Nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen Isopentenyl transferase (IPT) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens (Luận văn thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

NGHIÊN C U TẠO CÁC

NG NG

ISOPENTENYL TRANSFERASE (IPT
NẠP NH

MANG G N

NG PH

NG PHÁP I N

VI KHU N AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Người hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng

H

vi n

: Tr n uy H ng

Hà Nội – 2015


L i cảm n
Để hoàn thành bản luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
guy n ăn Đ ng

tận t nh, d u dắt, h ớng dẫn, truy n

qu b u c ng nh

t nh ng inh nghi

ng vi n và t o mọi i u ki n giúp ỡ tôi trong qu tr nh học

tập và nghi n cứu.
Tôi xin g i l i cả

ơn ến phòng ào t o

t o i u i n và tận t nh h ớng dẫn

ọi th t c ể tôi c thể hoàn thành luận văn này
ôi xin g i l i cả ơn tới tập thể c n b

hòng thí nghi m Trọng iể Công ngh

tế bào hực vật - Vi n Di truy n ông nghi p

giúp ỡ nhi t t nh trong suốt th i

gian tôi thực hi n h a luận.
Cuối c ng nh ng hông
b n bè, nh ng ng
gian là

i

ph n quan trọng, tôi xin g i tới bố mẹ, anh chị c ng
luôn quan tâ , ng h và là chỗ dựa cho tôi trong suốt th i

h a luận này, c ng nh trong cu c sống.

ôi luôn ghi nhớ và hông bao gi qu n sự giúp ỡ vô c ng to lớn
ến tất cả qu th y cô, gia

ôi xin g i

nh, b n bè lòng biết ơn vô tận
Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2015
Học viên

n

i

y H ng


M c

c

L i cảm n ......................................................................................................................................... i
M c

c .............................................................................................................................................. ii

nh m c h nh v ........................................................................................................................... iv
nh m c ảng................................................................................................................................. v
nh m c c c ch vi t t t .............................................................................................................. vi
M

Đ U ........................................................................................................................................... 1

Ch

ng –T NG QUAN ............................................................................................................... 3

1.1

Nguồn gốc cây ngô............................................................................................................ 3

1.2

T nh h nh nghiên cứu ngô trên th giới .......................................................................... 5

1.3

T nh h nh nghiên cứu ngô ở Việt Nam: .......................................................................... 9

1.4
C sở ho học v nghiên cứu nạp gen vào thực vật bằng ph ng ph p
Agrobacterium tumefaciens ........................................................................................................ 13
1.4.1

Ti-Plasmid ............................................................................................................... 14

1.4.2

Chức năng c

1.4.3

C ch chuy n gen ằng A. tumefaciens ............................................................... 16

1.4.4

Gen ch th - gen chọn ọc và c ch hoạt động chọn lọc c a hygromycin ........ 18

T-DNA .......................................................................................... 16

C ch ch u hạn hiện t

1.5

ng già h

và gen IPT ......................................................... 19

1.5.1

C ch ch u hạn c

1.5.2

Hiện t

1.5.3

Đi u hò sự già h

1.5.4

Gen ipt và promoter pSARK12 ............................................................................. 21
C c ph

1.6

Ph

1.6.2

Ki m tr

và v i trò c

ng ph p Southern

Cyto inin ...................................................... 20

ot .................................................................................. 21

hả năng ch u hạn ở t i

ng – VẬT LIỆU VÀ PH

2.1

và c c y u tố ảnh h ởng ....................................................... 20

ng ph p i m tra sự c mặt và i u hiện c a gen bi n nạp ....................... 21

1.6.1
Ch

ng già h

thực vật ................................................................................ 19

cây con ...................................................... 22

NG PHÁP ............................................................................ 24

Vật liệu ............................................................................................................................ 24

2.1.1

Vật liệu thực vật ..................................................................................................... 24

2.1.2

Ch ng vi khuẩn và vector dùng trong chuy n gen ............................................. 24

