Nghiên cứu và khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÀN THỊ NGÂN
Tên đề tài:
“ NGHIÊN CỨU VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN TK1178 MÃ HÓA CHO ENZYME
AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT
Thermococcus kodakarensis KOD1”.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khóa học

: Chính quy
: Công nghệ Sinh học
: CNSH- CNTP
: 2012- 2016

Thái Nguyên- Năm 2016


TRƢỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÀN THỊ NGÂN
Tên đề tài:
“ NGHIÊN CỨU VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN TK1178 MÃ HÓA CHO ENZYME
AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT
Thermococcus kodakarensis KOD1”.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo
: Chính quy
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Khoa
: CNSH- CNTP
Khóa học
: 2012- 2016
Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Phạm Bằng Phƣơng

Thái Nguyên- Năm 2016


i
LỜI CẢM ƠN
Được sự nhất trí của Ban Giám hiệu Nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp
em đã thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu và khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho
enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis
KOD1”.
Qua sáu tháng thực tập tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử, Bộ môn Công
nghệ sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại
học Nông lâm Thái Nguyên em đã thu được những kết quả thiết thực phục vụ cho
việc hoàn thành đề tài tốt nghiệp. Để đạt được kết quả đó em xin chân thành cảm ơn
chị Ma Thị Hoàn đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình
thực tập tốt nghiêp.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Bằng Phƣơng, bộ môn
Công nghệ Sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường
Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian

thực hiện đề tài.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ,giúp
đỡ và động viên em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Do thời gian thực
hiện đề tài có hạn nên không thể tránh khỏi sai sót, em rất mong nhận được sự đóng
góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, ngày tháng

năm 2016

Sinh viên thực hiện

Bàn Thị Ngân


ii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 : Danh mục các thiết bị ..............................................................................18
Bảng 3.2 : Thành phần môi trường nuôi cấy Thermococcus kodakarensis KOD1 .19
Bảng 3.3: Một số thành phần khoáng sử dụng trong nuôi cấy..................................21
Bảng 3.4: Thành phần một số vitamin sử dụng trong quá trình nuôi cấy .................22
Bảng 3.5: Thành phần phản ứng PCR .......................................................................28


iii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 ...........................4
Hình 2.2 : Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus ............................................5

Hình 2.3: Sơ đồ giải trình tự gen của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 8
Hình 2.4: Cấu tạo hóa học của aminopeptidase ........................................................12
Hình 2.5 : Kiểm tra và so sánh trình tự protein của gen Tk 1178 với một số trình tự
khác trong ngân hàng dữ liệu NCBI .........................................................................14
Hình 3.1 : Màu sắc môi trường thay đổi khi bổ sung thêm lưu huỳnh .....................20
Hình 3.2 : Môi trường nuôi cấy Thermococcus kodakarensis KOD1 sau khi đã bổ
sung lưu huỳnh và hấp khử trùng dưới dòng ni tơ trong 5 giờ .................................20

Hình 3.3 : Trình tự gen tk1178 trên trang NCBI ........................................... 25
Hình 3.4 : Bản đồ enzyme cắt giới hạn gen Tk1178...................................... 26
Hình 3.5 : Kết quả kiểm tra trình tự đoạn mồi dựa trên chương trình Tm
Calculator ....................................................................................................... 27
Hình 3.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen Tk 1178 ...........29
Hình 4.1: Kết quả điện di kiểm tra DNA genome ....................................................32
Hình 4.2 : Kết quả so sánh trình tự protein của gen TK1178 với một số gen thuộc
giới Achaea ...............................................................................................................33
Hình 4.3: Kết quả khuếch đại đoạn gen Tk1178 dưới điều kiện nhiệt độ tối ưu ......34
Hình 4.4: Mức nhiệt độ tương ứng với thứ tự các giếng ..........................................35
Hình 4.5 : Kết quả điện điện di sản phẩm PCR đoạn gen Tk1178 dưới các mức nhiệt
độ khác nhau .............................................................................................................35


