Nhân nhanh và lai tạo giống động vật

BÀI 1: NHÂN NHANH VÀ LAI TẠO GIỐNG ĐỘNG VẬT
1. Nhân bản vô tính bằng kỹ thuật chuyển nhân
1.1. Nhân bản vô tính là gì?
Nhân bản vô tính động vật hay tạo dòng vô tính là thực hiện các kỹ thuật
để tạo một hay một số cá thể động vật giống nhau về cấu trúc di truyền, không
qua quá trình thụ tinh.
1.2. Cơ sở khoa học
Tế bào động vật có tính toàn năng từ đó từ tế bào soma cũng có thể tạo
nên một cơ thể hoàn chỉnh đồng thời tế bào động vật có thể nuôi cấy trên các
loại môi trường dinh dưỡng tổng hợp bên ngoài cơ thể, chúng sinh trưởng bằng
cách tăng số lượng và kích thước tế bào.
1.3. Kỹ thuật trong nhân bản vô tính
Động vật (cloning) hiện nay dùng một trong 3 kỹ thuật sau:
- Phân tách các tế bào blastomere (blastomere separation)
- Chia cắt phôi túi (blastocyst division)
- Kỹ thuật chuyển nhân tế bào thân (somatic cell nuclear transfer)
1.4. Nhân bản phôi bằng phân tách các tế bào blastomere
(blastomere separation)
 Tóm tắt quy trình:
 Tạo phôi: chọn phôi ở giai đoạn sớm 2-4 hay 8 tế bào.
 Tách rời các tế bào: giai đoạn này các tế bào lien kết yếu nên dung
enzyme tripsin hoặc lắc nhẹ trong môi trường ổn nhiệt và không có ion
Ca2+, Mg2+.
 Đóng gói tế bào: mỗi tế bào phôi được bọc trong màng zona
 Nuôi cấy phôi in vitro đến giai đoạn plastocyst và cấy truyền vào mẹ
nhận phôi đã gây đồng pha.
1.5. Nhân bản phôi bằng chia cắt phôi túi (blastocyst division)
Đầu tiên trứng và tinh trùng cũng được thụ tinh trong ống nghiệm tạo thành
phôi. Nhưng khác với kỹ thuật phân tách blastomere, phôi này được nuôi
cấy cho phân chia tới khi tạo thành blastocyst. Lúc này người chia cắt
blastocyst cũng mang bộ gen lưỡng bội có nguồn gốc từ hai bố- mẹ.

1.6. Nhân bản bằng chuyển nhân tế bào thân (Nuclear Transplanation):
1


 Tóm tắt quy trình nhân bản bằng phương pháp chuyển nhân:
 Lấy tế bào trứng( nhân đơn bội) của cơ thể “mẹ”, hút bỏ nhân đơn bội.
 Lấy tế bào thân trưởng thành (máu, da…) của các cá thể nhân bản, hút
lấy nhân( 2n). tế bào soma được lựa chon để lấy nhân, thường là các
tế bào ở giai đoạn tĩnh (G0) trong chu kỳ tế bào.
 Đưa nhân đơn bội vào trong trứng đã hút bỏ nhân nói trên ( bằng tiêm
trực tiếp hoặc bằng kích thích xung điện)
 Dung hợp tế bào: thực hiện các kỹ thuật xung điện hoặc hóa chất để
dung hợp tế bào. Kích thích để hợp tử tiếp tục phát triển và phân chia
tạo nên khối blastocyst.
Sau đó khối blacktocyst này có thể được:
+ Nuôi cấy trong phòng thí nghiệm nhằm để lấy tế bào gốc, qua
đó có thể tạo ra các bản tế bào gốc phôi mang gen giống với cơ thể
cho tế bào thân
+ Hoặc đem cấy vào tử cung của một “mẹ nuôi” để cho phát
triển hai, qua đó có thể tạo nên một “ bản sao” giống hệt cơ thể cho
nhân tế bào thân( mục đích nhân bản vô tính động vật/ người).
o Những thành tựu đạt được:
 Ở thế giới:
2004: nhân bản bò bằng kỹ thuật chuyển nhân chuỗi: các nhà khoa
học Oxtraylia đã nhân bản một con bò bằng kỹ thuật chuyển nhân chuỗi tên
là Brandy, con bò giống Holstein- Fresian vào tháng 12/2004.
Ngày 12/7/2017, Giám đốc viện Nghiên cứu Hoàng gia Iran (RRI),
Tiến sĩ Mohammed Hossein Nasr e Isfahani cho biết con bò đực được nhân
bản vô tính có tên Bonyana, chào đời ngày 11/7 tại thành phố Isfahan ở miền
Trung Iran.

Các nhà khoa học Nhật Bản đã cho ra đời 26 thế hệ nhân bản vô tính
của
một con chuột duy nhất và việc này có thể mở đường cho việc vô
tính hàng loạt các loại gia cầm có giá trị. Theo nhà nghiên cứu Teruhiko
Wakayama ở Trung tâm phát triển sinh học Riken, nhóm hiện đã cho ra đời
598 con chuột với bản sao giống hệt con chuột "mẫu" trong thí nghiệm đã
kéo dài tới 7 năm.
 Ở Việt Nam:
27/6/2005: Việt Nam nhân bản được phôi nang sao la. Tuy các phôi
nang này dừng phân chia sau 10-12 ngày tuổi vì chưa có tử cung phù hợp để
2


nuôi cấy tiếp nhưng kết quả đã chứng tỏ thành công ban đầu trong công
nghệ nhân bản nước ta.
Viện Công nghệ sinh học cho biết đã nhân bản được giống lợn mini
hoang dã và còn nhân bản vô tính trên các loài khỉ đuôi dài và khỉ vàng.
2. Công nghệ cấy truyền phôi
2.1. Khái niệm
"Cấy truyền phôi" (CTP) là "một quá trình đưa phôi tạo ra từ cá thể cái này (cái
cho phôi) vào cá thể cái khác (cái nhận phôi) phôi vẫn sống, phát triển bình thường
trên cơ sở trạng thái sinh lý sinh dục của cái nhận phôi phù hợp với trạng thái sinh
lý sinh dục của cái cho phôi hoặc phù hợp với tuổi phôi ( gọi sự phù hợp này là
đồng pha)".
2.2 Nguồn gốc cấy truyền phôi
Lần đầu tiên thành công của CTP đã diễn ra tại Anh vào những năm 1890 bởi một
đồng nghiệp tên là Walter Heap, các đối tượng của ông là thỏ. Mặc dù đó là một
thành công,nhưng phôi chuyển đã không được sử dụng thương mại cho đến khi
FSH hooc môn, đó là viết tắt của Follicle Stimulating Hormone, xảy ra vào những
năm 1950. Lúc đầu, kỹ thuật duy nhất là phẫu thuật để cả hai nhú ra và cấy ghép

phôi.
2.3 Lợi ích của cấy truyền phôi
Phổ biến và nhân nhanh các giống tốt, quí, hiếm ra thực tế sản .
Nâng cao cường độ chọn lọc, đẩy mạnh công tác giông trên cơ sở tăng nhanh tiến
bộ di truyền hàng năm.
Nâng cao khả năng sinh sản, các sản phẩm thịt, sữa trong chăn nuôi.
Giúp cho con người dễ dàng, thuận lợi trong việc xuất nhập, vận chuyển, trao đổi
con giống giữa các nước, các vùng, các địa phương đã được thương mại hóa.
Bảo tồn con giống dưới dạng trứng, phôi, tinh trùng nhằm giữ gìn vật liệu di
truyền ( phương pháp ex - situation).
Hạn chế một số dịch bệnh và nâng cao khả năng chống chịu bệnh, khả năng thích
nghi cho con vật ở môi trường mới, cụ thể:
Nếu phôi được đem đến môi trường mới để cấy truyền, mẹ nhận phôi
trong thời gian mang thai đã tạo cho con kháng thể chống lại một số bệnh, và khi
ra đời ngay từ đầu con vật dễ dàng thích ứng với môi trường xung quanh.
3


Làm cơ sở để thúc đẩy nhanh việc nghiên cứu và phát triển một số ngành khoa
học có liên quan.
2.4 Cơ sở khoa học
Cơ sở lý luận
Cơ chế điều hòa chu kỳ sinh dục (cơ chế thần kinh-thể dịch)
Cơ sở thực tiễn
Hiện nay con người đã chế tạo thành công một số hormon sinh dục như: FSL,
estrogen progesterone,... Do đó có thể điều hòa chu kỳ sinh dục nhân tạo, các quá
trình sinh lý, sinh sản của gia súc. Nghiên cứu sản xuất những dụng cụ thu phôi và
xây dựng được những quy trình thu định giá và phân loại phôi.
Tạo ra được môi trường nuôi cấy trứng và hợp tử ở ngoài cơ thể gia súc và
phương pháp bảo tồn phôi đông lạnh.

