Phân tách bằng các phương pháp sắc ký và nghiên cứu một số tính chất của ribonuclease từ nọc rắn hổ mang

Bộ giáo dục và đào
tạo Trờng đại học s
phạm hà nội 2

Nguyễn huy trí

Phân tách bằng các phơng pháp
sắc ký và nghiên cứu một số tính
chất của ribonuclease từ nọc rắn
hổ mang

Chuyên ngành: Sinh học thực
nghiệm Mã số: 60 42 30

Luận văn thạc sĩ sinh học

Ngời hớng dẫn khoa học: NCVC. TS NGUYễN VĂN
THIếT

Hà nội, 2010
1


MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Ribonuclease (RNase) là một trong những nhóm enzyme được quan tâm
nghiên cứu nhiều. Đây là nhóm enzyme có phân bố rộng rãi, đóng vai trò quan
trọng trong quá trình trao đổi chất của các acid nucleic, thực hiện chức năng tiêu
hóa và tham gia vào phản ứng miễn dịch của cơ thể.
Đặc biệt là trong những thập kỷ gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện
nhiều tính chất (hay hoạt tính) sinh học mới quan trọng của các enzyme thuộc siêu

họ RNase A (đây là nhóm RNase ngoại tiết ở các động vật có xương sống từ lưỡng
cư đến lớp thú), trong đó có hoạt tính gây độc tế bào (hay hoạt tính cytotoxin),các
hoạt tính kháng khuẩn và kháng virus và một số hoạt tính khác. Ví dụ như: RNase
từ một số loài ếch (ếch đồng Nhật Bản Rana japonica, ếch bò Rana catesbeiana và
ếch báo phương bắc Rana pipens) đều có hoạt tính chống ung thư, đặc biệt là RNase
từ loài ếch báo phương bắc tác động rất đặc hiệu lên tế bào u mà không ảnh hưởng
lên tế bào bình thường, do đó enzyme này được gọi là onconase (enzyme đặc hiệu
với các tế bào ung thư). Ngoài ra enzyme này còn có hoạt tính chống HIV-1 cao.
Các enzyme thuộc nhóm RNase ngoại tiết khác nhau như RNase từ tinh dịch bò và
nhiều RNase ngoại tiết ở người (các enzyme này tạo thành siêu họ RNase A ở
người) cũng có hoạt tính chống virus và chúng là một bộ phận cấu thành trong hệ
thống chống virus ở người như 2 enzyme RNase 2 và RNase 3 do các bạch cầu ưa
eosin (bạch cầu ưa acid) tiết ra.
Những năm gần đây ngoài việc tìm ra một số RNase nguồn gốc tự nhiên có
đặc điểm như onconase & BS-RNase, các nhà khoa học còn nghiên cứu tạo ra các
chế phẩm RNase nhân tạo có hoạt tính chống ung thư, nhờ vận dụng các phương
pháp sinh học phân tử và công nghệ gen. Dạng biến thể của RNase được tạo ra bằng
cách thay thế một hoặc một vài gốc amino acid cần cho tương tác với protein ức chế
(RI) hoặc tạo thêm liên kết disunfide làm tăng độ bền vững cấu trúc và giảm bớt sự
nhạy cảm với protein trong tế bào. Các nghiên cứu này đã mở ra một hướng nghiên


cứu mới trong lĩnh vực hóa dược nhằm sản xuất ra những chế phẩm dược cao cấp
trên cơ sở RNase để phòng chống ung thư.
Nọc rắn là nguồn dược liệu cổ truyền quý, không phải ngẫu nhiên mà biểu
tượng của toàn ngành Y trên thế giới là hình ảnh con rắn đang nhả nọc.
Nọc rắn xử lý hết độc có tác dụng:
- Chống đông, chống hình thành huyết khối, giảm fibrinogen, độ dính của
máu, độ ngưng kết của tiểu cầu.
- Có tác dụng giảm đau rõ rệt: Nọc độc rắn với liều 0,188 mg/kg có tác dụng

giảm đau 3 - 4 lần morphin với liều 1mg/kg mà không gây nghiện. Có thể trị các
loại đau thần kinh, ung thư.
- Có tác dụng chống ung thư.
(Theo kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại).
Đáng chú ý là những chất mới được phát hiện trong nọc rắn, nuôi dưỡng sự
hình thành các tế bào thần kinh mới có ý nghĩa với các bệnh nhân mắc bệnh
Alzheimer và những bệnh khác mà tế bào thần kinh trong não chết đi.
Để góp phần tìm hiểu thêm về các RNase tự nhiên có khả năng có hoạt tính
cytotoxin trong nguồn tài nguyên đa dạng và phong phú của Việt Nam. Chúng tôi
chọn đề tài nghiên cứu RNase từ nọc rắn nhằm tìm hiểu tính chất của enzyme này.
Luận văn của tôi có tiêu đề: “Phân tách bằng các phương pháp sắc kí và
nghiên cứu một số tính chất của ribonuclease từ nọc rắn hổ mang”.
2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
- Đánh giá khả năng tách chiết và làm sạch enzyme RNase bằng các phương
pháp sắc kí.
- Nghiên cứu một số tính chất cơ bản của enzyme.
3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- Đối tượng: RNase từ nọc rắn hổ mang.
- Phạm vi nghiên cứu: Sử dụng các phương pháp sắc kí để phân tách và làm
sạch enzyme RNase từ nọc rắn hổ mang, và nghiên cứu một số tính chất của
enzyme này.


4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thực nghiệm và áp dụng các biện pháp phân tách hiện đại (bằng máy sắc kí)
và các phương pháp nghiên cứu động học xúc tác enzyme.
5. GIẢ THIẾT KHOA HỌC
- RNase có một ý nghĩa hết sức to lớn đối với nhiều loại bệnh trong Y học.
Ngoài chức năng tiêu hóa và tham gia (trực tiếp hay gián tiếp) các hoạt động sao
mã, phiên mã, sinh tổng hợp protein, các RNase còn thực hiện nhiều vai trò trong

phòng chống virus, vi khuẩn, kháng giun…
Nồng độ và hoạt tính của RNase trong dịch bào và các dịch thể có liên quan
đến trạng thái bệnh lý của nhiều loại bệnh khác nhau: Nồng độ enzyme tăng là kết
quả của phản ứng cơ thể chống lại bệnh tật (ví dụ: Bệnh tăng bạch cầu tủy mãn tính,
hội chứng mệt mỏi kinh niên đã phát hiện thấy lượng RNase tăng lên trong các tế
bào ngoại vi).
- Trong tương lai nhiều dạng RNase vẫn sẽ được nghiên cứu để tạo ra các
loại thuốc tác động hiệu quả lên khối u. Nhiều bệnh hiểm nghèo được phòng chống
và chữa trị hiệu quả.


