Thiết kế vector biểu hiện các gene mã hóa cho các Enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp βcarotene trong vi khuẩn Escherichia coli. (Khóa luận tốt nghiệp)

I H C THÁI NGUYÊN
I H C NÔNG LÂM
--------------

TÀI:
THI T K VECTOR BI U HI N CÁC GENE MÃ HÓA CHO CÁC
NG SINH T NG H P - carotene
TRONG VI KHU N Escherichia coli

KHÓA LU N T T NGHI

H

o

IH C

: Chính quy

Ngành

: Công ngh sinh h c

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa h c

: 2011-2015

Thái Nguyên, 2015


I H C THÁI NGUYÊN
I H C NÔNG LÂM

--------------

TÀI

THI T K VECTOR BI U HI N CÁC GENE MÃ HÓA CHO CÁC
NG SINH T NG H P - carotene
TRONG VI KHU N Escherichia coli

KHÓA LU N T T NGHI
H

o

IH C

: Chính quy

Ngành

: Công ngh sinh h c

L p

: 43-CNSH

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa h c

: 2011-2015

Gi

ng d n: 1 .
2. ThS. Ma Th Trang

Thái Nguyên, 2015

ng


L IC

Trong quá trình h c t p và nghiên c

hoàn thành khóa lu n t t nghi p

ngoài s n l c, c g ng c a b n thân
b

cs

ng viên c a th y cô, b
Tôi xin bày t lòng bi

t

p hoàn thành khóa lu n:
c t i Th

ng d n ch b o, gi
il ic

nghi m công ngh gen

ng d n, ch

c m c và c ng c ki n th c cho tôi.
i Th.S Ma Th Trang, cán b phòng thí

c ti p ch b

c, t o m

u ki n t t nh

tôi h c t p và nghiên c u.
y cô trong khoa Công ngh sinh h c Công
ngh th c ph

o và d y d tôi trong su t th i gian qua.

Cu i cùng tôi xin g i l i c
ng viên, chia s

i thân và b

nh

c t p nghiên c u.
Thái Nguyên, tháng 06
Sinh viên

5


Amp

: Ampicillin

Bp

: Base pair C

CoA

: Coenzyme Acetoacetyl

Cs

: C ng s

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

E. coli

: Escherichia coli

EDTA

: Etilendiamin tetraaxetic acit

IPTG

: Isopropyl Thiogalactoside

Kb

: Kilo base

LB

: Laria Broth

NCBI

: Nation Cetrer for Biotechnology Information

PCR

: Polymerase Chain Recation

S. chromofuscus

: Streptomyces chromofuscus

TAE

: Tris-acetate-EDTA

UV

: Ultraviolet

X-gal

: 5-bromo-4-chloro-3-indoly- -D-galactoside

ROS

: Reactive Oxygen Species

RNS

: Reactive Nitrogen Species


Trang

B

ng carotenoid có trong th c v t........................................ 15

B ng 3.1: Các thành ph n c a vector pRSET-A............................................. 27
B ng 3.2: Các thành ph n c a vector pET22b(+)........................................... 28
B ng 3.3: Danh m c các thi t b s d

tài.................................... 31

B ng 3.4: Thành ph n ph n ng c t v i EcoRI và HindIII ............................ 36
B ng 3.5: Thành ph n ph n ng c t v i KpnI và EcoRI ................................ 36
B ng 3.6: Thành ph n ph n ng c t v i EcoRI và XbaI ................................ 37
B ng 3.7: Thành ph n ph n ng g n n i ........................................................ 39


Trang
Hình 2.1: Công th c c u t o c a -carotene...............................................................4
chuy n hóa -carotene thành vitamin A...........................................6
Hình 2.3: Bi

kh o sát th

ki

....9

Hình 2.4: Sinh t ng h

ng MAV .............................11

Hình 2.5: Sinh t ng h

ng MEP ..............................12

Hình 2.6: Quá trình sinh t ng h p carotenoids t IPP và DMAPP ..........................13
Hình 2.7: Quá trình chuy n hóa phyopene thành lycopene.......................................13
Hình 2.8: T ng h p -carotene t lycopene .............................................................14
t ng h p - carotene c a BASF .....................................................16
t ng h p -carotene c a Roche....................................................17
Hình 2.11: Quá trình chuy n hóa -carotene

