Việt Nam vào
tháng 12/2014.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
Phối hợp các phương pháp sắc ký bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC),
sắc ký lớp mỏng điều chế và sắc ký cột (CC).
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là
kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao


3
gồm: phổ khối (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), độ quay
cực ([]D), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ lưỡng sắc tròn (CD).
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
Hoa ̣t tiń h gây đô ̣c tế bào của các hoa ̣t chấ t đươ ̣c xác định theo
phương pháp MTT.
Hoạt tính kháng viêm thông qua sự ức chế sản sinh NO trên dòng tế
bào BV2 được kích thích bởi LPS.
2.3. Phân lập các hợp chất
2.3.1. Phân lập các hợp chất từ loài A. hainanensis
Phần này trình bày quá trình phân lập các hợp chất từ loài A.
hainanensis.

Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài A. hainanensis.
2.3.2. Phân lập các hợp chất từ loài A. acidum
Phần này trình bày quá trình phân lập các hợp chất từ loài A. acidum.


4

Hình 2.5. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài A. acidum
2.3.3. Phân lập các hợp chất từ loài A. ghaesembilla
Phần này trình bày quá trình phân lập các hợp chất từ loài A.
ghaesembilla.

Hình 2.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài A. ghaesembilla


5
2.4. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất
2.4.1. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài
A. hainanensis
Phần này trình bày thông số vật lý và dữ kiện phổ của 18 hợp chất
phân lập được từ loài A. hainanensis.

2.4.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ
loài A. acidum
Phần này trình bày thông số vật lý và dữ kiện phổ của 12 hợp chất
phân lập được từ loài A. acidum.
2.4.3. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài
A. ghaesembilla
Phần này trình bày thông số vật lý và dữ kiện phổ của 14 hợp chất
phân lập được từ loài A. ghaesembilla.
2.5. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập được
2.5.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất
phân lập từ loài A. acidum
- 12 hợp chất (AC1-AC12) được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
ung thư HL-60 theo phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào MTT.
Bảng 2.1. % ức chế dòng tế bào HL-60 của các hợp chất AC1-AC12

tại nồng độ 100 µM
Hợp chất

Tỷ lệ ức chế (%)

Hợp chất

Tỷ lệ ức chế (%)

AC1

95,18 ± 0,55

AC7

95,22 ± 0,20

AC2

42,10 ± 2,68

AC8

95,29 ± 0,53

AC3

93,95 ± 0,74

AC9

47,30 ± 3,20

AC4

95,00 ± 0,46

AC10

95,55 ± 0,12

AC5

94,99 ± 0,98

AC11

48,93 ± 4,44

AC6

95,51 ± 0,11

AC12

36,17 ± 3,96


6
Bảng 2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc dòng tế bào HL-60 và dòng

tế bào HEL-299 theo nồng độ của các hợp chất AC1, AC3-AC8 và AC10
IC50 (µM)

Hợp
chất

HL-60

IC50 (µM)

Hợp

HEL-299

chất

HL-60

HEL-299

AC1

4,8 ± 0,2

>100

AC6

22,5 ± 0,9

>100

AC3

26,4 ± 0,6

>100

AC7

28,1 ± 0,2

>100

AC4

8,0 ± 0,9

>100

AC8

25,4 ± 0,8

>100

AC5

24,8 ± 0,7

>100

AC10

44,7 ± 3,3

>100

ĐC*

6,8 ± 0,9

>100

*ĐC: Mitoxantrone được sử dụng là chất đối chứng dương.

2.5.2. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập
được từ loài A. hainanensis
- Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản
sinh NO trên dòng tế bào BV-2 được kích thích bởi LPS của 18 hợp chất
(AH1-AH18).
Bảng 2.3. % Ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào BV2 được kích thích
bởi LPS của các hợp chất AH1-AH18 tại nồng độ 80 µM
Hợp chất

Tỷ lệ ức
chế (%)

Hợp chất

Tỷ lệ ức
chế (%)

Hợp chất

Tỷ lệ ức
chế (%)

AH1

90,1 ± 5,0

AH7

92,0 ± 4,1

AH13

62,2 ± 3,7

AH2

79,8 ± 4,6

AH8

96,7 ± 3,7

AH14

89,6 ± 6,7

AH3

83,2 ± 6,3

AH9

26,2 ± 4,3

AH15

95,3 ± 3,8

AH4

73,1 ± 5,3

AH10

41,8 ± 6,6

AH16

35,4 ± 3,6

AH5

86,5 ± 5,2

AH11

33,7 ± 5,8

AH17

24,0 ± 4,9

AH6

47,4 ± 7,5

AH12

38,7 ± 6,2

AH18

87,5 ± 4,1

ĐC*

85,0 ± 5,1

*ĐC: Butein (10 µM) được sử dụng là chất đối chứng dương.