2.1.3

H

2.2

Ph

chất và thi t b sử d ng.................................................................................. 24

ng ph p nghiên cứu............................................................................................... 25

2.2.1
Quy tr nh chuy n gen vào phôi non thông qu vi huẩn Agrobacterium
tumefaciens .............................................................................................................................. 25

ii


2.2.2

Phân tích cây chuy n gen bằng ph

2.2.3

Đ nh gi

2.2.4

Đ nh gi sự h
Đ

2.3
Ch

hả năng ch u hạn c
già c

đi m, th i gi n và ph

ng ph p sinh học phân tử. ....................... 27

c c dòng ngô chuy n gen ở th i

trong đi u iện

cây con 30

c t h i cành .............................. 31

ng ph p xử ý số liệu ....................................................... 31

ng - K T QUẢ .................................................................................................................... 32

3.1

K t quả c

3.2

Ki m tr

qu tr nh chuy n gen,chọn ọc và t i sinh c
ằng ph

giống ngô................. 32

ng ph p sinh học phân tử............................................................ 35

3.2.1

K t quả t ch chi t NA t ng số ............................................................................ 35

3.2.2

K t quả phân tích cây chuy n gen ằng ph

ng ph p PCR gen hpt ................ 36

3.2.3

K t quả phân tích cây chuy n gen ằng ph

ng ph p PCR gen ipt ................. 37

3.2.4

K t quả phân tích Southern

3.3 K t quả đ nh gi
3.4
Ch

ot c c dòng ngô chuy n gen th hệ T .............. 38

hả năng ch u hạn c

K t quả đ nh gi qu tr nh h

c c dòng ngô chuy n gen ở th i

già c

hi

c t

cây con 40

............................................ 45

ng – THẢO LUẬN ............................................................................................................. 46

4.1

Chuy n gen thông qu vi huẩn ................................................................................... 46

4.2

Phân tích ằng ph

4.3

Đ nh gi s

Ch

ng ph p sinh học phân tử........................................................... 47

ộ i u hiện ch u hạn c

cây con ở đi u iện phòng thí nghiệm......... 49

ng – K T LUẬN VÀ KI N NGH .................................................................................. 52

5.1

K t uận ........................................................................................................................... 52

5.2

Ki n ngh ......................................................................................................................... 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................. 53
PH L C ........................................................................................................................................ 59

iii


nh m c h nh v
H nh 1: ấu trú Ti-plasmid ............................................................................................................ 14
H nh 2 : Hệ thống ve tor li n hợp .................................................................................................... 15
H nh 3 : Hệ thống vector nhị thể (kép) ............................................................................................ 15
H nh 4: ấu trú T-DNA ................................................................................................................. 16
H nh 5 : S
ấu trú ve tor pSI hyg-2 ....................................................................................... 24
H nh 6 : S
quy tr nh huyển gen ............................................................................................... 27
H nh 7: Kh n ng ph h i- ti p nh n- t i sinh
giống ng ................................................. 32
H nh 8: T n số huyển gen gi ịnh................................................................................................. 33
H nh 9: M t số h nh nh
gi i o n huyển gen ......................................................................... 33
H nh 10: K t qu iện i N t ng số ............................................................................................ 36
H nh 11: K t qu ph n t h P R gen hpt th hệ T0 ......................................................................... 37
H nh 12: K t qu ph n t h P R gen ipt th hệ T0 .......................................................................... 37
H nh 13: K t qu ph n t h P R gen ipt th hệ T1 .......................................................................... 38
H nh 14: K t qu Southern lot
ng huyển gen ở th hệ T1 .................................................. 39
H nh 15:
nh gi kh n ng hịu h n ở gi i o n y on ở nh lưới số 1 r
yx l
h n .................................................................................................................................................... 40
H nh 16: K t qu
nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o hi u o th n l v
hi u i r