i s tham gia các gene Crt...........19

ki m soát s phiên mã c a T7 promoter.....................................20
h th ng vector bi u hi n pRSET.................................................22
h th ng vector bi u hi n pET......................................................22
a protein tái t h p ch a 6xHis và giá th Niken.............23
Hình 3.1: C u trúc vector bi u hi n pRSET .............................................................26
Hình 3.2: C u trúc vector bi u hi n pET22b(+).........................................................28
Hình 3.3: Quy trình thi t k vector pR-iEIBY..........................................................33
Hình 3.4: Quy trình thi t k vector pET22iEIBY. .....................................................34
Hình 4.1: K t qu

n di ki m tra các dòng plasmid pR-iEIY ................................41

Hình 4.2: K t qu

n di s n ph m c t ki m tra s có m t c a gene crtY...............42

Hình 4.3: Hình minh h

Hình 4.4: K t qu

ki m tra chi u g n gen crtY trên vector pR-iEIY..........43

n di s n ph m c t ki m tra chi u g n gene crtY trên pRiEIY ..........44

Hình 4.5: K t qu

n di ki m tra các dòng plasmid pR-iEIBY .............................45

Hình 4.6: K t qu

n di s n ph m c t ki m tra s có m t c a gene crtB ..............46

Hình 4.7: K t qu

n di ki m tra các dòng plasmid pET22-Y ................................47

Hình 4.8: K t qu

n di ch n l c dòng pET22-Y v i enzyme EcoRI.....................47


Hình 4.9: Hình minh h

ki m tra chi u g n gen crtY trên vector pET22-Y........48

Hình 4.10:K t qu

n di ki m tra chi u g n crtY trên vector pET22-Y..................49

Hình 4.11: K t qu

n di ki m tra các dòng plasmid pET22-iEIBY ......................49

Hình 4.12: K t qu
Hình 4.13: Hình minh h
Hình 4.14: K t qu

n di ch n l c dòng pET-iEIBY v i enzyme XbaI và EcoRI .........50
ki m tra chi u g n c m gene iEIB trên vector pET22iEIBY .......51
n di ki m tra chi u g n c m iEIB trên vector pET22-iEIBY..........52

Hình 4.15: K t qu bi u hi n vector pR-iEIBY trong ch ng E. coli BL21 (DE3)...53
Hình 4.16: K t qu bi u hi n vector pET22iEIBY trong ch ng E. coli BL21 (DE3) ....54
Hình 4.17: K t qu so sánh so sánh bi u hi n c a hai h vector pRSET-A và pET22b(+)...55


C
PH N 1 M
tv

U .....................................................................................................1
.............................................................................................................1

1.2 M

u.............................................................................................3

1.3 M c tiêu nghiên c u..............................................................................................3

tài..................................................................................................3
c ...............................................................................................3
c ti n ................................................................................................3
PH N 2 T NG QUAN TÀI LI U ..........................................................................4
2.1 Khái quát v s c t

-carotene..............................................................................4

2.1.1 C u trúc và tính ch t lý hóa................................................................................4
2.1.2 Vai trò c a s c t

-carotene v

2.1.2.1 Vai trò c a -carotene
2.1.2.2

i......................................................5

i v i s c kh

i........................................5

ng d ng c a -carotene trong công nghi p..................................................8
ng t ng h p -carotene ......................................................................10

2.1.4 Ngu n cung c p -carotene .............................................................................14
2.1.4.1 Ngu n cung t th c v t.................................................................................14
2.1.4.2 Ngu n cung t vi sinh v t .............................................................................15
2.1.4.3 Ngu n cung t t ng h p hóa h c ..................................................................16
2.1.5

ng d ng công ngh DNA tái t h p vào s n xu t -carotene t nhiên ........18

2.2 Vi khu n E.coli và các h vector bi u hi n trong s n xu t protein tái t h p. ...19
m c a vi khu n E. coli trong s n xu t protein tái t h p .....................19
2.2.2 M t s h th ng vector bi u hi n trong vi khu n E. coli .................................21
2.3 Tình hình nghiên c

c .........................................................23

2.3.1 Tình hình nghiên c u trên th gi i...................................................................23
2.3.2 Tình hình nghiên c
Ph n 3 V T LI U, N

c.....................................................................25
U ...........26

3.1 V t li u nghiên c u .............................................................................................26
3.1.1 Vi khu n ...........................................................................................................26
3.1.2 V t li u .............................................................................................................26
3.1.2.1 Enzyme..........................................................................................................26