7
Bảng 2.4. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh ra NO trong tế
bào BV2 được kích thích bởi LPS của các hợp chất AH1-AH5, AH7,

AH8, AH13-AH15 và AH18
Hợp chất

IC50 (µM)

Hợp chất

IC50 (µM)

AH1

10,8 ± 1,1

AH8

5,3 ± 0,4

AH2

15,1 ± 1,2

AH13

48,2 ± 6,8

AH3

21,2 ± 3,1

AH14

8,6 ± 1,1

AH4

67,9 ± 26,0

AH15

5,0 ± 0,2

AH5

19,0 ± 0,9

AH18

7,4 ± 1,8

AH7

26,3 ± 1,3

ĐC*

3,8 ± 0,6

*ĐC: Butein được sử dụng là chất đối chứng dương.

2.5.3. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập

được từ loài A. ghaesembilla
- Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản
sinh NO trên dòng tế bào BV-2 được kích thích bởi LPS của 14 hợp chất
(AG1-AG14).
Bảng 2.5. % Ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào BV2 được kích thích
bởi LPS của các hợp chất AG1-AG14 tại nồng độ 80 µM
Hợp chất

Tỷ lệ ức
chế (%)

Hợp chất

Tỷ lệ ức
chế (%)

AG1

79,0 ± 5,6

AG6

62,4 ± 5,5

AG11

56,0 ± 6,3

AG2

96,0 ± 5,0

AG7

74,3 ± 5,7

AG12

95,0 ± 5,1

AG3

83,3 ± 4,6

AG8

105,0 ± 2,6

AG13

64,7 ± 4,9

AG4

77,2 ± 5,1

AG9

66,3 ± 4,0

AG14

40,1 ± 4,3

AG5

81,2 ± 4,4

AG10

68,3 ± 4,0

ĐC*

85,0 ± 5,1

Hợp chất

*ĐC: Butein (10 µM) được sử dụng là chất đối chứng dương.

Tỷ lệ ức
chế (%)


8
Bảng 2.6. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh ra NO trong tế
bào BV2 được kích thích bởi LPS của các hợp chất AG1-AG13
Hợp chất

IC50 (µM)

Hợp chất

IC50 (µM)

AG1

37,3 ± 8,7

AG8

5,4 ± 0,6

AG2

23,8 ± 3,1

AG9

48,3 ± 7,3

AG3

36,3 ± 3,8

AG10

50,2 ± 5,4

AG4

9,5 ± 1,3

AG11

72,7 ± 20,9

AG5

32,4 ± 9,9

AG12

21,4 ± 4,4

AG6

62,4 ± 11,2

AG13

44,3 ± 8,9

AG7

56,6 ± 5,7

ĐC*

3,8 ± 0,6

*ĐC: Butein được sử dụng là chất đối chứng dương.

CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ
3.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài A.
hainanensis
Phần này trình bày kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 18
hợp chất được phân lập từ loài A. hainanensis.

AH1: (7S,7'R,8S,8'R) -3,3'-Dimethoxy7,7'-epoxylignan-4,4',9-triol 4-O-β-Dglucopyranoside (hợp chất mới)

AH2: 9-O-formylaviculin (hợp chất mới)


9

AH3: (+)-Isolariciresinol 9-O-β-Dglucopyranoside

AH4: (–)-Lyoniresinol

AH5: (+)-Lyoniresinol-9-O-β-Dglucopyranoside

AH6: 1-O-(2,4-dihydroxy-6methoxyphenyl)-6-O-(4-hydroxy-3,5dimethoxybenzoyl)-β-D-glucopyranoside

AH7: 4-O-[6-O-(4-hydroxy-3,5dimethoxybenzoyl)-β-D-glucopyranosyl]3-hydroxyphenethyl alcohol

AH8: 4-Hydroxymethyl-2-methoxyphenyl6-O-syringoyl-β-D-glucopyranoside

AH9: Phenethyl α-L-arabinofuranosyl(1→6)-O-β-D-glucopyranoside

AH10: Syringoyl-O-β-D-glucopyranoside

AH11: β-D-Glucopyranosyl phaseate

AH12: Ampelopsisionoside


10

AH13: Alangioside A

AH14: Alangionoside L

AH15: Megastigm-7-ene-3-ol-9-one 3-Oα-L-arabinofuranosyl-(1→6)-O-β-Dglucopyranoside

AH17: trans-Linalool-3,6-oxide 7-O-β-Dglucopyranoside

AH16: N–trans-feruloyloctopamide

AH18: Lotusanine B

Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của một
hợp chất mới.
3.1.1. Hợp chất

AH1

:

(7S,7'R,8S,8'R)