2.5 Qui trình công nghệ cấy truyền phôi:
Bước 1: Chọn vật cho phôi.
Bước 2: Chọn vật nhận phôi.
Bước 3: Tạo động dục đồng pha giữa động vật cho phôi và động vật nhận phôi
bằng cách sử dụng horemone sinh dục cùng 1 lúc cho cả 2 đối tượng.
Bước 4: Gây siêu bài noãn ở động vật cho phôi.
Bước 5: Gây động dục cho động vật nhận phôi.
Bước 6: Thu hoạch phôi.
Bước 7: Cấy truyền phôi.
2.6. Bảo quản phôi
2.6.1 Thế nào là đông lạnh phôi?
Đông lạnh phôi là phương pháp trữ lạnh phôi ở nhiệt độ cực thấp -196 độ C trong
Nitơ lỏng để làm ngưng hoàn toàn các phản ứng Enzym nội bào, hô hấp tế bào
chuyển hóa và phát triển... lưu giữ phôi trong thời gian rất dài mà khi rã đông
những phôi này vẫn có thể phát triển bình thường.
2.6.2 Các bước tiến hành bảo quản và đông lạnh phôi
Chọn phôi
Phôi được chọn để giữ lại là những phôi có chất lượng cao nhất để có thể sống sót
và phát triển tốt nhất sau khi giải đông.
Môi trường đệm
4


Đối với phôi của những loài động vật khác nhau thì cần có môi trường đệm cũng
khác nhau.
Đối với người môi trường đệm thích hợp nhất là HEPES 20mM thay thế cho hệ
đệm bicarbonate và có thể thêm khoảng 0.5 -.1% hoặc 15% huyết thanh của chính
người nhận.
Chất bảo quản
Glixerol, etilenglicol, polyvinyl pirolydine(PVP), DMSO và sacrose là các chất

thường được sử dụng bổ sung các chất bảo vệ chống lại sự đông lạnh phôi.
Dụng cụ chứa phôi đông lạnh
Phôi có thể được đựng trong các ống nhựa nhỏ ống thuốc tiêm hoặc các cong Rạ
dùng riêng cho việc đông lạnh tinh trùng 0.25 ml hay 20.5 ml.
Tốc độ làm lạnh
Sau tất cả các bước, dựa vào những nguyên tắc trình bày trong phần trên những
phác đồ nhằm trữ phôi sẽ được đưa ra và hoàn chỉnh bằng hai loại phác đồ được sử
dụng rộng rãi hiện nay là áp dụng cho phôi giai đoạn sớm (trước phôi Nang)và cho
giai đoạn muộn (phôi Nang).
2.6.3 Những điều cần lưu ý trong kỹ thuật đông lạnh phôi
Tạo mầm tinh thể: đây là bướcquyết định thành công của kỹ thuật làm lạnh chậm.
Mặc dù hiện nay, các máy làm lạnh đều đã có tùy chọn tạo mầm tinh thể tự động
nhưng độ tin cậy vẫn không thể bằng thao tác bằng tay có kiểm soát. Vì thế bạn
nên lưu ý điểm này khi có ý định đi trữ lạnh phôi.
Thao tác thực hiện và thời gian lưu trữ: theo các nghiên cứu cho thấy chỉ 40s ở
nhiệt độ phòng đã có thể ảnh hưởng đến chất lượng của phôi đang được trữ lạnh.
2.7 Thành tựu của công nghệ phôi
● Trên thế giới:
Một số mốc lịch sử về quá trình phát triển của công nghệ cấy truyền phôi:
- 1890 : thí nghiệm đầu tiên về CTP thành công trên thỏ bởi Walter Heap. Sau đó
thành công cho dê (1932), cho chuột cống (1933), cho cừu (1934), cho lợn (1951),
cho bê (1951).
- 1959: Từ một phôi thỏ Seidel đã nhân lên thành 4 phôi.
- 1970: Thành công trong bảo quản phôi đông lạnh, làm cơ sở cho CTP đông lạnh
trên bò ( 1972).
- 1978: Em bé đầu tiên ra đời từ thụ tinh trong ống nghiệm và CTP.
- 1983: Nghé đầu tiên ra đời bằng CTP tại Mỹ.
- 1984: Cấy phôi sau khi chia hai thành công trên bò.
- 1986: ở cừu đã thành công khi chia phôi thành 4 ở giai đoạn 8 phôi bào( sinh 4
đơn hợp tử qua tách phôi bào). Ở bò sinh 3 và ở ngựa, lợn, dê sinh 2.

5


- 1987: Cô bé sinh ra do cấy ghép gen tăng trưởng nhanh.
- 1991: Nghé đầu tiên trên thế giới ra đời bằng CTP phôi trâu đông lạnh.
- 1992: Bằng kỹ thuật Cloning từ một phôi bò đã cho ra 5 phôi.
- 1997: Một con cừu ra đời và trưởng thành từ nhân tế bào tuyến vú của một cừu
cái 6 năm tuổi.
- 1999: Hội nghị quốc tế lần thứ nhất về CTP được tổ chức tại Mỹ. Vào 26-51974tổ chức cấy phôi quốc tế được thành lập. Năm 1975 hội nghị lần thứ nhất của
tổ chức này được tiến hành, từ đó tới nay hội nghị diễn ra hàng năm ( gắn liền với
các vấn đề sinh sản, giới tính, chuyển gen, …ở vật nuôi). Khi thành lập ( 1974) hội
nghị cấy truyền phôi chỉ có 24 thành viên, sau 10 năm đã có 800 thành viên của 35
nước. Trang thiết bị, hoá chất, dụng cụ chuyên dùng và kỹ thuật của CTP đã được
thương mại hoá. Cơ sở thương mại đầu tiên trên thế giới về CTP được thành lập tại
Alberta ( Canada), sau đó đã có thêm 20 công ty khác ra đời.
Ở Việt Nam:
Năm 1978 tại trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia đã có một bộ
phận bắt đầu nghiên cứu CTP trên thỏ; năm 1980, CTP trên bò.
Tháng 9/1989, tại Viện chăn nuôi quốc gia, bộ môn CTP được thành lập, gồm
những nghiên cứu viên được đào tạo thực tập từ nước ngoài. Công nghệ CTP đã
được nhà nước hỗ trợ kinh phí bằng các đề tài 47010107 ( 1981-1985), 520-01-13
(1986-1990), KC- 08-16 (1991-1995) với sự chủ trì của viện công nghệ sinh học
và sự tham gia.của Trường đại học nông nghiệp I, Viện quân y 103, Viện chăn
nuôi và một số cơ quan khác.
Những con thỏ đầu tiên ra đời bằng công nghệ cấy truyền phôi vào năm 1979.
Năm 1986, con bê đầu tiên ở nước ta cũng được ra đời từ công nghệ này.
Năm 1994, bò sinh đôi trong đó có một bê do trứng rụng tự nhiên trong chu kỳ
động dục và một bê do cấy truyền phôi. Đây là trường hợp đầu tiên sinh ra ở nước
ta do cán bộ Viện chăn nuôi thực hiện cấy phôi.
Năm 1996-1997, 150 phôi đông lạnh cùng với 2 chuyên gia Newzealand đã đến

Việt Nam để tiến hành thí nghiệm cấy truyền phôi bò sữa trên đàn bò miền nam và
Hà nội.
Kết quả rất khả quan, 40-45% bò cấy phôi đông lạnh đã có chửa. Đến
nay, những bê được sinh ra từ công nghệ cấy truyển phôi sinh trưởng, phát triển rất
tốt, sinh sản bình thường và cho sữa vượt hơn toàn đàn 20-30%.
●