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ NHÓM RNASE
1.1. Lịch sử nghiên cứu
RNase (RNase) bắt đầu được nghiên cứu từ năm 1920 khi Walter Jones phát
hiện ra một chất tác từ tuyến tụy có khả năng thủy phân acid nucleic của nấm men,
mặc dù vào thời điểm này cấu trúc hóa học của acid nucleic nói chung và acid
ribonucleic (ARN) nói riêng còn chưa được biết đến. Sau đó Dubos và Thompson
khi tinh sạch ARN cũng phát hiện ra chất này và đặt tên là RNase vì chúng tham gia
vào quá trình depolymer hóa ARN. Tới năm 1940, Kunitz đã kết tinh được RNase,
tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu sau này. Vào đầu những năm 1950, ba
nhà khoa học Salganik (Liên Xô), Bernet (Úc), Leclerk (Bỉ) đã tiến hành những thử
nghiệm đầu tiên về khả năng chữa bệnh virus bằng nuclease nói chung và RNase
nói riêng [6461]. Kết quả bước đầu cho thấy các enzyme này có khả năng kìm hãm
sự phát triển của một số loại virus gây bệnh như ospovaxin, herpes, adenovirus
(chứa ADN) hay virus viêm não, viêm tủy, virus cúm (chứa ARN). Năm 1958, Sie
Kevitz Palade đã xác định nơi khư trú của enzyme này là tuyến tụy nhờ kỹ thuật
kháng thể huỳnh quang.
Những năm 1960-1970 nhờ ưu thế về nguồn vật liệu, khả năng tinh chế cũng

như kích thước phân tử nhỏ (~ 14kDa), RNase tuyến tụy bò (RNase A, EC 3.1.27.5)
trở thành mô hình mẫu trong các nghiên cứu về enzyme nói riêng và nghiên cứu về
protein nói chung. RNase A là enzyme đầu tiên được xác định trình tự amino acid
và là enzyme thứ 3 được xác định cấu trúc 3D (sau lysozyme và carboxy-peptidase
A). Vào năm 1972 giải thưởng Nobel hóa học đã được trao cho Stanford Moor,
William Stein và Christian Anfinsen với những công trình nghiên cứu của họ về
RNase. Năm 1984 Bruce Merifield đã vinh dự nhận giải thưởng cao quý này với
công trình nghiên cứu cũng liên quan đến RNase A [50, 51, 52]. Từ những năm
cuối thập kỷ 80 tới nay, nhiều nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu theo hướng ứng


dụng của RNase đã được tiến hành song song và liên quan chặt chẽ với nhau, đặc
biệt là những nghiên cứu về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng sinh học của
các RNase. Kết quả các nghiên cứu này đã mở ra triển vọng cho nghiên cứu nhằm
sản xuất ra các dược phẩm mới trên cơ sở RNase có khả năng chữa trị các bệnh
hiểm nghèo như ung thư và các bệnh do virus [13, 18, 28, 40, 41, 50].
1.2. Tính đặc hiệu cơ chất và cơ sở phân loại RNase
Tính đặc hiệu cơ chất là điểm khác biệt chủ yếu giữa enzyme với các chất
xúc tác khác cũng như giữa enzyme này với enzyme khác. Nhóm nuclease tham gia
trực tiếp vào quá trình trao đổi chất của acid nucleic. Chúng được đặc trưng bởi tính
đặc hiệu cơ chất rộng và che phủ (chồng chéo) nhau.
Việc phân loại các nuclease rất khó khăn và không thống nhất. Ngoài các
phản ứng thủy phân, các enzyme thuộc nhóm này còn tham gia xúc tác các phản
ứng chuyển nhóm: RNase tụy tạo thành 2’,3’-monophosphate vòng nhờ phản ứng
chuyển vị nhanh hơn khoảng 1000 lần so với phản ứng thủy phân ở giai đoạn sau
của phản ứng tạo thành 3’-monophosphate [26].
Trong hệ thống phân loại enzyme năm 1964, enzyme này cũng được xếp vào
nhóm transferase (EC 2.7.7.16 và EC 2.7.7.17). Việc phân loại này không hợp lí vì
deoxyRNase (DNase) có cùng chức năng sinh học với RNase là thủy phân acid
nucleic lại được xếp vào nhóm hydrolase (EC 3.1.4.6) [25].

Những nghiên cứu tiếp theo chỉ ra rằng sự khác biệt này chỉ là tương đối, tùy
thuộc vào từng enzyme cụ thể. Ví dụ ở một số vi khuẩn tốc độ chuyển nhóm và
thủy phân của RNase là tương đương nhau nên các chất trung gian (nucleotide
vòng) không được tích lũy trong quá trình phản ứng. Để đặc trưng cho tính đặc hiệu
của một enzyme bất kỳ thuộc nhóm nuclease, Laskovski đã đưa ra các dấu hiệu
(tương đối không phụ thuộc) khác nhau [20, 23, 24].
1. Theo tính đặc hiệu của gốc đường cấu trúc nên nucleotide, nuclease được
phân chia thành hai nhóm lớn: RNase và DNase.
2. Theo vị trí liên kết bị thủy phân, nuclease được phân chia thành
exonuclease và endonuclease.


3. Theo sản phẩm thủy phân: Liên kết phosphodiester bị thủy phân từ phía
nào của phân tử ARN, tạo thành sản phẩm 5’-phosphate hay 3’-phosphate. Một số
exonuclease chỉ tác động vào phân tử polynucleotide từ phía đầu 3’, số khác lại chỉ
tác động vào phía đầu 5’.
4. Theo tính đặc hiệu với bazơ trong đơn vị nucleotide liền kề với nucleotide
bị thủy phân: Tính đặc hiệu này của nhiều enzyme là không đáng kể. Chẳng hạn các
RNase thực vật và Escherichia coli (EC 3.1.27.1) thủy phân các liên kết theo vị trí
3’ của cả purine và pyrimidine nucleotide; RNase tuyến tụy (EC 3.1.27.5) chiếm vị
trí trung gian: Thủy phân các liên kết theo vị trí 3’ của pyrimidine nucleotide bất kỳ.
Trong khi đó, enzyme mã số EC 3.1.27.3 là endonuclease đích thực, thủy phân
ARN ở vị trí 3’ của gốc Guanine nucleotide.
5. Tính đặc hiệu cấu trúc: mạch đơn hay mạch kép (đa số các nuclease thể
hiện độ đặc hiệu cao theo dấu hiệu này).
6. Tính đặc hiệu trình tự nucleotide…
Một số dấu hiệu trên được tính đến trong hệ thống phân loại enzyme vào
năm 1978. Trong hệ thống phân loại mới này, 14 phân nhóm nuclease được đưa vào
để phân loại nuclease tốt hơn. Chắc chắn trong thời gian tới hệ thống phân loại
nuclease nói chung và RNase nói riêng còn thay đổi khi cấu trúc và chức năng của

nhiều enzyme được phát hiện thêm [20]. Tuy vậy, trong mọi trường hợp một RNase
(hay nuclease) bất kỳ mà ta quan tâm luôn nằm trong sơ đồ chung phân loại
nuclease như sau:
- Phân loại nuclease dựa trên tính đặc hiệu cơ chất, phân biệt:
+ DNase (thủy phân ADN).
+ RNase (thủy phân ARN).
+ Nuclease hỗn tạp hay không đặc hiệu (theo gốc) đường thủy phân cả
ADN và ARN.
- Phân loại nuclease dựa trên vị trí liên kết bị thủy phân, phân biệt:
+ Endonuclease.
+ Exonuclease