-3,3'-Dimethoxy-7,7'-

epoxylignan-4,4',9-triol 4-O-β-D-glucopyranoside (hợp chất mới)
Hợp chất AH1 thu được dưới dạng chất bột, màu vàng nhạt. Công
thức phân tử của AH1 được xác định là C26H34O11 bởi sự xuất hiện của
píc ion giả phân tử [M+Na]+ tại m/z 545,1995 trên phổ lượng khối phân
giải cao HR-ESI-MS (tính toán lý thuyết cho công thức [C26H34O11Na]+:
545,1993). Phổ 1H-NMR của AH1 xuất hiện tín hiệu của sáu proton thơm
thuộc hai hệ tương tác spin-spin ABX tại H 6,84 (1H, d, J = 8,5 Hz),
6,97 (1H, dd, J = 1,5, 8,5 Hz), 6,99 (1H, dd, J = 1,5, 8,5 Hz), 7,08 (1H, d,
J = 1,5 Hz), 7,10 (1H, d, J = 1,5 Hz) và 7,18 (1H, d, J = 8,5 Hz); hai


11
proton thuộc hai nhóm oxymethine tại δH 4,40 (1H, d, J = 9,0 Hz), 5,20
(1H, d, J = 8,5 Hz); một proton anome của một đơn vị đường tại δH 4,92
(1H, d, J = 7,5 Hz); hai nhóm methoxy tại δH 3,88 (3H, s), 3,91 (3H, s) và
một nhóm methyl tại δH 1,14 (3H, d, J = 6,5 Hz).

Hình 3.1. Phổ HR-ESI-MS của AH1

Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của AH1

Phổ 13C-NMR và DEPT của AH1 xuất hiện tín hiệu 26 carbon, bao
gồm: sáu carbon không liên kết trực tiếp với hydro, 15 nhóm methine, hai
nhóm methylene và ba nhóm methyl. Sự có mặt của proton anome tại δH
4,92 (1H, d, J = 7,5 Hz) và sáu carbon đặc trưng của đơn vị đường
glucopyranose tại C 62,5 (CH2), 71,4 9 (CH), 74,9 (CH), 77,8 (CH), 78,2
(CH), 102,8 (CH) cho phép dự đoán sự có mặt của một phần đường βglucopranose. Bên cạnh đó các số liệu phổ 1D-NMR, cùng với sự có mặt

của hai nhóm oxymethine tại C-7 (δC 82,6), C-7 (δC 89,3) và số liên kết
đôi tương đương của AH1 tính được là 10, có thể dự đoán hợp chất AH1
là tetrahydrofuran lignan glycoside [Phytochemistry, 55, 843 (2000)].

Hình 3.3. Phổ 13C-NMR của AH1

Hình 3.4. Phổ DEPT của AH1


12
Phân tích các tương tác trên phổ HSQC cho phép gán tín hiệu của
proton liên kết trực tiếp với carbon. Trên phổ 1H-1H COSY, nhận thấy có
tương tác giữa H-7 (δH 5,20) với H-8 (δH 2,40); H-8 (δH 2,40) với H-9 (δH
3,29, 3,21)/H-8 (δH 2,08); tương tác giữa H-7 (δH 4,40) với H-8 (δH 2,08)
và H-8 (δH 2,08) với H-9 (δH 1,14)/H-8 (δH 2,40) cho phép gắn kết mảnh
cấu trúc C-7/C-8/C-9; C-7/C-8/C-9; và sự liên kết giữa hai mảnh cấu trúc
này tại C-8/C-8′, góp phần khẳng định AH1 là tetrahydrofuran lignan.
Trên phổ HMBC nhận thấy có tương tác giữa H-7 (δH 5,20) với C-1
(δC 135,8)/ C-2 (δC 112,7)/ C-6 (δC 120,7), cho phép xác định giá trị độ
dịch chuyển hóa học của C-1, C-2 và C-6. Tương tác HMBC giữa H-2
(δH 7,08) và H-6 (δH 6,99) với C-4 (δC 147,2)/ C-7 (δC 82,6) và giữa H-5
(δH 7,18) với C-1 (δC 135,8)/ C-3 (δC 150,4) cho phép xác định giá trị độ
chuyển dịch hóa học của các carbon còn lại (C-3, C-4, C-5) thuộc vòng
thơm thứ nhất, gắn với C-7. Tương tự, vị trí và giá trị độ chuyển dịch hóa
học của các carbon/proton thuộc vòng thơm còn lại tại C-7 được xác
định dựa vào các tương tác HMBC giữa H-7 (δH 4,40) với C-1 (δC
133,0)/ C-2 (δC 111,7)/ C-6 (δC 120,7), giữa H-2 (δH 7,10)/ H-6 (δH
6,97) với C-4 (δC 147,6)/ C-7 (δC 89,3) và giữa H-5 (δH 6,84) với C-1
(δC 133,0)/ C-3 (δC 149,1).
Vị trí của các nhóm methoxy và glucopyranose lần lượt tại C-3 và C4 được xác định dựa vào tương tác HMBC giữa proton của nhóm 3-OCH3