2.8 Tương lai của công nghệ cấy truyền phôi
Phạm vi của sự phát triển trong lĩnh vực chuyển phôi rất lớn và thú vị. Việc thực
hiện thương mại của kỹ thuật rất có thể sẽ có tác động lớn hơn đến nghiên cứu.
Công nghệ hiện nay cho thấy một xu hướng cải tiến và sàng lọc.
6


3. Lai giống vật nuôi
3.1 Khái niệm
Trong sinh học, lai giống (hybrid) là sự kết hợp các phẩm chất của hai sinh vật
thuộc hai giống, hoặc loài, chi thực vật hoặc động vật khác nhau, thông qua sinh
sản hữu tính. Con lai của hai giống, loài khác nhau không phải lúc nào tính trạng
cũng mang sự hòa hợp về di truyền (Blending inheritance) giữa bố mẹ của chúng,
nhưng cho thấy ưu thế lai, chẳng hạn như có sức sống cao hơn, sinh trưởng nhanh,
phát triển mạnh, chống chịu bệnh tật tốt, năng suất cao, thích nghi tốt.
3.2 Động lực lai chéo
Từ thời xa xưa con người đã thực hiện pháp lai xa giữa hai loài ngựa và lừa tạo ra
con lai là la, không có khả năng sinh sản. Điều đó chứng tỏ sự quan tâm đến việc
tìm hiểu và vận dụng các quy luật về di truyền, lại tạo, giao phối nhầm tạo ra giống
vật nuôi có ưu thế về năng suất, khả năng chịu đựng hay đáp ứng các yêu cầu trong
sản xuất .
Ưu thế lai là một trong những lý do để áp dụng lai giống của giống hoặc dây
chuyền. Những ảnh hưởng của sự thống trị được quan sát thấy ở tất cả các loài và

giữa các loài có thể kết luận rằng ước tính cho ưu thế lai cao hơn đối với các đặc
điểm có tỷ lệ di truyền thấp và thấp hơn đối với những đặc điểm có tính di truyền
cao. Ưu thế lai thường rất quan trọng đối với khả năng sinh sản và đặc điểm sức
khoẻ mà không thể cải thiện một cách dễ dàng nhờ chọn lọc giống do tính di
truyền thấp. Do đó, việc cải thiện sức khoẻ và các đặc điểm sinh sản thường là một
động lực quan trọng để áp dụng lai giống. Lý do thứ hai để lai tạo là để khai thác
sự bổ sung của giống hoặc đường: sự kết hợp của các đặc tính của hai giống hoặc
dây chuyền là thuận lợi. Lý do thứ ba là lai giống kết hợp các đặc tính không thể
dễ dàng được cải thiện đồng thời trong một giống chó. Lý do cuối cùng để lai tạo
giống là việc bảo vệ sự cải tiến di truyền trong các dòng lựa chọn của các công ty
thương mại.
3.3 Phương pháp lai tạo giống
Phương pháp lai là phương pháp cho giao phối những cá thể thuộc các dòng khác
nhau trong cùng một giống hoặc các giống khác nhau nhằm phát huy ưu thế lai cho
đời sau (đời con) là cơ sở để nâng cao năng suất và sức sống của vật nuôi. Thông
qua phương pháp lai sẽ tạo ra tổ hợp của các yếu tố di truyền khác nhau.
3.3.1 Lai kinh tế
Lai kinh tế (Commercial crossing), còn gọi là lai công nghiệp, là phương
pháp lai giữa hai cơ thể (đực và cái) thuộc hai, ba, bốn dòng, hoặc giống, hoặc loài
khác nhau để tạo con lai thương phẩm; con lai này không sử dụng làm giống mà
7


chỉ để nuôi lấy sản phẩm thịt, trứng, sữa… Lai kinh tế được gọi là lai công nghiệp
vì chỉ dùng con lai F1 làm sản phẩm, sản phẩm có thể sản xuất nhanh, hàng loạt,
có chất lượng trong một thời gian tương đối ngắn.
Trong công tác giống, các giống mới thường được hình thành bằng con đường lai
tạo vì những giống gốc ban đầu ít nhiều có pha máu giữa nhiều giống. Việc lai tạo
đã có ảnh hưởng tốt đến sản lượng và chất lượng của sản phẩm (Trần Đình Miên
và Nguyễn Văn Thiện, 1995).

Bên cạnh đó, mục đích của lai tạo còn nhằm sử dụng hiện tượng sinh học quan
trọng đó là ưu thế lai (Heteorosis) làm cho sức sống của con vật, sức miễn kháng
đối với bệnh tật và các tính trạng kinh tế được nâng cao, đồng thời thông qua các
chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật của tổ hợp lai, ưu thế lai làm căn cứ cho việc chọn lọc
giống gia súc (Lê Đình Lương và Phan Cự Nhân, 1994).
Trong chăn nuôi gia cầm, lai kinh tế có hai phương pháp lai là lai đơn và lai kép.
3.3.2 Lai luân chuyển
Lai luân chuyển (Rotation crossing) là phương pháp lai sử dụng nhiều đực giống
thuộc các giống khác nhau để cho giao phối lần lượt với những con cái lai qua các
thế hệ cho tới khi tạo được con lai mang những tính trạng mong muốn.
3.3.3 Lai cải tạo
Lai cải tạo (Grading up) là phương pháp sử dụng một giống cao sản, tốt hơn
nhiều mặt, cho giao phối với một giống kém hơn để cải tạo giống sau.
Ở nước ta thường dùng những con đực tốt nhất của giống ngoại cho phối với
những con cái tốt nhất của giống địa phương. Con đực giống cao sản được sử dụng
liên tiếp qua nhiều đời lai. Sau 4 – 5 thế hệ, giống địa phương đã cải tạo sẽ được
gần như giống ngoại thuần chủng, chẳng hạn lợn được tăng tầm vóc, tăng tỉ lệ nạc
trong thịt. Về mặt di truyền học, phương pháp lai cải tiến giống ban đầu làm tăng tỉ
lệ thể dị hợp, sau đó tăng dần tỉ lệ thể đồng hợp.
3.3.4 Lai gây thành
Lai gây thành (Crossing for creating new breeds) là một phương pháp lai sử dụng
nhiều giống tốt phối hợp lại để tạo nên giống mới có các tính trạng tốt hơn các
giống gốc tham gia.
Khi cần tạo ra giống mới người ta thường áp dụng phương pháp này, thường
dùng nhiều giống, mỗi giống có những đặc điểm riêng.
3.3.5 Lai cải tiến
Lai cải tiến dùng trong trường hợp một dòng, một giống vịt về cơ bản đã đạt được
những tiêu chuẩn chính nhưng còn một vài đặc điểm cần khắc phục.

8

Ví dụ: Vịt Khaki Campbell có sản lượng trứng khá cao nhưng lại có lông màu
Khaki, nhưng người tiêu dùng có mặc cảm khi dùng trứng vịt lộn. Do vậy, có thể
dùng vịt CV2000 Layer để cải tiến đặc điểm này.
3.3.6 Hồi giao
Hồi giao, còn gọi là phản giao, lai ngược, lai trở lại (Back crossing, criss
crossing) là một phương pháp lai giống bằng cách cho con lai giao phối trở lại với
một trong các dạng của giống gốc.
Ví dụ: lấy con lai của hai giống A và B cho giao phối với đực của giống A hoặc
đực của giống B.
Hồi giao lặp lại (Repeated backcross) là sự hồi giao thực hiện lại sau một số thế
hệ nhất định.
3.3.7 Lai đơn và lai kép
Lai đơn là một phương pháp lai sử dụng trong phạm vi hai giống, cùng cặp tính
trạng.
Lai kép là phương pháp lai được sử dụng trong phạm vi nhiều giống, nhiều cặp
tính trạng (từ 2 giống với 2 cặp tính trạng trở lên).
Tổ hợp lai tối ưu là khả năng do lai giữa những cá thể, những dòng, những giống
nhất định để có được kết quả cao hơn so với những cặp lai khác.
3.3.8 Giao dòng
Giao dòng (Cross - crossing), còn gọi là lai dòng, là cho giao phối hai dòng với
nhau để tạo nên dòng mới, có các tính trạng bổ sung, phối hợp từ hai dòng gốc.
Các phương pháp giao dòng gồm có:
Dùng hai dòng đồng huyết rất gần khác nhau trong cùng giống giao phối với nhau
(Inbreeding-crossing).
Dùng đực đồng huyết rất gần giao phối với cái không đồng huyết cùng giống
(Top - crossing).
Dùng đực đồng huyết rất gần giao phối với cái không đồng huyết khác giống
(Top - crossbreeding).