iv
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

Ý nghĩa từ, cụm từ viết tắt

Các từ, cụm từ viết tắt
Dal

Dalton

DNA

Deoxyribonucleic acide

dNTPs

Deoxynucleotide trytophate

Bp

Base pair

Kb

Kilobase

PCR

Polymerase chain reaction

EDTA

Etilenduamin tetraacetic acide

TE

Tris- EDTA

TK

Thermococcus kodakarensis

IPTG

Isopropyl- β- D- Thiogalactopyranosidase

SDS

Sodium dodecyl sulfate

NCBI

National center for biotechnology infor
mation

TAE

Tris- acetate- EDTA


v
MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1: MỞ ĐẦU....................................................................................................1
1.1.Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2.Mục tiêu và yêu cầu của đề tài .................................................................................2
1.3.Ý nghĩa của đề tài....................................................................................................2
1.3.1 Ý nghĩa khoa học ...............................................................................................2

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................3
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................4
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 ...............................4
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại.....................................................................................4
2.1.1.1. Nguồn gốc ......................................................................................................4
2.1.1.2. Phân loại ........................................................................................................5
2.1.2. Đặc điểm chung cho sự phát triển và tồn tại .....................................................6
2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy.............................................................................................9
2.2. Đặc điểm của enzyme aminopeptidase do gen Tk1178 tổng hợp .....................10
2.2.1.Khái niệm enzyme, proteae, ý nghĩa và ứng dụng ...........................................10
2.2.1.1..Enzyme .........................................................................................................10
2.2.1.2. Khái niệm, phân loại và đặc tính ứng dụng của protease ............................11
2.2.1.3. Ý nghĩa và ứng dụng ....................................................................................12
2.2.2. Protease của Tk1178 .......................................................................................13
PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..16
3.1.Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................16
3.2.Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................16
3.2.1.Nội dung 1: Nghiên cứu tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn Thermococcus
kodakarensis KOD1 ..................................................................................................16
3.2.2. Nội dung 2: So sánh trình tự protein của gen Tk1178 với một số trình tự
protein khác trong cùng họ. .......................................................................................16


vi
3.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu và khuếch đại đoạn gen Tk1178 mã hóa cho enzyme
aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 ...........16
3.2.4. Nội dung 4: Kiểm tra sự ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ đến sự khuếch đại
đoạn gen Tk 1178 ......................................................................................................16
3.3.1.Hóa chất ...........................................................................................................16
3.3.2.Thiết bị, dụng cụ ..............................................................................................16

3.4.Phương pháp........................................................................................................17
3.4.1.Phương pháp nuôi cấy ......................................................................................17
3.4.2.Phương pháp tách chiết DNA genome .............................................................21
3.4.3.Phương pháp điện di ........................................................................................22
3.4.4. Phương pháp PCR ...........................................................................................23
3.4.4.1.Thiết kế mồi cho gen Tk1178 .......................................................................23
3.4.4.2.Tiến hành PCR ..............................................................................................27
PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.....................................29
4.1.Kết quả tách chiết DNA genmome của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis
KOD1 ........................................................................................................................29
4.2.Kết quả so sánh trình tự protein của Tk1178 với một số protein của gen khác
trong giới Archaea ....................................................................................................30
4.3.Kết quả khuếch đại đoạn gen Tk1178 bằng kỹ thuật PCR .................................33
4.4.Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự khuếch đại gen Tk1178 ..........34
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................36
5.1.Kết luận ...............................................................................................................36
5.2.Kiến nghị .............................................................................................................36

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 38


1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1.Đặt vấn đề
Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 là một chủng vi khuẩn thuộc giới
vi khuẩn cố Archea đươc các nhà khoa học phân lập từ miệng núi lửa gần bờ biển
thuộc đảo Kodakara của Nhật Bản, có khả năng sống trong điều kiện nhiêt độ từ 60100 0C ( tối ưu ở 85 0C ) và khả năng sống trong dải pH rộng ( từ 5- 9, tối ưu ở 5,5 )
[7]. Theo cây phân loại ( Hình 2.2 ) trình tự 16s rRNA quết định sự phân loại khác nhau
của các loài theo bộ Thermococcales, các nghiên cứu cho thấy KOD1 có trình tự 16s RNA