(δH 3,88) với C-3 (δC 150,4) và giữa proton anome H-1 (δH 4,92) với C4 (δC 147,2). Vị trí của nhóm methoxy và nhóm hydroxy lần lượt tại C-3,
C-4 được xác định dựa vào tương tác HMBC giữa proton của nhóm 3OCH3 (δH 3,91) với C-3 (δC 149,1) và độ dịch chuyển hóa học của C-4
(δC 147,6). Vị trí của nhóm hydroxy tự do gắn vào C-9 được xác định dựa
vào giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-9 (δC 63,6) và tương tác HMBC
giữa H-9 (δH 3,21, 3,29) với C-7 (δC 82,6)/ C-8 (δC 54,4)/ C-8 (δC 46,2).
Ngoài ra, kết quả thủy phân AH1 trong môi trường acid thu được đường
D-glucose (so sánh với đường chuẩn bằng GC) [Chem. Pharm. Bull., 57,
986 (2009)] khẳng định phần đường là D-glucose.


13

Hình 3.8. Các tương tác 1H-1H COSY, HMBC và NOESY chính của AH1

max (mdeg): 238 (+ 0,28) và 223 (-0,36)

λmax (Δε): 236 (+1,60) và 219 (−0,23)

AH1

Schisphenlignan G (AH1a)

Hình 3.9. Cấu trúc và giá trị phổ CD của AH1 và hợp chất tham khảo
Cấu hình tuyệt đối của AH1 được xác định dựa trên phân tích các
phổ NOESY và CD. Trên phổ NOESY xuất hiện tương tác H-7 (δH 5,20)/
H-8 (δH 2,40)/ H-9 (δH 1,14)/ H-7 (δH 4,40) gợi ý các proton này nằm
gần nhau và giả định chúng đều định hướng β. Hơn nữa, trên phổ CD của
AH1 có hiệu ứng Cotton dương tại bước sóng 238 (+ 0,28 mdeg) và
Cotton âm tại bước sóng 223 (-0,36 mdeg), khá phù hợp với các hiệu ứng
Cotton của hợp chất schisphenlignan G (AH1a) tại λmax (Δε): 236 (+1,60)

và 219 (−0,23) [Fitoterapia, 86, 171 (2013)] cho phép xác định cấu hình
tuyệt đối của AH1 giống với AH1a là 7S,7R,8S,8R. Ngoài ra, cấu hình
tuyệt đối tại vị trí C-7/C-7 của hợp chất AH1 còn được xác định dựa vào
quy tắc phản xạ bất đối dương (positive exciton chirality) của các hợp
chất có cấu trúc hóa học tương tự hợp chất AH1 đã được công bố [J. Nat.
Prod. 74, 1444 (2011)]. Từ những phân tích trên, hợp chất AH1 được
xác định là (7S,7R,8S,8R)-3,3- dimethoxy-7,7-epoxylignan-4,4,9-triol


14
4-O-β-D-glucopyranoside. Tra cứu trên cơ sở dữ liệu Scifinder cho phép
kết luận đây là hợp chất mới.
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất AH1
C
1
2
3
4
5
6
7
8
9

δ Ca
135,8
112,7
150,4
147,2
117,4

120,7
82,6
54,4
63,6

DEPT
C
CH
C
C
CH
CH
CH
CH
CH2

1
2
3
4
5
6
7
8
9

133,0
111,7
149,1
147,6

116,2
120,7
89,3
46,2
16,6

C
CH
C
C
CH
CH
CH
CH
CH3

δHa (độ bội, J, Hz)
7,08 (d, 1,5)
7,18 (d, 8,5)
6,99 (dd, 1,5, 8,5)
5,20 (d, 8,5)
2,40 (m)
3,29 (dd, 7,5, 10,5)
3,21 (dd, 6,5, 10,5)
7,10 (d, 1,5)
6,84 (d, 8,5)
6,97 (dd, 1,5, 8,5)
4,40 (d, 9,0)
2,08 (m)
1,14 (d, 6,5)

56,7
56,5

CH3
CH3

3,88 (s)
3,91 (s)

102,8
74,9
77,8
71,4
78,2
62,5

CH
CH
CH
CH
CH
CH2

4,92 (d, 7,5)
3,53 (dd, 7,5, 9,0)
3,49 (dd, 9,0, 9,0)
3,42*
3,42*
3,71 (dd, 5,0, 12,0)

3,90*

3-OCH3
3-OCH3
4-OGlc
1
2
3
4
5
6
a)

đo trong CD3OD; *) tín hiệu bị che khuất.


15
3.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ loài A. acidum
Phần này trình bày kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 12
hợp chất được phân lập từ loài A. acidum.