Dùng hai dòng đồng huyết rất gần nhưng khác giống giao phối với nhau (Incrossbreeding).
3.3.9 Lai xa
Lai xa là hình thức lai giữa các dạng bố mẹ khác xa nhau về nguồn gốc ( khác
loài, khác chi, khác họ ..) Lai xa thường gặp khó khăn vì con lai không có khả năng
sinh sản hữu tính ( bất thụ )
Những khó khăn trong lai xa :
Ở động vật : + Do chu kì sinh sản khác nhau không phù hợp giữa các loài
+ Bộ máy sinh dục không phù hợp, tinh trùng khác loài chết trong
đường sinh dục cái.
9


*Khó khăn chủ yếu : con lai bất thụ .
Ứng dụng của phương pháp lai xa :
- Lai xa có ý nghĩa quan trọng trong chọn giống ở cây trồng sinh sản sinh dưỡng vì
không cần giải quyết vấn đề bất thụ.
- Trong chọn giống vật nuôi, lai xa bị hạn chế vì đa số những động vật có hệ thần
kinh phát triển, kiễm soát tập tính giao phối và dễ bị rối loạn NST giới tính .
3.3.10 Lai Tế Bào
Là sử dụng hợp tử 2 tế bào trần khác loài tạo ra tế bào lai chứa 2 NST của 2 tế
bào gốc .
Cách tiến hành : Dùng dung dịch chứa tổ hợp enzim để phân huỷ màng tế bào ,
tạo tế bào trần . Cho các tế bào trần vào môi trường nuôi dưỡng các virut Xenđê đã
giảm hoạt tính tác động , làm cho các tế bào trần kết hợp với nhau , tạo ra tế bào
lai. Dùng môi trường chọn lọc để phân lập các dòng tế bào lai phát triển bình
thường . Dùng các hoocmon phù hợp để kích thích tế bào lai phát triển , tạo thành
cơ thể lai. Người ta còn dùng keo hữu cơ pilieylen glycol hoặc luồng xung điện
cao áp để tăng tỉ lệ kết dính thành tế bào lai.

KẾT LUẬN

Kỹ thuật nhân nhanh và lai tạo giống động vật được ra đời từ sớm nhưng hoàn
thiện muộn hơn những lĩnh vực khác của công nghệ sinh học nói chung và công
nghệ sinh học động vật nói riêng. Điều này bắt nguồn từ lý do cơ bản là tính toàn
năng của tế bào động vật và là do vấn đề hiện nay khoa học vẫn chưa tìm ra những
phương thức hiệu quả để kiểm soát quá trình biệt hóa của tế bào gốc phôi nuôi
trong ống nghiệm để thành tế bào tốt chứ không phải tế bào ác.
Tuy nhiên không thể phũ nhận kỹ thuật nhân nhanh và lai tạo giống động vật đã
mở ra nhiều hướng ứng dụng quan trọng trong đời sống của con người: Nhân bản
các nguồn gen quý hiếm, tạo các thế hệ lai mang phẩm chất vượt trội hơn so với bố
mẹ, là tiền đề cho việc tạo ra các dòng mới hữu thụ tăng đa dạng sinh học hay các
vấn đề điều trị các bệnh nan y, thay thế các cơ quan, bộ phận của cơ thể bị tổn
thương hoặc thậm chí đã có thể tạo được cơ thể hoàn chỉnh bằng phương pháp
nhân bản vô tính... Tuy nhiên, ngoài các vấn đề về khoa học kỹ thuật thì các
phương pháp nhân nhanh và lai tạo vẫn còn gặp những khác về đạo đức sinh học.
Xong nếu hoàn thiện những bước đi chính xác cho các kỹ thuật nêu trên thì ắt hẳn
đó sẽ là bước tiến vĩ đại của nhanh loại.

10


BÀI 2: THỤ TINH NHÂN TẠO
khái niệm: Thụ tinh nhân tạo (Intrauterine insemination - IUI), còn gọi là phối
giống nhân tạo, là một phương pháp hỗ trợ sinh sản, thông qua một số biện pháp
kỹ thuật, con người lấy tinh trùng từ con đực để pha chế, bảo quản và bơm vào
đường sinh dục (tử cung) của con cái.
Mục đích:
-Đối với động vật, nhằm nâng cao khả năng sinh sản của gia súc và tăng tốc độ cải
thiện tiềm năng di truyền của gia súc, do đó góp phần đáng kể gia tăng sản phẩm
chăn nuôi.
-Đối với con người,góp phần tăng khả năng mang thai trong quá trình điều trị ở

những cặp vợ chồng vô sinh,hiếm muộn.
Lịch sử:
Từ thế kỷ thứ 17, thụ tinh nhân tạo mới được nghiên cứu và thực nghiệm rộng rãi
trên nhiều đối tượng: I.I. Ivanov (Nga), L. Spallanzani (Italia), Bibbiena là những
người đầu tiên thí nghiệm thụ tinh nhân tạo trên tằm.Năm 1898 Heape, nhà bác học
người Anh đã phát hiện ra chu kỳ sinh dục ở gia súc, đây là nền tảng khoa học cho
kỹ thuật thụ tinh nhân tạo.
Ở Việt Nam,kỹ thuật thụ tinh nhân tạo trên vật nuôi được ứng dụng đầu tiên vào
năm 1957 tại Học viện Nông - Lâm, nay là Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Năm
1958, thử nghiệm lần đầu trên lợn tại trại An Khánh (Hà Tây), đầu những năn1960
áp dụng thụ tinh nhân tạo trên bò.
So sánh thụ tinh nhân tạo (IUI) và thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)
Giống nhau:
Thụ tinh nhân tạo và thu tinh trong ống nghiệm đều là các phương pháp hỗ trợ sinh
sản an toàn, tốt nhất, đem lại cơ hội thụ thai cao hơn cho những cặp vợ chồng vô
11


sinh hiếm muộn đường con cái.Tuy nhiên, thông thường trong quá trình điều trị vô
sinh hiếm muộn các bác sỹ căn cứ vào điều kiện sức khỏe, hoàn cảnh của bệnh
nhân để áp dụng các phương pháp phù hợp.
Khác nhau:
Thụ tinh nhân tạo (IUI)

Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)

Tinh trùng được lọc rửa, lựa chọn Lựa chọn những tinh trùng khỏe mạnh nhất,
những tinh trùng khỏe mạnh nhất để hút noãn từ buồng trứng của nữ giới để nuôi
bơm trực tiếp vào buồng tử cung của trong ống nghiệm, với những điều kiện
nữ giới.

thuận lợi nhất để quá trình thụ thai xảy ra.

Quá trình thụ tinh nhân tạo thành phôi Quá trình thụ tinh xảy ra hoàn toàn trong
thai diễn ra trong cơ thể nữ giới, phôi ống nghiệm. Bên ngoài cơ thể con người,
được tạo thành sẽ di chuyển xuống sau khi tạo thành phôi mới cấy vào buồng tử
buồng tử cung để làm tổ
cung
Điều kiện để có thể áp dụng phương Phương pháp này được áp dụng cho mọi đối
pháp này đó là tinh trùng của nam tượng vô sinh khi tinh trùng đáp ứng yêu
giới vẫn trong giới hạn có thể thực cầu giới hạn cho phép, nữ giới có buồng
hiện được, nữ giới có buồng tử cung, trứng và tử cung hoạt động bình thường.
buồng trứng và ít nhất một vòi trứng Những trường hợp vô sinh do tắt nghẽn
hoạt động bình thường,
buồng trứng vẫn có thể áp dụng.

ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH NHÂN TẠO
Ưu:Giúp giảm thiểu các yếu tố cản trở quá trình thụ tinh tự nhiên như: Cổ tử cung
bất thường, rối loạn phóng noãn, lạc nội mạc tử cung, kháng thể tinh trùng
nhẹ,xuất tinh ngược dòng, tinh trùng yếu,xuất tinh ngược dòng, tinh trùng yếu.
Đơn giản, dễ thực hiện. Chi phí thấp. Tỉ lệ thành công cao. Tránh được những bệnh
lây lan qua đường tình dục. Chất lượng tinh dịch được kiểm tra kĩ càng trước khi
thụ tinh.
Nhược:Nguy cơ nhiễm trùng cổ tử cung, Nguy cơ đa thai, Nguy cơ mang thai
ngoài tử cung, Nguy cơ phát triển buồng trứng quá kích, Tỉ lệ thành công tỉ lệ
nghịch với độ tuổi, những ca thụ tinh nhân tạo dễ bị sinh non và sảy thai hơn so với
những người mang thai đơn.
.THỤ TINH NHÂN TẠO TRONG CHĂN NUÔI
Khái quát:
Trong kỹ thuật này,người ta đưa tinh trùng của con đực vào thân tử cung con cái
với dụng cụ thích hợp, trong thời gian thích hợp với kỹ thuật thích hợp, tinh trùng

chắc chắn sẽ nhanh chóng đến thụ tinh với trứng.
12


Lợi ích và hạn chế
-lợi ích: Tạo điều kiện thuận lợi cho việc truyền giống, lai tạo giống.Giảm số lượng
đực giống cần nuôi từ đó tiết kiệm thức ăn, chuồng trại, công lao động, tăng năng
suất lao động, hạ giá thành sản phẩm.Việc dùng dụng cụ chuyên dụng được kiểm
tra chặt chẽ nên tránh được sự lây lan của bệnh truyền nhiễm, ký sinh trùng thông
qua đường sinh dục.
-Hạn chế: Trang thiết bị và vốn ban đầu đòi hỏi cao hơn, tốn kém hơn. Thụ tinh
nhân tạo sẽ là con dao 2 lưỡi nếu như công tác thú y kém.Do làm giảm số lượng
đục giống từ đó làm đơn điệu hóa sự biến dị di truyền của đời sau.
Quy trình chung của kỹ thuật lấy tinh gia súc
Các phương pháp khai thác tinh dịch : Phương pháp hải miên, Phương pháp âm
đạo , Phương pháp dùng túi , Phương pháp cơ giới (Massage), Phương pháp dùng
điện, Phương pháp dùng âm đạo giả (AĐG).
-Phương pháp lấy tinh bằng AĐG
Khi dùng đổ nước nóng có nhiệt độ 50 – 600C tùy theo mùa vào van trên vỏ AĐG
sao cho nhiệt độ trong lòng AĐG thích hợp với từng loài đực giống.
Lượng nước nóng đổ đủ vào xoang vỏ - ruột AĐG khác nhau tùy từng loài gia súc,
tuy nhiên yêu cầu chung là lượng nước chiếm 2/3 thể tích xoang ADG.
- Bơm hơi vào xoang AĐG với áp lực thích hợp.
- Bôi trơn lòng AĐG bằng vaselin đã tiêu độc hoặc dùng dung dịch bôi trơn. Chiều
dài bôi trơn trong lòng AĐG từ 1/3 – 1/2.
Giá nhảy: Với trâu, bò, ngựa, dê, cừu,...phải có giá nhảy thích hợp để cố định con
vật làm giá. Giá nhảy có thể làm bằng sắt hoặc gỗ hoặc những con cái dơn thuần.
Huấn luyện đực giống nhảy giá: Thành lập cho gia súc đực một phản xạ có điều
kiện về nhảy giá và thường xuyên củng cố phản xạ này.
Chế độ lấy tinh:Để thu được số lượng và chất lượng tinh dịch cao nhất, kinh tế

nhất cần có chế độ lấy tinh thích hợp. Nếu lấy tinh mau quá sẽ thu được tinh dịch
với số lượng và chất lượng thấp. Kéo dài chế độ này có thể dẫn tới hiện tượng bệnh
lý sinh dục, thậm chí bị liệt.Nếu lấy tinh quá thưa, không những giảm hiệu suất
sinh sản của đực tốt, giảm hiệu quả kinh tế mà tinh trùng thu được có tỷ lệ kỳ hình
cao.
Pha loãng, bảo tồn, vận chuyển tinh dịch
-Pha loãng tinh dịch: Tăng thể tích tinh dịch. Kéo dài thời gian sống của tinh trùng
ở ngoài cơ thể gia súc.
-Bảo tồn tinh dịch: Bảo tồn ở nhiệt độ không khí, Bảo quản ở nhiệt độ lạnh.
THỤ TINH NHÂN TẠO TRÊN NGƯỜI
Tổng quan:
Trên người, thụ tinh nhân tạo chủ yếu nhằm mục đích hỗ trợ sinh sản cho những
cặp vợ chồng hiếm muộn, vô sinh, vì lý do nào đó mà tinh trùng không thể thụ tinh
cho trứng bằng phương pháp tự nhiên như: tinh trùng người chồng yếu, rối loạn
phóng noãn, lạc nội mạc tử cung, yếu tố cổ tử cung,......Để thực hiện được thụ tinh
nhân tạo, người phụ nữ phải có ít nhất một vòi dẫn trứng không bị tắt.
Quy trình thụ tinh nhân tạo:
13


Thủ thuật thực hiện bằng cách đưa một catheter rất nhỏ, mềm, mảnh đi qua cổ tử
cung và bơm tinh trùng đã lọc rửa vào buồng tử cung- Qui trình nhanh, đặt mỏ vịt
và đưa catheter mất 1-1,5 phút. Nếu khó đặt phải dùng cặp cổ tử cung để đặt
Catheter và khoảng 5-6 phút sau mới rút catheter.
-Đối với nam giới:
Lấy mẫu tinh dịch:Người chồng kiêng quan hệ tình dục trong thời gian từ 02 đến
07 ngày;Cần chuẩn bị trước các dụng cụ dùng để xử lý mẫu tinh trùng, mỗi người
một bộ dụng cụ riêng có ghi tên vợ và chồng hoặc đánh mã số; Lấy tinh dịch bằng
phương pháp thủ dâm, rửa tay và bộ phận sinh dục sạch trước khi lấy mẫu.
Lọc rửa tinh trùng:Để tinh dịch ly giải hoàn toàn trong tủ ấm 37°C hoặc nhiệt độ

phòng, trung bình 30 phút; Đánh giá các chỉ số tinh dịch đồ: thể tích, thời gian ly
giải, pH, đếm mật độ tinh trùng.
-Đối với nữ giới:thực hiện kỹ thuật bơm tinh trùng vào buồng tử cung
a) Thời điểm bơm: một lần vào 36 giờ hoặc hai lần vào 24 giờ và 48 giờ sau mũi
tiêm hCG:
b) Người phụ nữ nằm tư thế phụ khoa, trải săng vô trùng vùng bụng và hai đùi;
c) Lau âm hộ bằng nước muối sinh lý;
d) Đặt mỏ vịt, bộc lộ cổ tử cung;
đ) Lau sạch âm đạo và cổ tử cung bằng nước muối sinh lý, lau lại bằng gạc khô;
e) Hút mẫu tinh trùng đã lọc rửa vào bơm tiêm đã được gắn catheter;
g) Luồn nhẹ catheter khi vừa qua lỗ trong cổ tử cung thì dừng lại;
h) Bơm từ từ tinh trùng vào buồng tử cung;
i) Rút nhẹ nhàng catheter ra khỏi buồng tử cung;
k) Tháo mỏ vịt và cho bệnh nhân nằm nghỉ 30 phút;
l) Hỗ trợ hoàng thể: sau bơm tinh trùng vào buồng tử cung dùng progesteron hỗ trợ
pha hoàng thể;
m) Đánh giá có thai: xét nghiệm thai nghén 14 ngày sau bơm tinh trùng vào buồng
tử cung.
Trong khoảng phóng noãn 6h, nếu là yếu tố Nam giới, một số bác sĩ tin rằng
sau phóng noãn là tốt nhất, mặt khác cơ hội để thành công cao là tinh trùng phải
chờ noãn. Khi thời điểm trên cơ sở tiêm hCG, IUI thường được tiến hành trong
khoảng 24-48h sau. Nếu làm 1 lần thì sau 36h, nếu bơm 2 lần thì 24 và 48h. Một
số báo cáo nêu lên, bơm 2 lần tỷ lệ cao hơn 6%. Trên thực tế chỉ bơm 01 lần do
lượng mẫu khó khăn. Do vậy để tăng hiệu suất thì cần có chất lượng tinh trùng tốt,
bệnh nhân đều được kích thích nang noãn, lại được bơm 02 lần vào thời điểm 24
và 48h sau tiêm thuốc rụng trứng.
Tỷ lệ thành công phụ thuộc vào chất lượng tinh trùng và noãn. Nếu tinh
trùng đảm bảo chất lượng, chu kỳ tự nhiên (không sử dụng thuốc kích thích nang
noãn – theo các tác giả trên thế giới) tỷ lệ thành công chỉ 6%. Nếu sử dụng thuốc
kích thích nang noãn (để có nhiều nang trong 1 chu kỳ), tỷ lệ thành công có thể đạt