. 3’-exonuclease.
. 5’-exonuclease.
1.3. Cơ chế xúc tác của RNase
Phản ứng hóa học mà RNase xúc tác là phản ứng thủy phân liên kết
phosphodiester trong phân tử acid nucleic. Quá trình thủy phân ARN do RNase xúc
tác xảy ra qua 2 giai đoạn theo cơ chế xúc tác kiềm - acid chung với sự tham gia của
2 gốc His-12 và His-119 [20, 26, 37, 47, 51, 52].
- Giai đoạn 1: Phân cắt chuỗi polymer tạo ra sản phẩm trung gian là
phosphate vòng mà không giải phóng nhóm acid. Trong giai đoạn này, His-12 đóng
+

vai trò là chất xúc tác kiềm chung (nhận proton H ở vị trí 2’) His-119 đóng vai trò
là acid chung (proton hóa nhóm đi khỏi RNA-O-) diễn ra khá nhanh.
- Giai đoạn 2: Giải phóng nhóm acid thứ hai thuộc gốc phosphate trong quá
trình thủy phân dẫn xuất phosphate vòng. Giai đoạn này diễn ra chậm hơn trong đó
vai trò của hai gốc His-12 và His-119 lại ngược lại. His-119 tương tác với H2O theo
cơ chế xúc tác kiềm chung (nhận proton) còn His-12 đảm nhận việc proton hóa

nhóm đi khỏi (sản phẩm) ở vị trí C-2’.
2. CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA RNASE
RNase A là một enzyme có khối lượng phân tử nhỏ (~ 14 kDa) được cấu tạo
từ một mạch polypeptide từ 124 gốc amino acid, trong thành phần amino acid của
nó có 19 trong tổng số 20 loại amino acid có trong protein (không có amino acid
Trytophan). Công thức phân tử ở dạng không tích điện của RNase A là
C575H907N171O192S12 với khối lượng phân tử chính xác Mr = 13686 Da [50, 51, 52].
Về hình dạng, RNase A giống như quả thận, các gốc amino acid của trung
tâm hoạt động nằm trong vùng “hốc” (cleff) - là vùng lõm của quả thận [51]. Cấu
trúc bậc hai điển hình của RNase A gồm 4 phiến cấu trúc  nằm song song ngược
chiều kề bên cạnh 3 chuỗi xoắn  ngắn. Trong phân tử có 4 cầu nối disulfide được
tạo thành từ 8 gốc Cysteine ở các vị trí 26-84, 40-95, 58-110 và 65-72. Các cầu nối
này có thể bị phá vỡ bởi lượng -mercaptoethanol dư thừa, tạo thành 8 nhóm SH tự
do dẫn tới sự biến tính và làm mất hoạt tính của enzyme [26, 51].


Hầu hết các RNase thuộc siêu họ RNase A đều có cấu trúc monomer, duy chỉ
có RNase trong tinh dịch bò (BS-RNase) có cấu trúc bậc 4 (dimer) [15, 17]. BSRNase được tách ra ở dạng dimer trong đó hai tiểu đơn vị thành phần nối với nhau
bởi hai cầu disunfide [1917]. Enzyme này là một đồng đẳng của RNase A, ở trạng
thái cân bằng một hỗn hợp gồm 2 cấu trúc bậc IV hoàn toàn khác nhau [36].
Trung tâm hoạt động của RNase A ngoài hai nhóm chức tham gia trực tiếp
vào quá trình xúc tác là nhóm imidazol của các gốc His-12 và His-119 (trong đó
một nhóm đóng vai trò như một acid, một nhóm đóng vai trò như một bazơ trong
quá trình xúc tác) còn có mạch bên của các gốc Lys-7, Lys-41, Lys-66, Asp-121 và
mạch carbon chính của gốc Phe và Gly-11 [13, 20, 28].
3. TÍNH ĐA HÌNH PHÂN TỬ CỦA RNASE TRONG TẾ BÀO
Nhiều công trình nghiên cứu về RNase tiến hành ở trên các nhóm sinh vật từ
dạng có cấu tạo đơn giản như vi khuẩn đến các sinh vật bậc cao như con người đã
cho thấy sự muôn hình muôn vẻ của các enzyme thuộc nhóm này. Trong một cá thể
có tồn tại nhiều dạng RNase khác nhau, ví dụ ở vi khuẩn E.coli có tới 20 loại RNase

[46]; trong nọc rắn hổ mang Ấn Độ chứa 2 dạng RNase liên hợp-phân li (phụ thuộc
vào nồng độ NaCl) [42]; các kết quả nghiên cứu ban đầu ở Việt Nam cho thấy cũng
tồn tại ít nhất 2 dạng RNase khác nhau trong nọc rắn hổ mang Việt Nam [5, 7].
Ở người, tới nay đã phát hiện được 8 enzyme khác nhau thuộc siêu họ RNase
A. Chúng được đánh số từ 1 đến 8 để phân loại dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và
chức năng sinh học. Các gen mã hóa cho các protein này liên kết với nhau trên cánh
tay dài của nhiễm sắc thể số 14 [61]. Dưới đây là những đặc điểm chính của nhóm
RNase ở người thuộc siêu họ RNase A.
3.1. RNase 1
RNase này có nhiều ở các cơ quan khác nhau trong cơ thể nhưng có nhiều
nhất ở tuyến tụy. Trình tự amino acid tương đồng tới 70% so với RNase A. Chức
năng chính của RNase 1 là tiêu hóa - thủy phân ARN trong thức ăn [55, 61].
3.2. RNase 2 (EDN - eosinophil derived neurotoxin)


RNase 2 đầu tiên được phát hiện là một độc tố thần kinh có nguồn gốc từ các
tế bào bạch cầu ưa acid nên còn được gọi là EDN. Đây là 1 trong 2 protein của tế
bào lympho có hoạt tính ribonucleolytic. Một số gốc amino acid như: Gly-2, Lys66, Lys-7, Arg-10, Phe-120, Asp-14 bị thay đổi không bảo thủ đóng vai trò quan
trọng về chức năng; các gốc amino acid His-12, His-119, Lys-41 và nhiều gốc khác
được giữ lại tạo nên trung tâm hoạt động (TTHĐ) của phân tử enzyme [55, 61].
3.3. RNase 3 (ECP - eosinophil cationic protein)
Cũng giống như RNase 2, RNase 3 đầu tiên được phát hiện là protein mang
điện dương của tế bào bạch cầu ưa acid, điểm đẳng điện của protein này là pI = 10,8
(enzyme này là một protein rất kiềm) và tương đồng tới 70% với RNase 2. ECP là
RNase người đầu tiên có hoạt tính kháng khuẩn, kháng côn trùng và độc với tế bào
thần kinh. Hoạt tính nuclease của ECP thấp hơn nhiều so với RNase 2 nhưng các
đặc tính xúc tác bình thường thì gần như không đổi so với RNase 2. Tuy vậy hoạt
tính ribonucleolytic của ECP lại không cần thiết cho hoạt tính kháng khuẩn [22, 55,
61].
3.4. RNase 4