AC1: Clauszoline B

AC2: Clauszoline H

AC4: 7-Methoxymukonal

AC7: Xanthoxyletin

AC5: Heptaphyline

AC8: Alloxanthoxyletin

AC10: p-Methoxycinnamaldehyde

AC3: Mukonal

AC6: 5-Demethyltoddaculin

AC9: (E)-p-Propenylphenol
O-β-D-glucopyranoside

AC11: trans-4Methoxycinnamyl alcohol

AC12: Vanilin

Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của một
hợp chất có hoạt tính mạnh.
3.2.1. Hợp chất AC1 : Clauszoline B
Hợp chất AC1 thu được dưới dạng chất bột, màu vàng. Trên phổ 1HNMR của AC1 cho thấy sự xuất hiện các tín hiệu của sáu proton thuộc
hai nhóm methyl tại H 1,51 (6H, s); bốn proton thơm tại H 6,85 (1H, s),
6,92 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,45 (1H, d, J = 7,5 Hz), 8,09 (1H, s); hai proton


16
olefin tại H 5,63 (1H, d, J = 10,0 Hz), 6,48 (1H, d, 10,0 Hz) cho phép dự
đoán có mặt một liên kết CH=CH cấu hình Z, một proton tại H 8,37 (1H,
s) gọi ý sự có mặt của một nhóm NH và một proton tại H 9,91 (1H, s) gợi
ý sự có mặt của nhóm aldehyde.
Trên phổ 13C-NMR, DEPT của AC1 cho thấy tín hiệu của 17 carbon.

Trong đó, có hai nhóm methyl tại C 28,2; sáu nhóm methine tại C 97,1,
111,7, 119,6, 122,7, 127,4, 129,4; tám carbon không liên kết trực tiếp với
hydro tại C 115,6, 118,1, 118,4, 124,9, 129,3, 138,2, 145,8, 161,3; một
nhóm aldehyde tại C 195,2.
Trên phổ HMBC cho thấy có các tương tác giữa H-5 (H 7,45) với C4a (C 118,4)/ C-7 (C 118,1)/ C-8a (C 129,3); giữa H-6 (H 6,92) với C5a (C 124,9)/ C-8 (C 138,2) xác định vị trí và giá trị độ chuyển dịch hóa
học của các carbon thuộc vòng thơm thứ nhất. Tương tự, vị trí và giá trị
độ chuyển dịch hóa học của các carbon thuộc vòng thơm còn lại được xác
định dựa vào tương tác HMBC giữa H-1 (H 6,85) với C-3 (C 115,6)/ C4a (C 118,4) và giữa H-4 (H 8,09) với C-1a (C 145,8)/ C-2 (C 161,3).
Tương tác HMBC giữa H-4 (H 8,09) với C-5a (C 124,9), giữa H-5 (H
7,45) và proton của nhóm NH (H 8,37) với C-4a (C 118,4) cùng với giá
trị độ dịch chuyển hóa học của C-1a (C 145,8) và C-8a (C 129,3) gợi ý
hai vòng thơm gắn kết với nhau qua cầu C-4a/C-5a và tại C-1a/C-8a qua
cầu nitơ. Cấu trúc khung của AC1 được dự đoán là một carbazole
alkaloid. Vị trí của nhóm hydroxy tại C-2 và nhóm aldehyde tại C-3 lần
lượt được xác định dựa vào giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-2 (C
161,3) và tương tác HMBC giữa proton của nhóm aldehyde (H 9,91) với
C-2 (C 161,3)/ C-3 (C 115,6)/ C-4 (C 127,4). Bên cạnh đó, các tương tác
HMBC giữa H-1 (H 6,48)/ H-2 (H 5,63) với C-3 (C 77,2) và tương tác
giữa H-4/H-5 (H 1,51) với C-2 (C 129,4)/ C-3 (C 77,2) gợi ý sự có
mặt của nhóm isoprenyl với liên kết đôi tại C-1/C-2. Tương tác HMBC
giữa H-1 (H 6,48)/ H-2 (H 5,63) với C-7 (C 118,1) và giá trị độ dịch
chuyển hóa học tại C-8 (C 138,2) gợi ý nhóm isoprenyl liên kết với
khung carbazole tại C-1/C-7 và C-3/C-8 thông qua cầu oxy.