i nhất t i nh lưới số 1............................................................................................... 41
H nh 17: K t qu
nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng tư i t i nh
lưới số 1............................................................................................................................................ 41
H nh 18: K t qu
nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng kh t i nh
lưới số 1............................................................................................................................................ 41
H nh 19:
nh gi kh n ng hịu h n ở gi i o n y on ở nh lưới số 2 r
yx l
h n .................................................................................................................................................... 43
H nh 20: K t qu
nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o hi u o th n l v
hi u i r
i nhất t i nh lưới số 2.............................................................................................. 43
H nh 21: K t qu
nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v tr ng lượng tư i t i nh
lưới số 2............................................................................................................................................ 44
H nh 22: K t qu
nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng kh t i nh
lưới số 2............................................................................................................................................ 44
H nh 23: nh gi qu tr nh h gi
l H9 ............................................................................. 45
H nh 24: nh gi qu tr nh h gi
l M8............................................................................. 45

iv


nh m c ảng

ng 1: Ph n lo i thực v t ................................................................................................................. 3
ng 2: T nh h nh s n xuất ng tr n th giới những n m g n y ................................................... 5
ng 3: T nh h nh s n xuất ng ở Việt Nam những n m g n y .................................................. 10
ng 4: Th nh ph n inh ư ng trong 100g h t ............................................................................. 11
ng 5: Tr nh tự m i ........................................................................................................................ 29
ng 6: K t qu t ng hợp th nghiệm huyển gen chịu h n ............................................................ 32
ng 7: Số opy gen huyển ............................................................................................................ 39

v


nh m c c c ch vi t t t

WW

i u kiện tưới nướ

WS

i u kiện x l h n

SH

hi u

o th n l

LRL

hi u

ir

y

i nhất

FWS

Tr ng lượng tư i th n l

FWR

Tr ng lượng tư i r

DWS

Tr ng lượng kh th n l

DWR

Tr ng lượng kh r

IM

M i trường l y nhi m

CCM

M i trường

REM

M i trường nu i ph

h i

ECM

M i trường h n l

m s o

SeM

M i trường ph t sinh h i

RM

M i trường r r

vi

ng nu i ấy


M
y ng l
n m

y lư ng thực quan tr ng cho n n kinh t to n

y lư ng thự

h nh

sống on người ũng như
ược phẩm .Ở
lư ng thự

Đ U

a th giới. S n phẩm từ ng ngo i l thực phẩm nu i
ng v t r

thể ược ng d ng trong nhi u ng nh như

nước Trung Mỹ, N m Á v

h u Phi, người ta s d ng ng l m

h nh ho người với phư ng th c rất

qu n mỗi n i. Ng l

u, l m t trong

ng theo vùng ị l v t p

y lư ng thự giúp nhi u n i gi i quy t n n

i trong

Việt N m. S n phẩm từ ng ngo i l thực phẩm nu i sống on người ũng như
ng v t r

thể ược ng d ng trong ng nh kh

ng ngo i việc s d ng l m hất ốt

như ược phẩm. G n

y th n

n l nguy n liệu ti m n ng ể ch t o x ng

sinh h c.
S n lượng ng h ng n m ị gi m sút

ng kể bởi rất nhi u nh n tố sinh v t

(biotic) ũng như phi sinh (abiotic). Trong

h n h n l nguy n nh n phi sinh

quan tr ng nhất khi n s n lượng ng mất m t l n
với lượng nướ mư ph n ố kh ng
gi m

n h n 70%.

ất kh

ằn c ng

n 1,3 tấn/ha

u dẫn tới k t qu thu ho ch chỉ

ng kể so với ti m n ng thu ượ h n 10 tấn/ ha [64]. Ch nh sự kh

t ng tố qu tr nh lão h

l , suy gi m kh n ng qu ng hợp dẫn

ằn ã l

n gi m sút

s n lượng [84].
ytokinin

v i tr thi t y u

n nhi u qu tr nh t ng trưởng v ph t triển

c a thực v t ặc biệt trong sự ph n hi t
o in vitro, ytokinin

t

h

o [68]. Trong

v i tr rõ r ng trong việ giúp m l t h rời ch m tho i

iệp l c tố. Ngay c trong thực ti n th việc x l

thư ng m i rất lớn v
ho h v kéo

Trong khi những phư ng ph p

nh t

nhất ịnh trong việc t o ra những giống
ã ướ

v o việc t o

nghĩ

a rau sau thu

y [45].