RNase 4 có trình tự amino acid tương đồng 43% với RNase 1, 31% với
RNase 2 và 30% với RNase 3. Enyme này cũng tương đồng với RNase gan bò và
gan lợn tới 90%, điều này chứng tỏ tính bảo thủ của RNase là rất lớn [55, 61].
3.5. RNase 5 (Angiogenin)
Angiogenin có trọng lượng phân tử là 14 400 Da và giống RNase A tới 65%
về trình tự amino acid, 3 trong 4 cầu disunfide và các gốc amino acid chức năng chủ
yếu trong TTHĐ của RNase vẫn được bảo tồn ỏ angiogenin. So với RNase 1, 2 và 4
thì trình tự amino acid của angiogenin tương đồng lần lượt là 35%, 27% và 39%.
Angiogenin có tính đặc hiệu yếu với cơ chất chuẩn của RNase nhưng bù lại, hoạt
tính ribonucleolytic của angiogienin lại rất quan trọng trong việc hình thành mạch
máu mới [61].
3.6. RNase 6 (RNase K6)

10


RNase 6 tồn tại chủ yếu ở thận và một ít ở các cơ quan khác như nhau thai,
tim, phổi. Gen mã hóa protein này dài 120 Kb và mARN tương ứng có trong các tế
bào bạch cầu trung tính và các bạch cầu đơn nhân máu ngoại vi. Trong các RNase
người thì RNase 6 gần với 2 protein của tế bào bạch cầu acid nhất [55, 61].
3.7. RNase 7
RNase 7 là enzyme kiềm tính hoạt động mạnh (pI = 10,1) có Mr là 14 546
Da, được tìm thấy trong các tế bào và mô biểu bì (đường tiêu hóa, đường sinh dục
và đường ruột). RNase biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh, tham gia vào hệ
miễn dịch không đặc hiệu, bảo vệ đường hô hấp… [30]
3.8. RNase 8
RNase 8 là enzyme cuối cùng trong siêu họ RNase ở người được biết đến
cho tới nay. Gen mã hóa cho RNase 8 liên kết với 7 gen mã hóa cho 7 RNase còn
lại trên nhiễm sắc thể số 14. Phân tử RNase có trình tự amino acid rất giống với
RNase 7 (tương đồng 78%) và khác nhiều với RNase 5 nhất (tương đồng 29%).

RNase 8 gồm 154 amino acid với đoạn peptide tín hiệu dài 27 amino acid; 8
gốc Cys, 1 gốc Lys và 2 gốc His nằm trong TTHĐ của enzyme. Phân tử mARN mã
hóa enzyme này có kích thước khoảng 1 Kb chỉ tìm thấy duy nhất ở nhau thai mà
không có ở một mô nào khác. Hoạt tính ribonucleolytic của RNase 8 thấp hơn hoạt
tính của các RNase 1 - 3, 6, và 7 phát hiện trước đó [53, 58].
Ngoài các RNase thuộc siêu họ RNase A ở người đã kể ở trên thì trong nhiều
tế bào, mô và các cơ quan khác của người còn có mặt nhiều enzyme thuộc các
nhóm lớn khác như: RNase H, RNase P, RNase L và một số protein có hoạt tính
ribonucleolytic như Lactoferrin, kháng thể (ABzyme) [61].
4. CHỨC NĂNG SINH HỌC CỦA RNASE
4.1. Tham gia vào quá trình sinh tổng hợp acid nucleic
Một chức năng rất quan trọng của RNase trong tế bào là tham gia trực tiếp
vào quá trình sinh tổng hợp ADN và ARN [41, 50, 61]. Trong số các enzyme đó
phải kể đến RNase H tách từ dòng tế bào ung thư K562 ở người có hoạt tính 3’- và


5’-exonuclease thủy phân ARN trong thành phần phân tử lai ADN-ARN tạo nên các
đoạn chứa 5’-P và 3’-OH. Có hai loại RNase H ở người:
- RNase H1: Mr = 89 kDa giữ vai trò loại bỏ các đoạn ARN mồi trong quá
trình sao chép ADN. Để hoạt hóa tốt RNase H1 cần có cation hóa trị 2, enzyme
pHopt = 8 - 8,5.
- RNase H2: Mr = 33 kDa tách từ nhau thai và tham gia vào quá trình sao mã
tổng hợp ARN. Hoạt động của RNase H2 trong vùng pHopt = 8,5 - 9 và cần ion
2+

Mg .
4.2. Chức năng tiêu hóa
Chức năng tiêu hóa là chức năng sinh lý rất quan trọng của RNase. Một
lượng lớn ARN có trong thức ăn bị phân hủy bởi RNase A hay RNase 1 (ở người).
Dưới tác dụng của RNase, mạch ARN bị phân giải từng bước thành các

oligonucleotide hoặc mononucleotide và phosphate vô cơ. Sau đó các dạng này
được chuyển hóa nhờ các enzyme tiêu hóa khác thành những sản phẩm dễ hấp thụ
[55, 61].
4.3. Tham gia vào quá trình chế biến và chín của ARN
Quá trình chế biến và chín của ARN là những quá trình sinh hóa phức tạp
với sự tham gia của nhiều loại RNase khác nhau. Một trong những RNase đó là
RNase P. Enzyme này có mặt ở cả các sinh vật thuộc nhóm đơn giản như vi khuẩn
cổ (Archaea), vi khuẩn (Bacteria) tới các loài nhân chuẩn (Eucaria). RNase P là một
enzyme có hai thành phần chính là ARN và protein gắn với nhau, trong đó tiểu đơn
vị protein chiếm khối lượng phân tử nhỏ còn tiểu đơn vị lớn ARN đóng vai trò là
trung tâm hoạt động và chiếm khối lượng chủ yếu trong thành phần enzyme. ARN
có cấu trúc bậc 2 và có biểu hiện hoạt tính ngay cả khi không có tiểu phần protein.
RNase P giữ vai trò thủy phân liên kết phosphodieste trên phân tử tiền chất
tARN (pre-tARN) tạo nên tARN hoạt động tham gia vào quá trình sinh tổng hợp
protein. Ngoài ra RNase P còn cắt mARN đặc hiệu trình tự bằng cách dùng các
trình tự định hướng để liên kết với cơ chất thông qua các liên kết cặp đôi base, sau
đó cắt rồi phân li sản phẩm [27, 61]


4.4. Vai trò trong các phản ứng miễn dịch của cơ thể
Phản ứng miễn dịch của cơ thể xảy ra để chống lại các yếu tố gây bệnh xâm
nhập vào cơ thể như các vi sinh vật (vi khuẩn, virus), độc tố vi sinh vật, các phân tử
lạ… Ngoài RNase L tham gia vào các phản ứng miễn dịch đặc hiệu của cơ thể
chống virus còn có RNase 7 và các RNase từ bạch cầu acid ECP và EDP thuộc siêu
họ RNase A của người cũng tham gia vào phản ứng miễn dịch của cơ thể [21, 22,
61]
RNase L là endonuclease được tế bào tổng hợp cảm ứng bởi interferon, tham
gia thủy phân cả ARN của virus và của tế bào tạo ra sản phẩm có đầu cuối 3’2+