26%. Nhìn chung, tỷ lệ thành công IUI cho 1 chu kỳ là 15 – 20%. Tỷ lệ đa thai 23
– 30%.
Nhiều nghiên cứu hiện nay chỉ ra rằng tinh trùng lọc rửa có thể sống được
24 – 72h, tuy thế nhưng sau 24h chất lượng giảm đáng kể. Tinh trùng có khả năng
14


cao nhất xuyên qua màng noãn để thụ thai là 6 -12h sau phóng noãn. Có nghiên
cứu phát hiện tinh trùng có thể sống 05 ngày trong dịch nhầy đường sinh dục.

BÀI 3: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐÔNG LẠNH

1. KHÁI NIỆM
Sinh học đông lạnh là một ngành khoa học ứng dụng những kỹ thuật trữ tế
bào sống ở nhiệt độ thấp trong một thời gian rất dài. Ở nhiệt độ của nitơ lỏng
(-196), hầu hết mọi phản ứng hóa học đều không xảy ra, tất cả các hoạt động
bên trong tế bào đều ngừng lại. Các phân tử nước lúc này tồn tại ở dạng kết
hợp, tinh thể hoặc dạng kính. Thời gian bây giờ không mang đến bất cứ sự
tổn hại nào cho tế bào được trữ. Theo cách này, tế bào và mô có thể hồi phục
tới lúc nào con người cần sử dụng.
2. MỤC ĐÍCH
- Giảm thiểu biến đổi kiểu gen, biểu hiện gen, đảm bảo ổn định di truyền.
- Ngăn ngừa sự lão hóa của tế bào.
- Ngăn cản quá trình biệt hóa của tế bào.
- Giảm rủi ro nhiễm vi khuẩn và sự chết tế bào.
- Giảm sự nhiễm chéo giữa các dòng tế bào khác nhau trong invitro.
- Giảm rủi ro biến đổi cấu trúc và sự thay đổi hình thái.
- Giảm chi phí nuôi cấy.
- Thuận lợi cho việc phân loại, tạo dòng.
- Thuận lợi cho việc bảo tồn gen.

- Thuận lợi cho việc vận chuyển.
- Thuận lợi cho việc thương mại hóa.
- Giảm thiểu các thao tác, nuôi cấy không cần thiết nhiều dòng tế bào cùng một
lúc, cùng một nơi, tiết kiệm thời gian, công sức.
15


3. CÁC BƯỚC BẢO QUẢN TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG
LẠNH
- Quá trình thu nhận và thao tác tế bào.
- Quá trình làm lạnh.
- Quá trình trữ lạnh.
- Quá trình giải đông.
- Pha loãng và loại bỏ các chất bảo quản lạnh trước khi nuôi cấy.
4. CÁC BIẾN ĐỔI TRONG QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH
4.1. Sự hình thành tinh thể nước đá
Khi nhiệt độ hạ thấp, sự xuất hiện những tinh thể nước đá đầu tiên là dấu hiệu bắt
đầu của sự biến đổi giai đoạn. Điều này chỉ có thể xảy ra khi nhiệt độ bên trong tế
bào bằng với độ hạ băng điểm của dung dịch mà băng điểm của dung dịch này lại
phụ thuộc vào nồng độ của chất hòa tan. Tuy nhiên, nồng độ bên trong tế bào đậm
đặc hơn bên ngoài tế bào nên sự biến đổi giai đoạn ở bên trong tế bào được xảy ra
ở một nhiệt độ thấp hơn ở bên ngoài tế bào. Trong quá trình đông lạnh, những tinh
thể nước đá được tạo thành trước tiên ở môi trường ngoài tế bào, vì vậy nồng độ
chất hòa tan tăng và áp suất thẩm thấu tăng làm cho nước chuyển động ra ngoài tế
bào và dung tích tế bào giảm. Tốc độ mất nước của tế bào lại phụ thuộc vào tốc độ
đông lạnh. Ở trên tốc độ giới hạn (tốc độ thích hợp tối ưu) khả năng tạo băng đá
nội bào tăng; những tinh thể nước đá tăng kích thước và do đó, sự tổn hại tế bào
cũng nhiều hơn. Ngược lại, ở dưới tốc độ giới hạn, sự sống của tế bào giảm do
nồng độ của chất hòa tan nội bào tăng lên. Người ta nhận thấy trong môi trường
huyền phù, nước biến đổi chậm hơn và sự mất nước nội bào được duy trì sao cho

có sự cân bằng thẩm thấu với môi trường bên ngoài, do đó sẽ gây tổn hại tế bào ít
hơn. Sự có mặt của băng đá nội bào và “hiệu ứng của dung dịch” là hai yếu tố chủ
yếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh, quyết định khả năng sống của tế bào.
Sự hoạt động phối hợp của 4 yếu tố sau đây quyết định hình dạng tinh thể nước đá
được tạo thành trong quá trình đông lạnh:


Nhiệt độ ở thời điểm biến đổi giai đoạn.
16




Tốc độ làm lạnh.



Thành phần các chất hòa tan trong dung dịch.



Nồng độ dung dịch.

Hình 1: Sự hình thành tinh thể đá.
Ở môi trường đẳng trương (áp suất thẩm thấu khoảng 300mOsm/kg), tinh thể đá
thường hình thành ở nhiệt độ -5 đến -150C. Tuy nhiên, đá chỉ tạo thành tự nhiên ở
nhiệt độ -100C. Ở nhiệt độ -5 đến -100 C cần có điều kiện kết hợp. Đó là sự tham
gia của một phần nhỏ chất rắn (ví dụ như hạt bụi hoặc tinh thể đá nhân tạo). Sự tạo
đá càng tăng khi nhiệt độ càng giảm. Ở nhiệt độ khoảng -1300C, tất cả chất liệu
không còn ở dạng lỏng mà đều ở dạng hạt kết tinh hay dạng thủy tinh.Đây là hiện

tượng kết tinh hóa hay còn được gọi là thủy tinh hóa. Hiện tượng này xảy ra do
môi trường có pha chất hòa tan cũng như chất bảo quản đông lạnh có nhiệt độ
đông đá thấp hơn bình thường. Những tinh thể nước hình thành bên trong cũng
như sát bên ngoài tế bào có khả năng gây tổn thương cơ học lên màng tế bào và
các bào quan.

17


Hình 2: Sự biến đổi vật lý của tế bào khi đông lạnh.
Sự tăng thêm nồng độ của các chất hòa tan trong môi trường đông lạnh ảnh hưởng
đến việc hình thành những tinh thể đá. Khi nước chuyển sang dạng tinh thể, lượng
nước ở thể lỏng giảm đi. Do đó, nồng độ các chất hòa tan tăng lên gây mất cân
bằng về áp suất thẩm thấu, kéo nước bên trong tế bào ra ngoài và làm tổn thương
màng tế bào.
Việc tăng nhiệt độ tiềm năng cũng là hậu quả của sự hình thành tinh thể nước đá.
Phân tử nước khi chuyển từ thẻ lỏng sang thể rắn sẽ thoát ra 1 nhiệt lượng. Nếu
nhiều phân tử cùng chuyển sang thể rắn thì lượng nhiệt thoát ra đủ lớn để làm thay
đổi nhiệt độ của môi trường đang từ vài độ âm lên lại 0⁰ C. Thay đổi này ảnh
hưởng đến chức năng của tế bào sau khi giải đông.
4.2. Độ thẩm thấu của môi trường đông lạnh
Nhiệt độ chính xác để kết tinh và thủy tinh hóa hoàn toàn phụ thuộc vào phức hợp
có trong nước. Trong dung dịch NaCl có cùng một áp suất, hiện tượng thủy tinh
hóa xảy ra ở nhiệt độ -20⁰ C đến -30⁰ C. Nhiệt độ này gọi là điểm Eutecti. Vì vậy,
18


trước khi đạt đến điểm này NaCl vẫn ở dạng dung dịch. Số lượng phân tử nước có
ở dạng dung dịch giảm xuống cùng với nhiệt độ, kết quả trực tiếp là giảm độ thẩm
thấu của môi trường, môi trường trở nên ưu trương.