do đó nó là một thành viên của chi Thermococcus, các nghiên cứu về trình tự 16S DNA
ribosome dẫn đến các khả năng phân loại khác nhau bao gồm Thermococcus peptonophilus
và Thermococcus , kết quả lai DNA- DNA và sự khác biệt trong đặc tính phát triển với
việc sử dụng chất nền để phân lập chủng KOD1 từ T. peptonophilus và T. stetteri ở mức độ
loài chỉ ra rằng trình tự KOD1 đại diện cho một loài mới của Thermococcus, mà chúng ta
biết đến như Thermococcus kodakaraensis KOD1 sp [10].
Hệ gen của KOD1 có trên hai nghìn đoạn gen khác nhau ( 2434 gen ) trong đó có
đoạn gen Tk1178 có khả năng mã hóa cho enzyme aminopeptidase, được các nhà khoa học
trường đại học Khoa Hóa tổng hợp và sinh học Hóa học, Trường Đại Học Kỹ thuật, Đại học
Kyoto, Katsura, Nishikyo-ku, Kyoto, Nhật Bản và Cục Chất liệu và Khoa học đời sống,
trường Kỹ thuật, Đại học Osaka, Yamadaoka, Suita, Osaka, Nhật Bản công bố cụ thể trên
trang NCBI [7]. Aminopepdidase là enzyme xúc tác sự phân cắt của các axit amin từ các
amino của các protein hay peptide. Chúng có mặt cả ở động vật và thực vật và được tìm
thấy trong nhiều bào quan dưới tế bào, trong bào tương, và là thành phần của màng tế bào.
Một số aminopeptidases là monome, khối lượng tương đối cao (50 kDa) giúp tiêu hóa
enzyme của protein do đó đóng vai trò vô cùng quan trọng do khả năng bền với nhiệt độ
cao khó bị biến tính trong khi các enzyme khác lại biến tính rất nhanh khi thay đổi nhiệt độ
lên mức cao, dễ tham gia phản ứng do đó nó được ứng dụng nhiều trong công nghiệp và các
lĩnh vực nghiên cứu khoa học [6].


2
Chính vì những ứng dụng quan trọng của enzyme nên ngày càng có nhiều công trình
nghiên cứu về enzyme và khả năng tổng hợp enzyme từ sinh vật ( động vật, thực vật và cả
vi sinh vật ) [4]. Đoạn gen Tk 1178 của vi khuẩn Thermococcus korakadensis KOD1 (T.
korakadensis ) có khả năng mã hóa enzyme aminopeptidase, ứng dụng nhiều trong công
nghiệp và sản xuất thực phẩm ( sản xuất bột giặt, các loại bánh mỳ…), y học…Trong suốt
quá trình thực tập tốt nghiệp tai phòng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc khoa Công nghệ
Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, dưới sự hướng
dẫn của TS. Phạm Bằng Phƣơng, tôi đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu và khuếch đại

gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus
kodakarensis KOD1” với mục tiêu chính là có thể khuếch đại được đoạn gen này và tìm ra
nhiệt độ tối ưu cho phản ứng khuếch đại- phản ứng PCR, phục vụ cho các nghiên cứu tạo
dòng, tinh sạch và kiểm tra hoạt tính của enzyme do gen Tk1178 mã hóa.

1.2.Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
- Mục tiêu :
+ Nghiên cứu được những đặc điểm của protein của gen Tk1178.
+ Khuếch đại được đoạn gen TK1178 từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus
kodakarensis KOD1.

-Yêu cầu :
+ Nghiên cứu, nắm bắt đặc điểm của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1
và của gen TK1178.
+ Khuếch đại đoạn gen TK1178 bằng kỹ thuật PCR.
+ So sánh được trình tự của TK1178 với trình tự một số gen trong cùng nhóm.

1.3.Ý nghĩa của đề tài
1.3.1 Ý nghĩa khoa học
- Nghiên cứu khuếch đại thành công gen TK1178 mã hóa cho enzyme
aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 thuận lợi cho
việc nghiên cứu tạo dòng gen sau này.
- Cung cấp tài liệu cho các nghiên cứu của sinh viên về nghiên cứu khuếch
đại các đoạn gen tương tự hoặc nghiên cứu mở rộng ra việc tạo dòng gen.


Khóa luận đầy đủ ở file: Khóa luận full