phosphate và 5’-OH. Hoạt động của enzyme này cần phải có mặt các ion Mg hoặc

Mn

2+

và ATP. RNase L bị ức chế bởi protein đặc hiệu: RL-I (là protein ức chế việc

thực hiện cơ chế chống virus của interferon) [16, 34, 48]
4.5. Tham gia vào quá trình sinh sản
Ở nhiều loại cây ra hoa lưỡng tính có các cơ chế phá vỡ sự tự thụ phấn gọi là
sự tự kị (self-incopatubility-SI). SI cho phép nhụy nhận biết phấn của mình (có
quan hệ về mặt di truyền) và phấn lạ (sai khác di truyền) trong cùng một loài nhờ
vậy sẽ ức chế sự phát triển của phấn mình trong ống phấn chính mình nhưng lại cho
phép phấn lạ thụ tinh. Do đó, SI đã ngăn ngừa hiện tượng lại trực huyết và cho phép
lai chéo tạo nên sự đa dạng di truyền trong phạm vi loài. Một trong các cơ chế của
SI được thực hiện nhờ S-RNase - một RNase có tính đa hình phân tử rất cao ở nhiều
loài thực vật tương ứng [43, 47].
Ở động vật, BS-RNase tách từ tinh dịch bò cũng đóng vai trò đặc biệt về mặt
sinh sản. BS-RNase ức chế phản ứng miễn dịch của bò cái chống lại tinh trùng nên
tạo điều kiện cho quá trình thụ tinh xảy ra. Ngoài ra, protein này còn thể hiện hoạt
tính chống sinh tinh trùng [36].
4.6. Hoạt tính cytotoxin
Hoạt tính cytotoxin là một trong các hoạt tính sinh học quan trọng của RNase.
[41, 50] Trong số hơn 100 enzyme thuộc siêu họ RNase A được biết cho đến nay,
chỉ có BS-RNase (enzyme từ tinh dịch bò) [11, 14, 36, 49,] và các RNase từ 3


loài ếch: ếch báo phương bắc Rana pipiens [38, 50], ếch bò Rana catesbeiana [32,
50] và ếch đồng Nhật Bản Rana japonica [50] - là có hoạt tính cytotoxin. Cơ sở của
hoạt tính cytotoxin là khả năng thoát khỏi sự kiểm soát của protein ức chế RNase
(RI) trong bào tương [12, 28, 29, 44, 45], nhờ đó RNase dễ dàng phân cắt cơ chất

ARN đặc hiệu trong tế bào, giúp diệt hiệu quả khối u. Hai enzyme có hoạt tính
cytotoxin được nghiên cứu nhiều là onconase (ONC) và BS-RNase.
- Onconase kìm hãm sự phân chia tế b ào ở giai đoạn G1 bằng cách liên kết
với các vị trí đặc hiệu trên màng huyết tương của tế bào đích glioma (mô đậm thần
kinh). Sau đó ONC tiếp cận với ARN tế bào đích rồi phân giải ARN qua đó ngăn
cản quá trình tổng hợp protein làm cho tế bào bị tiêu diệt [35].
Hoạt tính cytotoxin của ONC có thể bị ức chế bởi NaNO3 và 2deoxyglucoze. Khả năng ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào của ONC đã
bị ankyl hóa giảm tới 100 lần tương ứng với hoạt tính ribonucletylic còn lại khoảng
2% so vói dạng ban đầu [56].
- BS-RNase là đồng đẳng với RNase A được tách từ tinh dịch bò có hoạt tính
độc với các động vật có vú. Hoạt tính cytotoxin của enzyme này phụ thuộc vào cấu
trúc bậc 4 của nó: dạng BS-RNase monomer không độc với tế bào vì chúng liên kết
chặt chẽ với chất ức chế RI trong tế bào chất. Chỉ có dạng BS-RNase dimer mới có
hoạt tính gây độc tế bào. Trong hai dạng dimer của BS-RNase thì dạng trao đổi
chéo MxM có hoạt tính cytotoxin cao hơn vì nó tồn tại bền vững trong môi trường
khử của bào tương [36].
Hiện nay, ngoài các RNase tự nhiên có hoạt tính chống ung thư người ta đã
tạo ra nhiều dạng biến thể (variant) của RNase A và RNase tụy người mang hoạt
tính cytotoxin, kể cả ở dạng dimer [18, 54] và monomer [28, 39, 40].
4.7. Các chức năng sinh học khác
Ngoài những chức năng chính đã kể trên, RNase còn biểu hiện nhiều hoạt
tính sinh học đặc biệt khác như:
- Tham gia vào sự hình thành mao mạch (angiogenin) [31, 33, 61].
- Gây ức chế miễn dịch (BS-RNase) [36].


- Thể hiện độc tính chọn lọc kháng côn trùng (ECP, EDP)… [61].
Bên cạnh các RNase, trong cơ thể người còn có một số protein biểu hiện hoạt
tính ribonucleotylic như lactoferrin, ABzyme… Lactoferrin là protein liên kết Fe có
trong sữa, huyết thanh và dịch ngoại tiết của cơ thể, giữ vai trò diệt khuẩn, tăng

cường sự phân chia tế bào, điều hòa quá trình tạo nguyên bào tủy xương và kích
thích miễn dịch. ABzyme là kháng thể thủy phân ARN có trong máu các bệnh nhân
mắc chứng lao ban đỏ, bệnh tự miễn và trong sữa người. Người ta giả định rằng các
kháng thể này là các antidiotype thứ cấp bắt chước trung tâm hoạt động của RNase
[61].
Hiện nay, ngày càng nhiều protein có hoạt tính RNase với chức năng bảo vệ
được tìm thấy ở cả vi sinh vật và thực vật như các ribotoxin -sarcin từ nấm mốc
Aspergillus giganteus, antigen Asp f1 của Aspergillus fumigatus… góp phần đa
dạng hóa nguồn RNase tự nhiên tạo cơ sở cho các nghiên cứu và ứng dụng trong
điều trị bệnh.
5. RNASE TỪ NỌC RẮN
5.1. Khái quát
Từ xưa cho tới nay, người ta vẫn sử dụng gần như toàn thân con rắn: thịt,
xương, da, mật, mỡ, máu, nọc… làm nguồn thực phẩm và dược liệu quí để bồi bổ
sức khỏe và chữa trị bệnh tật. Trong các sản phẩm từ rắn thì nọc rắn được quan tâm
nghiên cứu nhiều hơn cả, đặc biệt là nọc của loài rắn độc.
Rắn có thành phần chủ yếu sau:
Thịt rắn có: protein, mỡ, 0,55% chất saporozit.
Mật rắn: chlestrin, acid panmitic, acid stearic và taurin.
Nọc rắn: glycoprotein thrombin, lipase và 3 loại chất chống đông.
Nọc rắn mới tiết ra là một chất lỏng trong, màu hơi vàng với tỉ trọng 1,01 1,03 và độ dính cao, hàm lượng nước lên tới 70-80%. Sau 24h nọc rắn có thể bị
biến chất. Nếu làm khô, nọc rắn sẽ ở dạng tinh thể nhỏ, màu răng và giữ nguyên
tính độc hàng chục năm. Về thành phần, nọc rắn là hỗn hợp của nhiều chất có hoạt
tính sinh học, trong đó chủ yếu là các enzyme như proteinase, phospholipase (A, B,