3.1.2.2 Vector ............................................................................................................26
3.1.3 Hóa ch t ...........................................................................................................29
3.1.4 D ng c ............................................................................................................31
3.1.5 Thi t b .............................................................................................................31
3.1.6 Ph m vi nghiên c u..........................................................................................31
m và th i gian nghiên c u .......................................................................32
3.3 N i dung nghiên c u ...........................................................................................32

u.....................................................................................33
t k in silico..........................................................................34
pb

gi i h n.....................................................................35

n di DNA trong gel agarose ..................................................37
n DNA t gel agarose ....................................................38
n gen mong mu n lên vector bi u hi n .........................38
n b t bào E. coli kh bi n .................................................39
n n p DNA plasmid vào t bào kh bi n b ng s c nhi t ......39
t DNA plasmid.............................................................40
Ph n 4 K T QU VÀ TH O LU N....................................................................41
4.1. Thi t k vector bi u hi n mang policistron g m 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên
n n t ng vector bi u hi n pRSET-A t o vector tái t h p pR-iEIBY. ...........................41
4.1.1. K t qu g n gene crtY vào vector pR-iEI t o vector tái t h p pR-iEIY.......41
4.1.2. K t qu g n gene crtB vào vector pR-iEIY t o vector tái t h p pR-iEIBY....45
4.2 Thi t k vector bi u hi n mang policistron g m 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên n n
t ng vector bi u hi n pET22b(+) t o vector tái t h p pET22-iEIBY. ...............................46
4.2.1 K t qu g n gene crtY vào vector pET22b(+) t o vector tái t h p pET22-Y.....46
4.2.2 K t qu g n c m gene idi-crtE-crtI-crtB vào vector pET22-Y t o vector tái t h p
pET22-iEIBY...............................................................................................................49
4.3. K t qu ki m tra s ho

ng c a các gene......................................................52

Ph n 5 K T LU N VÀ KI N NGH ...................................................................56
5.1. K t lu n ..............................................................................................................56
5.2 Ki n ngh .............................................................................................................56
TÀI LI U THAM KH O ......................................................................................57

N1
U

Carotenoid là m t d ng s c t t nhiên xu t hi n ch y u
loài sinh v t quang h

th c v t và các

m, t o và m t vài lo i vi khu n (Schmidt-

Dannert, 2000) [57]. Chúng có vai trò hình thành màu s c cho cây, che ch n ánh
sáng (Vershinin, 1999) [70] và có kh

ng oxy hóa m nh (Stahl and Sies,

2003) [63]. Ngày nay có kho ng 600 lo
s

n thi t cho ch

c tìm th y và 40 lo i trong

ng c

i (Rao and Rao, 2007) [52].

-carotene là s c t có màu vàng ho c da cam, thu c nhóm carotenoid. Chúng
c tìm th y

m t s lo

u hà lan (Desobry, Netto

et al. 1998) [18]. -carotene

c bi

t ti n ch

t ng h p vitamin A

m t lo i vitamin r t c n thi t cho m t (Lampert, Holzschuh et al. 2003; Stutz,
Bresgen et al. 2015) [35, 65]. Theo t ch c WHO và FAO m

u

tr em b m c các b nh v m t mà nguyên nhân ch y u là thi u provitamin A trong
kh u ph

(Harjes, Rocheford et al. 2008) [26].

d ng trong su

ng v t, -carotene

ng, chúng tham gia vào m t lo t các quá trình

sinh lý, sinh s n, phát tri n bi u bì c a mô, c

mi n d ch (Sklan, 1987) [60]. Nhi u nghiên c
d

cs

ng kh
ra r ng -carotene có tác

a quá trình oxy hóa b ng cách lo i b các g c oxy t

b ov t

a quá trình phát tri n c a t

nh tim

m ch (Igielska-Kalwat, Goscianska et al. 2015) [29].
u s d ng -carotene

Trong nh
th ng kê c a công ty nghiên c u th

ng BCC, th

t 1,2

t
c u s d ng -carotene chi m t tr ng cao nh t v i 262 tri u USD (chi m 21,8%)
im
2018 s

carotene

ng bình quân h
u USD (BCC 2011) [11].