Hình 3: Khi nhiệt độ của dung dịch NaCl đẳng trương hạ thấp liên tục đến điểm
đông hiện tượng kết tinh đá và nồng độ NaCl tăng lên.
Làm lạnh ở nhiệt độ xấp xỉ 00C làm giảm sự khuếch tán một chiều của protein
màng. Ở những nhiệt độ thấp hơn, màng tế bào hướng về nồng độ muối cao, nhất
là trong quá trình đông lạnh chậm. Màng tế bào bị sốc thẩm thấu cùng với sự co
thể tích trong quá trình mất nước. Sau đó, màng tế bào giãn ra, nồng độ các ion
tăng lên, vì vậy, tế bào trở nên rất nhạy cảm với các stress trong quá trình đông
lạnh khi nhiệt độ giảm hoặc khi pha loãng môi trường trong quá trình giải đông.
4.3. Tốc độ khử nước
Tốc độ mất nước của tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Các yếu tố này thay đổi
khác nhau tùy theo từng loài tế bào và vì vậy đóng vai trò quyết định trong việc
xác định quá trình bảo quản đông lạnh ở điều kiện tốt nhất. Các yếu tố liên quan là
tính thẩm thấu nước của màng tế bào (Lp), năng lượng hoạt hóa của tính thấm
nước này (dH*) và tỉ lệ diện tích bề mặt/ thể tích của tế bào (SA/V).
Bằng cách đo tỷ lệ thay đổi về diện tích bề mặt tế bào và thể tích tế bào ở các độ
thẩm thấu khác nhau, có thể xác định được tính thấm của màng tế bào (Lp). Diện
tích bề mặt càng lớn, tỉ lệ SA/V càng cao thì tính thấm của màng tế bào (Lp) càng
lớn. Đối với hầu hết các tế bào của động vật có vú, tính thấm của màng tế bào (Lp)
có giá trị khoảng 0.43 m3/m2.phút.atmosphere. Tuy nhiên đối với hồng cầu và tinh
19


trùng thì tính thấm của màng tế bào (Lp) lớn hơn nhiều. Điều này có nghĩa là hồng
cầu và tinh trùng mất nước nhanh hơn trong dung dịch ưu trương; do đó, tốc độ
bảo quản đông lạnh tốt nhất đối với loại tế bào này là rất quan trọng.
Yếu tố quan trọng thứ hai trong quá trình khử nước là năng lượng hoạt hóa cho
tính thấm nước (dH*). Năng lượng (ở dạng nhiệt) làm cho tế bào có khả năng thấm
nước. Trước đây, bằng cách đo tính thấu của màng tế bào (Lp) ở các nhiệt độ khác
nhau để xác định được dH* đối với trứng. Về thực hành, đây là khoảng nhiệt độ

trên điểm đông lạnh. Kết quả đo được là 14.5 Kcal/mol. Giá trị này tương đối cao
và nói chung, nhiệt độ cứ hạ 10% thì tốc độ khử nước sẽ giảm một nửa.
Cuối cùng, tỉ lệ giữa diện tích bề mặt và thể tích cũng góp phần quan trọng đối với
tốc độ khử nước của tế bào. Nếu tỉ lệ này cao thì tế bào sẽ khử nước nhanh hơn.

Hình 4: Tốc độ mất nước của tế bào trong môi trường ưu trương phụ thuộc vào
nhiệt độ.
4.4. Thể tích của tế bào
Sự thay đổi thể tích tế bào có thể đo được để biểu thị quá trình khử nước. Quá
trình khử nước phụ thuộc vào tính thấm nước màng tế bào (Lp) và năng lượng hoạt
hóa tính thấm nước (dH*) của tế bào. Các giá trị này phụ thuộc vào tốc độ làm
lạnh. Dựa trên cơ sở tính toán, phạm vi thể tích giảm có thể xác định được ở các
tốc độ làm lạnh khác nhau. Ở tốc độ làm lạnh cao, tế bào không bị mất nước nhiều,
và thể tích tế bào không bị giảm nhiều như ở tốc độ làm lạnh thấp. Tốc độ làm lạnh
thấp sẽ làm cho tế bào mất nước. Tuy nhiên, thể tích giảm thực sự ít hơn so với

20


tính toán, điều này có thể là do sai lầm trong phép ngoại suy đối với năng lượng
hoạt hóa tính thấm nước (dH*) (được xác định ở nhiệt độ ở trên điểm đông lạnh).
4.5. Hoạt động của Enzyme
Nghiên cứu cho thấy khi nhiệt độ giảm từ 370C xuống còn 70C, hoạt động của
Enzyme giảm 8 lần. Tốc độ phản ứng Enzyme phụ thuộc vào năng lượng hoạt hóa
của các phân tử phẩn ứng. Từ 200C, tốc độ phản ứng Enzyme giảm theo nhiệt độ
một cách ổn định theo trình tự 2-3 lần với mỗi khoảng giảm 100C (Q10). Tuy nhiên,
trong một số trường hợp, khi hạ nhiệt độ thì sự thay đổi tốc độ phản ứng Enzyme
(ở nhiệt độ tương ứng) không còn rõ rệt, dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và hoạt động
của các protein. Các chất bảo quản đông lạnh có thể đề phòng sự biến đổi này.
4.6. Sự tủa muối và pH của dung dịch

Trong quá trình đông lạnh, độ pH của dung dịch tăng theo sự giảm nhiệt độ, sự cân
bằng acid-base của môi trường biển đổi như sau: lực ion tăng lên, sự kết tủa của
các hợp chất như các protein hòa tan trong môi trường trở nên dễ dàng (salting
out). Các chất bảo quản đông lạnh có thể biến đổi cân bằng acid-base của dung
dịch, chẳng hạn như glycerol và các glycol hoạt động như những base yếu, ester
hoạt động như base mạnh (DMSO chẳng hạn). Sự biến đổi độ pH của dung dịch
theo nhiệt độ sẽ khác nhau theo loại chất bảo quản được sử dụng: với nồng độ
DMSO hay glycerol tăng thêm 50%, độ pH của dung dịch PBS tăng nhanh, nhưng
lại ổn định hơn với propanediol hay methanol; với nồng độ giảm (10-20%) độ pH
của dung dịch PBS và glycerol ổn định, trong khi đó, pH dung dịch đệm Tris có sự
thay đổi nổi bật. Tuy nhiên, pH thích hợp để duy trì hoạt động sinh lí của tế bào
phụ thuộc vào nhiệt độ. Người ta nhận thấy rằng tế bào có thể sống sau bảo quản ở
nhiệt độ xấp xỉ 0⁰ C với pH trên 9.
4.7. Sự hình thành bọt khí
Tế bào có thể chết theo nhiều cách khác nhau do sự hình thành đá. Hơn nữa, tinh
thể nước đá tạo ra các lỗ gây rò rỉ và thể tích nước bị đông lạnh tăng lên (tỉ trọng
của đá thấp hơn tỉ trọng của nước). Do đó, bọt khí có thể được hình thành khi giải
đông tế bào. Năm 1988, Ashwood-Smith mô tả sự hình thành bọt khí dưới tác
21