C, D), ATPase, hydrolase, phosphatase kiềm, phosphatase acid, DNase, RNase,
ATPase, cholinesterase… Trong số các enzyme của nọc rắn, chỉ có phospholipase
và protease là được nghiên cứu nhiều còn RNase thì mới bắt đầu được quan tâm
nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Độc tố chủ yếu của nọc rắn gây ra

bởi các toxin mang bản chất peptide và các protein phân tử lượng thấp như độc tố
neutotoxin, độc tố cardiotoxin, laticotoxin, erabutoxin b, các chất gây chảy máu và
chống đông máu, các chất gây dị ứng. Chúng tác động lên hệ cơ, hệ thần kinh, hệ
tim mạch, hệ hô hấp… gây nên nhiều triệu chứng như tê liệt thần kinh cơ, giảm khả
năng đông máu, tổn thương thành mạch máu trong, tan tiểu cầu dẫn đến xuất huyết
ở phổi, màng bụng và tim.
Nọc rắn được sử dụng làm thuốc chữa bệnh như: Thuốc gây mê, thuốc giảm
đau sau mổ, thuốc an thần, thuốc chống viêm…
5.2. Một vài đặc điểm và tính chất quan trọng của RNase tách từ nọc rắn
Theo các nghiên cứu về RNase tách từ nọc của loài rắn hổ mang vùng Trung
Á của Liên Xô trước đây và Ấn Độ thì hoạt tính RNase trong nọc của ba loài rắn ở
vùng Trung Á và Liên Xô là Vipera, Leleetina, Naja oxiana và Echiscorinatus có
thể khác biệt nhau tới 10 lần, trong đó RNase của Naja oxiana có hoạt tính cao nhất.
Các tác giả Vasilenko và Babkina đã tách chiết, làm sạch và nhận được chế phẩm
2+

RNase có pHopt = 7,6 - 7,8, được hoạt hóa bởi ion Mg và không thủy phân ADN.
Độ bền nhiệt của enzyme này không cao, mất 50% hoạt tính khi đun cách thủy 5’ ở
o

o

50 C và mất hoàn toàn hoạt tính khi xử lý như vậy ở nhiệt độ 70 C. Sản phẩm của
phản ứng thủy phân do enzyme này xúc tác là hỗn hợp các oligonucleotide từ dimer
đến hexamer, chủ yếu là dimer và trimer [59, 60]. Chế phẩm RNase tinh khiết tách
từ nọc rắn hổ mang Maja naja vùng Guntur Ấn Độ lại có những biểu hiện khác: dải
o

o

nhiệt độ hoạt động tốt là 37 - 60 C với tối ưu nhiệt độ là 37 C, RNase này rất bền
với urea, hoạt tính cực đại ở nồng độ urea là 2,5M; các ion kim loại cũng ảnh hưởng
2+

phức tạp tới hoạt tính Ribonucleolytic của enzyme: ion Mg
+

+

giúp tăng cường hoạt

động; K và Ca ở nồng độ thấp 0,2mM và 0,4mM thì ức chế enzyme nhưng ở nồng


độ cao > 2,5mM lại có tác dụng hoạt hóa. Các ion kim loại nặng phần lớn là những
chất ức chế [42].
Các nghiên cứu ở Việt Nam mới đây cho thấy nguồn enzyme từ nọc rắn hổ
mang Việt Nam có nhiều điểm khác biệt so với các RNase đã được nghiên cứu trên
2+

thế giới: pHopt = 2,62  0,6; RNase rất bền với nhiệt và Mg không phải là chất
hoạt hóa RNase… [2, 3, 7]. Những kết quả trên cho thấy ở các loài rắn khác nhau
thì tính đặc trưng của RNase cũng khác nhau và có thể tồn tại nhiều dạng phân tử
RNase nọc rắn với bản chất protein khác nhau.
6. NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA RNASE TRONG Y HỌC
RNase có một ý nghĩa hết sức to lớn đối với nhiều loại bệnh trong y học.
Ngoài chức năng tiêu hóa và tham gia vào các hoạt động sao mã, phiên mã, sinh
tổng hợp protein, các RNase còn thực hiện nhiều vai trò trong phòng chống virus, vi
khuẩn, kháng giun…
Nồng độ và hoạt tính của RNase trong dịch bào và các dịch cơ thể có liên

quan tới trạng thái bệnh lý của nhiều loại bệnh khác nhau: Nồng độ enzyme tăng là
kết quả phản ứng của cơ thể chống lại bệnh tật. Đôi khi chính RNase lại là tác nhân
gây bệnh vì chúng gây độc cơ thể.
Những ứng dụng trực tiếp của RNase trong điều trị bệnh virus cho người và
vật nuôi đã được tiến hành ở Liên Xô vào những năm 70 của thế kỷ trước. Trong
liệu pháp người ta có thể dùng những chất hoạt hóa, chất ức chế hay thậm chí cả
những RNase và dạng hợp thể của RNase để trị bệnh.
Ví dụ: chất ức chế không chọn lọc enzyme photphodiesterase là teophilin
hay chất ức chế chọn lọc rolipram có tác dụng giải phóng các neurotoxin ECP, EDN
từ các bạch cầu axit giúp giảm hiệu ứng ngộ độc thần kinh. Chất ức chế RNase của
người làm giảm hiệu ứng gây dị ứng của các tác nhân gây dị ứng có hoạt tính
RNase ở một số loài thực vật. Chế phẩm orange hoạt hóa RNase L có thể bảo vệ tế
bào khỏi nhiễm trùng virus.
Những năm gần đây, ngoài việc tìm được một số RNase nguồn gốc tự nhiên
có nhiều đặc tính quý báu (như onconase, BS-RNase) các nhà khoa học còn tập


trung sản xuất ra các chế phẩm RNase nhân tạo có hoạt tính chống ung thư nhờ việc
vận dụng thành công các kỹ thuật và phương pháp công nghệ sinh học hiện đại ở
mức độ phân tử. Dạng biến thể của RNase được tạo ra bằng cách thay thế một hay
một vài gốc amino acid cần cho sự tương tác RI-RNase hoặc tạo thêm liên kết
disunfide trong tế bào.
Các biến thể của RNase cũng được tạo ra bằng cách gắn đặc hiệu vào RNase
những phân tử protein liên kết chặt chẽ với những tế bào nhất định cho phép tạo ra
những toxin chọn lọc hiệu quả.
Kết luận: Những dẫn liệu trên đây cho chúng ta thấy khả năng ứng dụng và
triển vọng của RNase đối với Y học. Trong tương lai, nhiều dạng RNase vẫn sẽ
được nghiên cứu để tạo ra các loại thuốc tác động hiệu quả lên các khối u, các thuốc
chữa dị ứng, các test chuẩn đoán cũng như các hệ thống truyền tín hiệu định hướng
và chọn lọc. Nhiều bệnh hiểm nghèo sẽ được phòng chống và chữa trị hiệu quả.

Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1. Vật liệu
- Vật liệu để tách RNase: Nọc rắn hổ mang (Naja naja, Cantor, 1970) dạng
đông khô mua từ làng nghề nuôi rắn xã Vĩnh Sơn, huyện Vĩnh Tường, tỉnh Vĩnh
Phúc.
2.1.2. Thiết bị
- Thiết bị: Cân điện tử, máy li tâm lạnh, máy khuấy từ, máy quang phổ UVVisable Spectrophotometer UV-1601 của hãng Shimatzu, thiết bị sắc kí FPLC, máy
đo pH…
2.1.3. hóa chất
- Hóa chất: Superdex 75, SP (sulfopropyl) Sepharose 4 Fast Flow và ARN
tổng số từ nấm men của hãng Sigma, Glycine (Gly) của hãng Prolabo, các hóa chất
khác như NaCl, KH2PO4, citrate natri, acid citric, KOH, HCl … đều có độ sạch
phân tích.
Các dung dịch đệm:
- Các dung dịch đệm sử dụng cho sắc kí: các đệm citrate 10 mM với pH 4,0;
4,5; 5,0; 5,5 và 6,0, không chứa muối NaCl và chứa muối NaCl với các nồng độ
0,15 M và 1,0 M; các dung dịch đệm phosphate 10 mM với pH 6,5; 7,0 và 7,5,
không chứa muối NaCl và chứa muối NaCl với các nồng độ 0,10; 0,15 M và 1,0 M.
Các dung dịch đệm citrate và đệm phosphate 10 mM không chứa muối NaCl được
gọi là các dung dịch đệm ban đầu (dung dịch A), các dung dịch đệm chứa muối
NaCl ở nồng độ 1,0 M được gọi là dung dịch B.
- Dung dịch đệm glycine (Gly) 10 mM, pH 2,5, một seri hỗn hợp đệm 4
thành phần Glycine-Citrate-Phosphate-Tris tổng nồng độ 40 mM, mỗi chất với nồng
độ 10 mM.
2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính RNase [1]
- Nguyên lý: ARN hấp phụ cực đại ở bước sóng 260 nm. Khi ARN bị thủy
phân bởi RNase, mật độ quang (OD260) của dung dịch tăng lên. Dựa vào sự thay đổi
giá trị OD260 ta đo được hoạt tính enzyme của RNase.
Hoạt tính RNase được đo trên máy quang phổ UV - visable
Spectrophotometer UV-1601 của hãng Shimadzu và được tính theo công thức sau:
30”

0”

A = OD (+E) - OD (-E).k - OD(E)

(1)

Trong đó:
+ A là hoạt tính của RNase;
0”

+ OD (-E) là hấp phụ của hỗn hợp phản ứng chứa cơ chất [(1000 - x) l
dung dịch cơ chất] khi chưa cho x l dịch enzyme vào;
30”

+ OD (+E) là hấp phụ của hỗn hợp phản ứng sau 30 giây phản ứng tính từ
thời điểm bắt đầu phản ứng;
+ k là hệ số hiệu chỉnh: Tại thời điểm 0”, giá trị OD260 đã đo được chỉ là độ
hấp phụ của (1000 - x) l dung dịch cơ chất, mà không phải là giá trị OD260 của hỗn
hợp phản ứng tại thời điểm bắt đầu phản ứng, bởi vì khi cho thêm x l dung dịch
enzyme vào để bắt đầu phản ứng thì hỗn hợp phản ứng bị pha loãng ra một chút.

Cho nên để tính được giá trị OD260 thực của hỗn hợp phản ứng tính tại thời điểm bắt
đầu phản ứng, thì phải tính đến sự pha loãng này. Đây chính là nguyên nhân vì sao
phải sử dụng hệ số điều chính k. Hệ số k được xác định như sau:
0”

Đo OD260 của (1000 - x) l dung dịch cơ chất, kí hiệu là OD S. Sau đó thêm
vào x l dung dịch đệm pha cơ chất, khuấy đều và đo OD260, giá trị OD đo được kí
0”
hiệu là OD
, khi đó:
S+buf
(2)
0”
0”
k = OD S+buf/OD
S

- Một đơn vị (U) hoạt tính RNase là lượng enzyme xúc tác thủy phân ARN trong
điều kiện tiêu chuẩn (nồng độ cơ chất bão hòa, nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu, dung dịch
đệm thích hợp…) làm tăng mật độ quang của hỗn hợp phản ứng (1 ml) lên 1 đơn vị
OD260 sau 30 giây phản ứng (thời gian phản ứng tính từ lúc bắt đầu cho enzyme vào
hỗn hợp phản ứng chứa cơ chất). [1]

20


2.2.2. Các phương pháp sắc kí phân tách RNase nọc rắn hổ mang
2.2.2.1 Phương pháp sắc ký trao đổi ion trên cột SP Sepharose 4 Fast Flow
- Cơ sở: Phương pháp sắc kí trao đổi ion dựa trên cơ sở của phản ứng tương
tác tĩnh điện ion - ion giữa protein-enzyme tan trong dung dịch đệm loãng với nhựa

trao đổi ion (chất mang), cụ thể là sự phân tách các protein trong một hỗn hợp
protein dựa trên sự khác biệt trong điện tích bề mặt của các phân tử của chúng ở
một giá trị pH nhất định. Phương pháp này không chỉ là một khâu quan trọng trong
quá trình tách chiết mà còn giúp đánh giá được một vài tính chất hóa lý của enzyme
quan tâm [62, 63]
Sắc kí trao đổi ion được tiến hành trên cột (kích thước 0,9  20 cm, tức là
3

thể tích cột gel khoảng 14 cm ) với chất mang là SP sepharose 4 Fast Flow. Quá
trình sắc kí trao đổi ion được tiến hành ở các giá trị pH khác nhau trong vùng pH =
4,0  7,5. Trong mỗi thí nghiệm đã sử dụng khoảng 70 mg nọc rắn đông khô để cho
lên cột.
+ Đầu tiên cột được cân bằng với dung dịch đệm ban đầu (đệm citrate hay
đệm phosphate, xem phần trên).
+ Chuẩn bị mẫu nọc rắn: trước khi chạy sắc kí 1h cân khoảng 70 mg nọc rắn
hổ mang đông khô và hòa tan trong ~ 1,5 ml dung dịch đệm ban đầu, sau đó li tâm
o

trong 10 phút với tốc độ 12 000 vòng/phút ở 4 C, loại cặn, thu lấy phần dịch li tâm
chứa enzyme để cho lên cột.
Sắc kí ở các giá trị pH từ 4,0 đến 6,0 được tiến hành trong đệm citrate, còn
sắc kí ở các giá trị pH từ 6,5 đến 7,5 – trong đệm phosphate. Khi sắc kí ở các giá trị
pH từ 4,0 đến 6,5 quá trình sắc kí được tiến hành như sau: sau khi cho mẫu lên cột,
rửa cột bằng 36 ml dung dịch, mối phân đoạn thu 3 ml (gồm 15 ml dung dịch ban
đầu – dung dịch A, và 21 ml dung dịch ban đầu chứa 0,15 M NaCl có giá trị pH
tương ứng), sau đó chạy gradient nồng độ NaCl 0,15  0,80 M với thể tích chung
của gradient bằng 150 ml, mối phân đoạn thu 2 ml. Sau khi kết thúc chạy gradient
NaCl, rửa tiếp cột bằng 60 ml dung dịch B, mỗi phân đoạn thu 3 ml. sắc kí ở giá trị
pH = 7,0, toàn bộ quá trình sắc kí được tiến hành tương tự, chỉ khác ở điểm là thay