c s n xu

ng chính: M

ki
ng nhu c

-

ng t ng h p hóa


h c, hai là chi t xu t t các ngu n có s n trong t nhiên (Bernardo Dias Ribeiro,
Daniel Weingart Barreto et al. 2011, Vachali, Bhosale et al. 2012) [12, 69]. S n
ph m -carotene t ng h p hóa h c ch có ch

ng phân duy nh

-carotene t nhiên không nh ng có ch a -carotene mà c

-carotene

-carotene t nhiên có ho t tính sinh h

i t ng

h p hóa h c (Voutilainen, Nurmi et al. 2006; Baky. and El-Baroty. 2013) [71, 9].
n ph m -carotene t

Bên c

công nghi p thì ngu n cung -carotene t

m

m là ph

thu c th i v , ph c t p trong xây d ng và qu n lý vùng nguyên li u. V

t ra

t o ngu n cung -carotene t nhiên.

là c n ph

Cùng v i s phát tri n c a khoa h c công ngh nói chung và công ngh sinh
h c nói riêng, vi c ng d ng công ngh DNA tái t h p cùng v i ng d ng
thu t di truy

i quy

vi sinh v t có kh
carotene

c các v

nêu trên. Các nghiên c u v t o ch ng

n sinh ra các enzyme tham gia vào quá trình t ng h p c nh ng thành công nh

c ng s t o ch ng sinh v t có kh

nh

0, Misawa và

ng h

u tiên

trên Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaciens (Misawa, Yamano et al.
1991) [45]

Escherichia coli (Lee, Momen et al. 2003) [36].

S bi u hi n c a các gene liên quan t i m t lo t các y u t
promoter, ch ng ch ; và các

H vector,

ch phiên mã, d ch mã và sau d ch mã (Jana and

Deb 2005) [32]. Vector là m t trong nh

c quan tâm t i, theo

lý thuy t m t h vector có s b n sao cao s làm

t n s mRNA

su t bi u hi n protein tái t h p (Camps 2010) [15]. Tuy nhiên, s

ng b n sao

cao li u có ph i là t t nh t? Theo nghiên c u c a Jones KL và c ng s , m t vài h
vector có s b n sao th

u hi n

ho c có ph n t t

i m t h vector có s b n sao cao (Jones, Kim et al. 2000) [33]. Bên c nh
, v trí ti

t y u t quan tr ng. N

có th tr nên không tan khi

m

t ng h p cao, d

i trong t bào ch t nó
n s hình thành các th

vùi. Vi c thu h i protein có ho t tính sinh h c t nh ng th vùi này là r t khó


(Anupam Singh, Vaibhav Upadhyay et al. 2015) [6]. Nh m gi i quy t v
ngày nay protein tái t h p s

này,

c g n thêm m t chu i tín hi u ti t b

m t trình t mã hóa cho chu i tín hi
c nh n bi t b i h th ng ti

u hi n. Chu i tín hi u này
c v n chuy n t

Hi n nay, vi c s n xu t các h p ch t carotenoid

Vi t Nam v n còn m t v n

m i, các nghiên c u m i ch d ng l i

vi c tách chi t t th c v t và phân l p

các ch ng vi sinh v t s n xu t -carotene

quy mô nh . Vi c s d ng các h p ch t

-carotene

Vi t Nam ch y u do nh p kh u t

phát t nhu c u th c ti n, tôi th c hi

c ngoài v i giá thành cao. Xu t
Thi t k vector bi u hi n các gene

mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình sinh t ng h p -carotene trong vi
khu n Escherichia coli

h mm

p v t li u cho các nghiên c u t o

n xu t -carotene tái t h p.

ch ng vi sinh v t có kh

Thi t k thành công vector bi u hi n các gene mã hóa cho các enzyme liên
n quá trình sinh t ng h p -carotene trong vi khu n Escherichia coli.
Ki m tra

t bi u hi n -carotene trong

ng c a s b n copy t

vi khu n E. Coli.

- N i dung 1: Thi t k vector bi u hi n mang polycistron ch a 5 gene idi-crtEcrtI-crtB-crtY trên n n t ng vector pRSET-A.
- N i dung 2: Thi t k vector bi u hi n mang polycistron ch a 5 gene idi-crtEcrtI-crtB-crtY trên n n t ng vector pET22b(+).

K t qu c

tài là ti

cho các nghiên c u v bi u hi n -carotene trong

E. coli sau này.

S n ph m c a nghiên c u m
carotene m i, rút ng n th i gian s n xu

ng nghiên c u ng d ng s n xu t ng nhu c u th c ti n.