động của sự hình thành đá. Kích thước của bọt khí thay đổi từ 25 đến 100µm và tỉ
lệ nghịch với tốc độ làm lạnh. Số lượng bọt khí tương ứng với tốc độ làm lạnh.
Bên cạnh các khí hòa tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy tế bào thường dung
CO2 làm hệ đệm để cân bằng độ pH trong môi trường. Khi làm lạnh, các khí này
không còn ở dạng hòa tan nữa mà tách ra thành những bọt khí có khả năng gây hại
tế bào. Trong quá trình giải đông, trong vài phút, bọt khí phát triển thành không
bào lớn bên trong tế bào, làm tế bào phình to. Trong thực tế, bọt khí hình thành rất
nhanh, dẫn đến vỡ tế bào.
Sự hình thành khí xảy ra nhiều khi sử dụng môi trường đông lạnh có chứa

bicarbonate. Vì vậy, PBS thường được sử dụng hơn.
5. Thuyết hai yếu tố
Căn cứ vào những quan sát thực nghiệm về mối quan hệ giữa sự sống sót của tế
bào với nhiệt độ làm lạnh chúng, Mazur đã đưa ra giả thuyết hai yếu tố về những
tổn thương khi đông lạnh tế bào. Hai yếu tố này đã đặt nên tảng cơ sở cho hai cơ
chế khác nhau, và có thể chúng là các nguyên nhân trực tiếp, gây ra những tổn hại
cho tế bào, trong suốt quá trình tiến hành đông lạnh và lưu giữ.
BẢNG 1: Khả năng phản ứng của tế bào khi gặp phải các tác nhân gây stress trong
tiến trình đông lạnh.
Hiện tượng

Phản ứng của tế bào

Giảm nhiệt độ

- Biến đổi lipid màng.
- Giải trùng hợp bộ xương tế bào.

Tăng nồng độ chất hòa tan

- Co thẩm thấu.

Tăng nồng độ ion

- Tác động trực tiếp lên màng tế bào,
làm hòa tan protein màng.

Khử nước

- Mất ổn định lớp photpholipid kép.

Kết tủa muối

- Làm thay đổi pH dung dịch, ảnh
hưởng đến hoạt động của các protein.
22


Sự hình thành bọt khí

- Tổn thương cơ học đối với màng và bộ
xương tế bào.

Dung dịch trở nên quá nhớt

- Làm hạn chế quá trình khuếch tán và
thẩm thấu.

Thay đổi pH

- Gây biến tính protein.

Tế bào bị đặc lại

- Tổn thương màng.

(1)

Với diễn tiến nhiệt độ của quy trình làm lạnh chậm, sự tổn thương xảy ra
do những tác động dung dịch (ví dụ như nồng độ chất tan/chất điện li, sự

mất nước của tế bào nhanh đột ngột, và sự giảm phần không bị đóng đá
trong khoảng không ngoại bào).

(2)

Với diễn tiến nhiệt độ của quy trình làm lạnh nhanh, sự tổn thương do
hình thành đá nội bào gây chết. Nhiệt độ làm lạnh tối ưu cho sự sống sót của
tế bào phải đủ thấp để tránh sự hình thành đá nội bào, nhưng cũng phải đủ
cao để giảm đến mức tối thiểu những tác động của dung dịch.

Hình 5: Ảnh hưởng của tốc độ làm lạnh lên sức sống tế bào.
Hình 5 mô tả nhiệt độ làm lạnh tối ưu, ở đó hai yếu tố gây thiệt hại được giữ một
cách cân bằng, và xác suất sống của tế bào đạt đến một giá trị cực đại. Những giá
23


trị tốt nhất cho tất cả các quá trình làm lạnh hữu dụng có thể được giải thích trong
giới hạn của sự cân bằng giữa tác động dung dịch và sự hình thành đá nội bào.
Mặc dù, từ những bằng chứng thực nghiệm đều thấy rằng, thuyết hai yếu tố nói
trên như là một lời giải thích hiển nhiên, hợp lí về sự tổn thương của tế bào trong
suốt quá trình làm lạnh, nhưng phương pháp bảo quản bằng đông lạnh tốt nhất sẽ
khác nhau tuỳ vào từng loại tế bào. Bổ sung thêm cho hai cơ chế tổn thương này,
còn có những cơ chế khác đáng quan tâm, chẳng hạn sự làm lạnh cũng có thể gây
nên tổn thương hệ miễn dịch và kích hoạt tế bào chết theo chương trình
(apoptosis), có thể những vấn đề nêu trên cũng là nguyên nhân gây ra sự tổn
thương tế bào. Tế bào ít khi tiếp xúc trực tiếp với các tinh thể nước đá, và đúng
hơn là chúng tập hợp vào những nơi không có sự đóng băng, đồng thời cũng chính
tại các vị trí này, tế bào được cô lập bởi các tác nhân vật lý, và điều này đã tạo nên
các stress cho tế bào. Đó là sự phản ứng tự nhiên của tế bào đối với các tác nhân
này để chúng có thể sống sót và tồn tại. Tế bào phải chịu tác động của những tác

nhân nói trên và luôn luôn thay đổi trong suốt quá trình đông lạnh. Tuy nhiên, các
phản ứng thẩm thấu qua màng sinh chất là yếu tố có tính quyết định đầu tiên cho
sự tồn tại của tế bào. Trong những môi trường ưu trương, tế bào sẽ gặp phải sự mất
tính thấm với nước, giới hạn tổn thương này phụ thuộc vào nhiệt độ đông lạnh. Sức
chịu đựng của tế bào khi đông lạnh tại những thang nhiệt độ chậm sẽ phụ thuộc
vào khả năng của tế bào, nhằm chống lại sự thâm nhập của các tác nhân stress. Sức
chống chịu của tế bào trước áp lực của sự tăng khuếch tán nước, khi nhiệt độ làm
lạnh tăng và những thành phần của tế bào có thể chậm đông hơn, trước khi tất cả
những phần nước đóng băng bị loại thải. Dưới những điều kiện này, tế bào co lại
và sự tổn thương màng sẽ giảm đến mức tối thiểu. Những hiện tượng này xảy ra
khi tốc độ làm lạnh được cho là tốt nhất.
6. PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH
6.1. Đông lạnh chậm chương trình (Programmed slow freezing method)
 Đặc điểm:
- Sử dụng chất bảo quản với nồng độ thấp (1-2M).
24


- Tốc độ làm lạnh chậm (0,1 – 5oC/phút trong giai đoạn giảm nhiệt xuống -80C).
- Hạ nhiệt tự động.
- Sự khử nước diễn ra suốt quá trình làm lạnh.
- Cân bằng giữa tốc độ nước rời khỏi tế bào và nước chuyển sang dạng đá.
- Chi phí cao (máy tự động), tổn thương tế bào do tác động của nồng độ chất
tan.
 Ưu, nhược điểm của phương pháp:
- Nhược điểm:
Tỷ lệ phôi sống không cao, mất nhiều thời gian, cần sử dụng máy khi trữ lạnh,
sử dụng nhiều nitơ, chương trình không ổn định. Trong hạ nhiệt độ chậm, quá trình
mất nước cần được diễn ra từ từ để hạn chế sự thành lập tinh thể nước đá. Do đó,
thời gian cần thiết để hoàn tất một quy trình đông lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt

độ chậm có thể kéo dài gấp 10 lần so với hạ nhiệt độ cực nhanh. Để có thể đảm
bảo được tốc độ hạ nhiệt trong phương pháp đông lạnh chậm, người ta cần trang bị
hệ thống hạ nhiệt độ bằng hơi nitơ lỏng. Chi phí đầu tư cho một hệ thống này rất
cao, chưa kể đến chi phí bảo trì và sửa chữa hằng năm. Khó khăn cơ bản là phải có
được phôi giai đoạn muộn, hay nói cách khác phải nuôi cấy phôi đến được giai
đoạn phôi nang (blastocyst).
- Ưu điểm: Do sử dụng chất bảo quản ở nồng độ thấp nên ít gây tổn thương về
cấu trúc tế bào.
6.2. Đông lạnh nhanh ba bước (Stepwise freezing method)
 Đặc điểm:
- Nồng độ chất bảo quản thấp.
- Tốc độ làm lạnh nhanh.
- Hạ nhiệt: ba bước (Đặt các cryotube ở tủ mát 4oC trong 30 phút và chuyển
sang tủ lạnh -200C trong 45 phút, sau đó chuyển sang tủ lạnh -80oC và bảo quản
qua đêm).
- Khử nước không hoàn toàn, hình thành đá nội bào.
- Cải tiến - Đông lạnh in situ (đông lạnh trong bình nuôi).
25