đệm ban đầu chứa 0,15 M NaCl dùng để rửa cột bằng đệm ban đầu chứa 0,10 M
NaCl và thay gradient 0,15  0,80 M bằng gradient 0,15  0,7 M NaCl, còn khi sắc
kí ở giá trị pH = 7,5 thì chỉ dùng dung dịch đệm ban đầu (dung dịch A) để rửa cột
và thay gradient 0,15  0,80 M bằng gradient 0,0  0,60 M NaCl
Toàn bộ quá trình sắc kí được tiến hành tự động trên thiết bị FPLC theo
chương trình phần mềm sau:
Main
0.00 Base Volume
0.00 Block Dieukienbandau
(Dieukienbandau)
0.00 Base SameAsMain
0.00 Alarm_Pressure Enabled, 3 {MPa}, 0.00 {MPa}
0.00 Alarm_UV Disabled, 3000 {mAU}, 0 {mAU}
0.00 Flow 1.00 {ml/min}
0.00 Buffer ValveA A1
0.00 Column Position Position2
0.00 End_Block
0.00 Block Loadmau
(Loadmau)
0.00 Base SameAsMain
0.00 InjectionValve Load
0.00 Sample Flow 1 {ml/min}
0.00 FractionationStop
2.00
End_Block
Block Ruacot
(Ruacot)
0.00 Base SameAsMain
0.00 Sample Flow 0.00 {ml/min}

0.00 InjectionValve Inject
0.00 Fractionation 18mm, 3.000 {ml}, First Tube,
Volume
36.00 End_Block


0.00 Block chaygradient
(Chaygradient)
0.00 Base SameAsMain
0.00 Gradient 65,0{%B}, 150{Base}
0.00 Fractionation 18mm, 200 {ml}, Next Tube,
Volume
150.00 End_Block
0.00 Block Haugradient
(Haugradien)
0.00 Base SameAsMain
0.00 Gradient 100.00 {%B} 45{Base}
0.00 Fractionation 18mm, 3.000 {ml}, Next Tube, Volume
60.00 End_Block
0.00 Block Taisinhcot
(Taisinhcot)
0.00 Base SameAsMain
0.00 Gradient 0.00 {%B} 45{Base}
0.00 FractionationStop
600.00 End_Block

2.2.2.2. Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử trên cột Superdex 75
Cơ sở: Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử (hay còn gọi là sắc kí lọc gel)
dựa trên sự khác biệt trong hình dạng và kích thước phân tử của các protein khác
nhau trong một hỗn hợp protein. Khi cho một hỗn hợp protein có kích thước phân

tử khác nhau đi qua cột lọc gel, thì những protein có kích thước phân tử lớn hơn lỗ
của các hạt gel sẽ không đi vào bên trong các hạt gel, và ra khỏi cột trong cái gọi là
thể tích tự do của cột; còn những protein có kích thước phân tử nhỏ hơn kích thước
lỗ của các hạt gel, và chúng sẽ đi vào bên trong các hạt gel, tức là chúng được phân
bố giữa 2 pha – bên trong và bên ngoài các hạt gel với các hệ số phân bố tương ứng.
Các protein này sẽ đi ra khỏi cột lọc gel theo thứ tự ngược với kích thước phân tử
của chúng, tức là các protein nào có kích thước phân tử lớn thì ra khỏi cột trước và
những protein nào có kích thước phân tử nhỏ hơn sẽ ra sau, các chất muối (thường


có mặt trong các chế phẩm protein) ra khỏi cột sau cùng (chính vì vậy mà cột lọc
gel thường được sử dụng để loại muối khỏi các dung dịch protein) [62, 63].
Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử cũng được tiến hành tự động trên thiết
bị sắc kí FPLC. Trong phạm vi luận văn này chúng tôi chỉ tiến hành sắc kí sàng lọc
phân tử chế phẩm nọc rắn hổ mang đông khô ở 2 giá trị pH khác nhau là 5,5 (trong
đệm citrate 10 mM) và 7,5 (trong đệm phosphate 10 mM). Trong mỗi thí nghiệm đã
sử dụng khoảng 20 mg nọc rắn đông khô để cho lên cột.
+ Đầu tiên cột được cân bằng với dung dịch đệm ban đầu (đệm citrate hay
đệm phosphate, xem phần trên).
+ Chuẩn bị mẫu nọc rắn: trước khi chạy sắc kí 1h cân khoảng 20 mg nọc rắn
hổ mang đông khô và hòa tan trong ~ 1,5 ml dung dịch đệm ban đầu, sau đó li tâm
o

trong 10 phút với tốc độ 12 000 vòng/phút ở 4 C, loại cặn, thu lấy phần dịch li tâm
chứa enzyme để cho lên cột.
Quá trình sắc kí sàng lọc phân tử trên cột superdex 75 (kích thước 0,9  60
3

cm, tức là thể tích cột gel khoảng 38 cm ) được tiến hành như sau: sau khi cho mẫu
lên cột, sử dụng dung dịch đệm ban đầu tương ứng (citrate hay phosphate) để đẩy

protein ra khỏi cột, không thu 15 ml dịch đầu tiên chảy ra khỏi cột (thể tích này gần
3

bằng thể tích tự do của cột lọc gel - ~18 cm ), từ ml thứ 15 trở đi bắt đầu thu các
phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn là 1 ml (thu khoảng 65 – 70 phân đoạn). Quá
trình sắc kí lọc gel (sàng lọc phân tử) được tiến hành tự động trên máy sắc kí FPLC
theo chương trình phần mềm sau:
Main
0.00 Base Volume
0.00 Block Dieukienbandau
(Dieukienbandau)
0.00 Base SameAsMain
0.00 Alarm_Pressure Enabled, 3 {MPa}, 0.00 {MPa}
0.00 Alarm_UV Disabled, 3000 {mAU}, 0 {mAU}
0.00 Buffer ValveA A1
0.00 Flow 1.00 {ml/min}
0.00 End_Block


0.00 Block Loadmau
(Loadmau)
0.00 Base SameAs Main
0.00 Sample Flow 1.00 {ml/min}
0.00 InjectionValve Load
2.00 End_Block
0.00 Block chaycotlocgel
(Chaycotlocgel)
0.00 Base SameAs Main
0.00 InjectionValve Inject
0.00 Fractionation 18mm, 100 {ml}, Tube Number

[B9], Volume
75.00 End_Block
0.00 Block Taisinhcot
(Taisinhcot)
0.00 Base SameAsMain
0.00 InjectionValve Inject
0.00 FractionationStop
300.00 End_Block
Hàm lượng protein được ghi tự động liên tục trên máy sắc kí. Tuy nhiên, sau
khi quá trình sắc kí kết thúc đã tiến hành đo hoạt tính RNase và hàm lượng protein
trong tất cả các phân đoạn thu được.
2.2.2.3. Phương pháp phân tích kết quả phân tách protein
Như đã để cập tới ở trên, hàm lượng protein được xác định liên tục và được
ghi lại tự động trên máy sắc kí, do vậy sắc kí đồ phân tách protein là một đường
cong liên tục được ghi lại trên máy sắc kí. Hơn nữa, trên thiết bị FPLC còn có phần
mềm xử lí các kết quả phân tách protein nhận được sau sắc kí: chỉ cần đặt con trỏ
vào vùng sắc kí đồ và kích phải là hiện lên menu, sau đó kích tiếp vào hàng “peak
intergrate”là máy sẽ tự động vẽ baseline ở vùng chân của các đỉnh protein ở dạng
một đường gạch đứt quãng, đồng thời trên sắc kí đồ xuất hiện sự phân chia ranh
giới giữa các đỉnh protein, trên mỗi đỉnh protein đều có ghi số chỉ thể tích ra khỏi
cột của đỉnh protein tương ứng, đặc biệt là trên màn hình ở phia dưới sắc kí đồ còn