truy n thống ã

những th nh

ng

y hịu h n, th việc b sung v kỹ thu t

y huyển gen th h ng ược với h n h n ũng

u ch ng minh ược k t qu c

n p gen ipt- mã h

ytokinin ũng m ng

ytokinin giúp uy tr sự xanh tư i l u h n

i tu i th c a hoa sau khi cắt khỏi

ng nghệ sinh h

ng nghệ nu i ấy m

m nh.

ã

những nghi n

enzyme isopentenyl tr nsfer se li n qu n

1

u v bi n

n sinh t ng hợp


cytokinin isopentenyl adenine, ze tin v

ihy roze tin v o m t số

trường hợp như: lú - Oryza sativa [41], súp l - Brassica oleracea

qu cho thấy

[72] v x l h- Lactuca sativa L. cv Evola [65], thuố l [84],
v ng [85]

u

t những th nh

ng nhất ịnh. Nhằm ướ

kh n ng hịu h n, húng t i ti n h nh
mang gen isopentenyl transferase (ipt)
huẩn Agrobacterium tumefaciens” với m
 Bi n n p th nh
 Kiểm tra sự


ướ

y tr ng. K t

u

u t o ra giống ng

t i “Nghiên cứu tạo c c dòng ngô
ằng ph

ng ph p

i n nạp nh

ti u:

ng gen ipt v o m t số

ng ng

h nl c

mặt c a gen ipt bằng kỹ thu t sinh h
nh gi kh n ng hịu h n ở

2

ng [58], l c[78]

ph n t

y on th hệ T1

vi


Ch

ng

–T NG QUAN

1.1 Nguồn gốc cây ngô
Ng hay bắp

t n kho h

ngu n từ ti ng T y

l Zea mays L. Trong ti ng Anh từ “m ize” ắt

n Nh (m z) (“M ize”- Oxford English Dictionary online

edition). Từ “ orn” thường hay s d ng hiện n y l
orn”

nghĩ l “ y lư ng thực c

người

h g i rút g n c

“In i n

nh i ng” (“M ize”-Oxford English

Dictionary online edition.).
ảng 1: Phân oại thực vật
Giới (kingdom):

Plantae

(kh ng ph n h ng):

Angiosperms

(kh ng ph n h ng):

Monocots

(kh ng ph n h ng):

Commelinids

B (order):

Poales

H (family):

Poaceae

Chi (genus):

Zea

Lo i (species):

Z. mays

nhi u gi thuy t ượ
ịnh: 1.Sự thu n h
h

v

ư r v ngu n gốc c

ng trong

trực ti p từ cỏ teosinte 2.Ngu n gốc từ

y l i giữ ng thu n

ỏ teosinte 3.Tr i qua hai hay nhi u qu tr nh thu n h

d i v teosinte 4.Ti n h
102]. Những nghi n

uv

từ

y l i c a Z. diploperennis thu
i truy n h

g n

n i l n 4 nh n
a c ng ho ng

lo i Trips um [73,

y ho rằng qu tr nh thu n h

i n r v o kho ng n m 7000 T N t i mi n trung Mexi o v t ti n
ỏ teosinte ho ng
s ng
nghi n

i g n giống nhất với ng ng y n y vẫn

nm

ng

n l lo i
trong lưu vự

ls s [36]. George Beadle v o n m 1939 ã hi sẻ qu n iểm n y trong

uc

m nh v ngu n gố

y ng [27]. Trướ

v o n m 1926 Vavilop

ũng ã h ng minh mi n trung n m Mehi o l trung t m ph t sinh th nhất v

3


Luận văn đầy đủ ở file: Luận văn full