17
Bảng 3.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất AC1 và hợp chất tham khảo
C

δC #

δ Ca

1

96,72

97,1

1a

146,58

2

DEPT

δHa (độ bội, J, Hz)

CH

6,85 (s)

145,8

C

-

160,73

161,3

C

-

3

115,47

115,6

C

-

4

127,68

127,4

CH

8,09 (s)

4a

118,04

118,4

C

-

5

111,81

111,7

CH

7,45 (d, 7,5)

5a

125,13

124,9

C

-

6

119,21

119,6

CH

6,92 (d, 7,5)

7

118,04

118,1

C

-

8

138,23

138,2

C

-

8a

129,77

129,3

C

-

1′

122,63

122,7

CH

6,48 (d, 10,0)

2′

129,35

129,4

CH

5,63 (d, 10,0)

3′

76,69

77,2*

C

-

4′

27,28

28,2

CH3

1,51 (s)

5′

27,28

28,2

CH3

1,51 (s)

195,76

195,2

CH

9,91 (s)

3-CHO

đo trong CDCl3; #)C của hợp chất clauszoline B đo trong acetone-d6 [ Chem. Eur. J.,
20, 8536 (2014)]. *) Tín hiệu chị che khuất.
a)

Hình 3.41. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất AC1


18
So sánh số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất AC1 với clauszoline B
[Chem. Eur. J., 20, 8536 (2014)] cho thấy số liệu phù hợp cho tất cả các
vị trí. Cho phép khẳng định AC1 là clauszoline B. Bên cạnh đó, trên phổ
khối lượng ESI-MS xuất hiện píc ion giả phân tử [M+H]+ tại m/z 294,
hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử: C18H15 O3N (M = 293), điều
này càng minh chứng cho kết luận ở trên. Hợp chất clauszoline B được
phân lập lần đầu tiên từ loài Clausena excavata [Chem. Pharm. Bull., 44,
2231 (1996)]. Tuy nhiên, đây là lần đầu tiên hợp chất clauszoline B được
phân lập từ chi Antidesma.
3.3. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ loài A. ghaesembilla
Phần này trình bày kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 14
hợp chất được phân lập từ loài A. ghaesembilla.

AG1: Antidesoic acid A
(hợp chất mới)

AG2: Antidesoic acid B
(hợp chất mới)

AG3: Vitexin

AG4: Orientin

AG5: Isovitexin

AG6: Homoorientin

AG7: Luteolin-4′-O-β-D-glucopyranoside

AG8: Amentoflavone


19

AG9: Vanillyl alcohol 4-Oβ-D-glucopyranoside

AG12: 3,4,5Trimethoxyphenyl-O-β-Dglucopyranoside

AG10: 4-Hydroxy-3,5dimethoxybenzyl-O-β-Dglucopyranoside

AG13: Sinapyl alcohol 4O-β-D-glucopyranoside

AG11: 3-Hydroxy-4,5dimethoxyphenyl-O-β-Dglucopyranoside

AG14:

(–)-Syringaresinol

3.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được

3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ loài A. acidum
Mười hai hợp chất (AC1-AC12) phân lập được từ loài A. acidum
được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu cấp (HL-60) (Bảng
2.1. và 2.2.). Kết quả cho thấy hợp chất AC1 thể hiện hoạt tính mạnh nhất
với giá trị IC50 là 4,8 µM (tương đương với chất đối chứng dương
mitoxantrone, IC50 là 6,8 µM). Các hợp chất AC3-AC8, AC10 thể hiện
hoạt tính yếu hơn với giá trị IC50 trong khoảng 8,0 µM đến 44,7 µM. Bên
cạnh đó, các hợp chất này đều được kiểm tra khả năng gây độc trên dòng
tế bào mô phổi thường HEL-299 (Bảng 2.2.). Kết quả cho thấy, các hợp
chất này đều ảnh hưởng đến sự phát triển bình thường đối với dòng tế bào
thử nghiệm (HEL-299) với giá trị IC50 >100 µM.
Hợp chất AC1 có hoạt tính mạnh nhất được lựa chọn để nghiên cứu
cơ chế gây chết tế bào. Tế bào ung thư HL-60 được xử lý với hợp chất
AC1 (4,8 µM) trong 24 giờ và 48 giờ. Kết quả cho thấy ở mẫu được xử lý
với AC1 trong 24 giờ đã xuất hiện các biểu hiện đặc trưng về hình thái
nhân tế bào chết theo chương trình như sự co lại và phát sáng khi nhuộm
với thuốc thử Hoechst 33342, sự gia tăng các tế bào siêu lưỡng bội ở giai


20
đoạn sub-G1. Các thể đặc trưng này xuất hiện nhiều hơn ở mẫu thử được
xử lý với hợp chất AC1 trong 48 giờ. Một số protein đặc trưng cho quá
trình tế bào chết theo chương trình như: Bcl-2, Bax, Caspase-3, Caspase-9,
PARP… Ở cấp độ protein, khi xử lý với hợp chất AC1 (4,8 µM) trong 24
giờ và 48 giờ, chúng tôi quan sát thấy sự thay đổi trong biểu hiện của các
protein liên quan đến quá trình tự chết của tế bào như: tăng cường biểu

hiện của Bax, Caspase-3 và PARP, giảm độ biểu hiện của Bcl-2. Những
kết quả này cho thấy hợp chất AC1 gây nên quá trình chết theo chương
trình của tế bào thông qua làm thay đổi mức độ biểu hiện của các protein
liên quan trong tế bào ung thư HL-60 (tăng biểu hiện của Bax, Caspase-3,
PARP và giảm biểu hiện Bcl-2). Con đường tín hiệu PI3K/AKT điều hòa
sự sống, tăng trưởng và quá trình chết của tế bào. Đặc biệt, AKT dạng hoạt
hóa tham gia vào quá trình sống và tăng trưởng của tế bào ung thư thông
qua protein c-myc, một loại protein thường biểu hiện mạnh ở nhiều dạng
khối u. Nhằm tìm hiểu xem con đường tín hiệu nội bào nào bị ảnh hưởng
bởi AC1, chúng tôi phân tích quá trình photphorin hóa của AKT và độ biểu
hiện của c-myc bằng thí nghiệm Western-blot. Kết quả cho thấy, sau khi xử
lý với hợp chất AC1, quá trình photphorin hóa của AKT bị giảm đi, dẫn
đến các tế bào tự chết. Hơn nữa, mức độ biểu hiện của c-myc cũng đồng
thời thấp hơn. Đây là những bằng chứng cho thấy tác dụng làm các tế bào
chết theo chương trình của hợp chất AC1 là thông qua sự giảm mức độ
biểu hiện của p-AKT và c-myc.

3.4.2. Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập từ loài A.
hainanensis
Trong các hợp chất phân lập được từ loài A. hainanensis, các hợp chất
AH8, AH14, AH15 và AH18 gây ức chế sự sản sinh NO trong tế bào BV2
mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 5,3, 8,6, 5,0 và 7,4 µM so với chất đối
chứng dương (butein, IC50 = 3,8 µM). Các hợp chất AH1-AH3, AH5 và
AH7 thể hiện hoạt tính yếu hơn với các giá trị IC50 từ 10,8 đến 26,3 µM.
Trong các hợp chất phân lập được từ loài A. hainanensis, các hợp chất
lignan glycoside (AH1-AH3, AH5) có hoạt tính ức chế sự sản sinh NO tốt
hơn so với hợp chất lignan không có phần glycoside (AH4). Bên cạnh đó,


21

các hợp chất megastigmane có nhóm carbonyl tại C-9 (AH14, AH15) thể
hiện hoạt tính mạnh hơn hẳn so với các hợp chất megastigmane không có
nhóm carbonyl tại C-9 (AH11-AH13). Như vậy trong các hợp chất phân
lập được, đối với các hợp chất ligan sự có mặt của phần đường và nhóm
carbonyl tại C-9 của các hợp chất dạng khung megastigmane làm tăng hoạt
tính ức chế sự sản sinh NO trong tế bào BV2.
3.4.3. Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập từ loài A.
ghaesembilla
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản sinh
NO trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS của 14 hợp chất (AG1AG13) cho thấy, các hợp chất AG4 và AG8 thể hiện hoạt tính mạnh với
giá trị IC50 lần lượt là 9,5 và 5,4 µM so với chất đối chứng dương (butein,
IC50 = 3,8 µM). Ngoài trừ hợp chất AG14 không thể hiện hoạt tính, 11
hợp chất còn lại (AG1-AG3, AG5-AG7, AG9-AG13) có hoạt tính ở mức
trung bình với giá trị IC50 trong khoảng 21,4 µM đến 72,7 µM.
KẾT LUẬN
Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về thành phần hóa học và hoạt
tính sinh học của ba loài A. hainanensis, A. acidum và A. ghaesembilla ở
Việt Nam.
1. Nghiên cứu về thành phần hóa học
Sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký và các phương pháp phổ
hiện đại đã phân lập và xác định cấu trúc 44 hợp chất từ các loài A.
hainanensis, A. acidum, A. ghaesembilla. Cụ thể:
- Từ loài A. hainanensis đã phân lập và xác định cấu trúc 18 hợp
chất. Trong đó, có hai hợp chất mới là (7S,7R,8S,8R)-3,3- dimethoxy7,7-epoxylignan-4,4,9-triol 4-O-β-D-glucopyranoside (AH1) và 9-Oformylaviculin (AH2); ba hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ họ
Euphorbiaceae là β-D-glucopyranosyl phaseate (AH11), megastigm-7ene-3-ol-9-one 3-O-α-L-arabinofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside
(AH15), lotusanine B (AH18); ba hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ
chi Antidesma là (+)-isolariciresinol 9-O-β-D-glucopyranoside (AH3),
(+)-lyoniresinol-9-O-β-D-glucopyranoside (AH5), ampelopsisionoside

22
(AH12) và 10 hợp chất đã biết khác (–)-lyoniresinol (AH4), 1-O-(2,4dihydroxy-6-methoxyphenyl)-6-O-(4-hydroxy-3,5dimethoxybenzoyl)-β-D-glucopyranoside
(AH6),
4-O-[6-O-(4hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl)-β-D-glucopyranosyl]-3-hydroxy
phenethyl alcohol (AH7), 4-hydroxymethyl-2-methoxyphenyl-6-Osyringoyl-β-D-glucopyranoside (AH8), phenethyl α-L-arabinofuranosyl(1→6)-O-β-D-glucopyranoside (AH9), syringoyl-O-β-D-glucopyranoside
(AH10), alangioside A (AH13), alangionoside L (AH14), N–transferuloyloctopamide (AH16) và trans-linalool-3,6-oxide 7-O-β-Dglucopyranoside (AH17).
- Từ loài A. acidum đã phân lập và xác định cấu trúc 12 hợp
chất. Trong đó, có một hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ tự nhiên là 5demethyltoddaculin (AC6); bảy hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi
Antidesma là clauszoline B (AC1), clauszoline H (AC2), mukonal (AC3), 7methoxymukonal (AC4), heptaphyline (AC5), xanthoxyletin (AC7),
alloxanthoxyletin (AC8) và bốn hợp chất đã biết khác là (E)-p-propenylphenol
O-β-D-glucopyranoside (AC9), p-methoxycinnamaldehyde (AC10), trans-4methoxycinnamyl alcohol (AC11), vanilin (AC12).
- Từ loài A. ghaesembilla đã phân lập và xác định cấu trúc 14 hợp
chất. Trong đó, có hai hợp chất mới là antidesoic acid A (AG1) và
antidesoic acid B (AG2); tám hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi
Antidesma là vitexin (AG3), orientin (AG4), isovitexin (AG5),
homoorientin
(AG6),
4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzyl-O-β-Dglucopyranoside
(AG10),
3-hydroxy-4,5-dimethoxyphenyl-O-β-Dglucopyranoside (AG11), 3,4,5-trimethoxyphenyl-O-β-D-glucopyranoside
(AG12), sinapyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside (AG13) và bốn hợp
chất đã biết khác là luteolin-4′-O-β-D-glucopyranoside (AG7),
amentoflavone (AG8), vanillyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside (AG9),
(–)-syringaresinol (AG14).
2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học
- Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu HL-60
của 12 hợp chất (AC1- AC12) phân lập được từ loài A. acidum. Kết quả


23

cho thấy, các hợp chất AC1 và AC4 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào
mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 4,8 µM và 8,0 µM (tương đương với đối
chứng dương mitoxantrone, IC50 = 6,8 µM). Các hợp chất AC3, AC5-8
có hoạt tính ức chế dòng tế bào HL-60 ở mức độ trung bình với giá trị
IC50 trong khoảng từ 22,5 đến 28,1 µM và hợp chất AC10 có hoạt tính
yếu hơn với giá trị IC50 = 44,7±3,3 µM. Nghiên cứu cơ chế gây chết tế
bào ung thư HL-60 của hợp chất AC1 theo hình thái tế bào cũng như
nghiên cứu ở cấp độ phân tử đã chỉ ra hợp chất này gây chết theo chương
trình thông qua sự thay đổi trong biểu hiện của các protein liên quan đến
quá trình tự chết của tế bào như: tăng cường biểu hiện của Bax, Caspase3 và PARP, giảm độ biểu hiện của Bcl-2, p-AKT và c-myc.
- Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản sinh
NO trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS của 18 hợp chất (AH1AH18) phân lập được từ loài A. hainanensis. Kết quả cho thấy các hợp chất
AH8, AH14, AH15 và AH18 thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị IC50 lần
lượt là 5,3 µM, 8,6 µM, 5,0 µM và 7,4 µM so với chất đối chứng dương
butein (IC50 = 3,8 µM).
- Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản sinh
NO trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS của 14 hợp chất (AG1AG14) phân lập được từ loài A. ghaesembilla. Kết quả cho thấy các hợp
chất AG4 và AG8 thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 9,5
và 5,4 µM so với chất đối chứng dương butein (IC50 = 3,8 µM).
KIẾN NGHỊ
- Hợp chất AC4 có hoạt tính gây độc mạnh dòng tế bào ung thư máu
cấp (HL-60). Vì vậy, cần thêm các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế gây độc tế
bào HL-60 của các hợp chất này.
- Trong thí nghiệm của chúng tôi, các hợp chất AH8, AH14, AH15,
AH18, AG4 và AG8 thể hiện hoạt tính ức chế mạnh đối với sự sản sinh
NO trong BV2 được kích thích bởi LPS với giá trị IC 50 trong khoảng từ
5,0 µM đến 9,5 µM. Do vậy, cần nghiên cứu thêm các thí nghiệm kháng
viêm của hợp chất này để định hướng cho thực nghiệm in vivo.