2

2.1
2.1.1

-carotene
ý hóa
Carotenoid là nhóm s c t t

c tìm th y ch y u trong các loài th c

v t,

, bao g m 65-70 s c t t nhiên và là m t

trong nh ng h p ch t màu quan tr ng nh
ph

c s d ng trong công nghi p th c

c ph m, m ph m.

c chia làm hai nhóm: Th nh t
-carotene, torulen và nhóm còn l i là

astaxantin. Hi

xantophyl b
c u r ng rãi, tiêu bi

ik

c nghiên
n -carotene.

C u trúc: -carotene là m t trong s

c tìn th y

trong t nhiên. Chúng là m t d n xu t isoprene

bao g m 40 nguyên t

cacbon và 56 nguyên t hydro (C40H56) -carotene có d ng tinh th hình kim, trong
c u trúc có các n

t o nên m t chu i polyen (hình 2.1).

Hình 2.1: Công th c c u t o c a -carotene

Tính ch t lý hóa: -carotene là h p ch t có màu vàng cam, tan t t trong d u và
các dung môi h

-

c.

p dài mà -carotene có ái l c m nh v

i

ng phân hóa khi ti p xúc v i không khí, ánh sáng hay nhi

.

Nh có h th ng n
nên d b oxy

l i

(Goodwin 1980) [23].


2.

-carotene
-carotene
Hi n nay, -carotene

tác d ng h u ích c
c bi

c các nhà khoa h

c bi t quan tâm nghiên c u b i
i (Nagao 2009) [48]. -carotene

i v i s c kh

n ch t vitamin A r t c n thi t cho m t (Lampert, Holzschuh et

al. 2003) [35], bên c
ng a m t s b

ng oxy hóa m
.

Vai trò là ch t ch ng oxy hóa
G c t do là nh ng phân t b thi u h

n tích. Các g c t

không cân b ng và r t d ph n ng. Chúng luôn tìm cách chi
phân t khác, các phân t b m
t

Ch t oxy hóa tiêu bi

c g i là ch t oxy hóa.

c phát hi n là ROS. ROS là m t s n ph m ph

c a quá trình hô h

cao

n t t các

n tích s l i tr thành nh ng g c t do m i. Quá

c g i là quá trính oxy hóa và g c t

thích sinh ra do các tác

ng

i ch

ng th

ng c
gây t

c kích

tia UV hay ti p xúc v i nhi
t bào và các phân t sinh h

protein (Adetayo O. Omoni and Aluko 2005) [4]. Theo nhi u nghiên c

ra

quá m c là nguyên nhân gây ra các b nh thoái
nh mãn tính, b nh tim m ch. Các
ch t ch ng oxy hóa là các ch t
Chúng
et al. 2003) [25]

n ho c làm ch m quá trình oxy hóa.

y này b ng cách kh

c t do (Guerin, Huntley

c ch ng minh là ch t ch ng oxy hóa sinh h c,

b o v t bào và mô t các tác h i c a các g c t do (Maiani, Caston et al. 2009) [42].
Trong carotenoid, -carotene có hi u qu trong vi c b o v màng lipid c a t bào
kh i tác h i c a các g c t do (Britton 1995) [14], bên c

im ts

i b oxy t t nh t, lutein và
zeaxanthin có hi u qu trong vi c lo i b các g c t
bào (Smith 1998) [61].

nc at


Ti n ch t vitamin A
-carotene

c bi

n v i tên g i là ti n ch t vitamin A (Lampert,
, -carotene b phân c t

Holzschuh et al. 2003) [35]
cacbon trung tâm t o thành hai phân t

retinal b

(Biesalski, Chichili et al. 2007) [13]. Retinal ti p t
thành retinol. Retinol t o thành có th
ru t hay s

c chuy n hóa b i enzyme

c h p thu tr c ti p t th

c v n chuy n nh liên k t v

n thi t ho c

id

c n, retinyl este

c th y phân thành retinol t do và acid h
th

gi a m ch

c h p th . Quá trình

c enzyme d ch t y xúc tác, axit h

ng là acid

palmitat chi m thành ph n ch y u trong retinyl este th c ph m. Quá trình chuy n hóa
-carotene

c ki m soát ch t ch nên không t

n

ng v t c n -carotene trong su t quá

th

ng c a mình, song b n thân chúng l i không có kh
mà ch y u thu nh

Hình 2.2

ng h

ng tiêu hóa (Fujisawa, Watanabe et al. 2008) [21].

chuy n hóa -carotene thành vitamin A

c


ng th giác
Trong máu phân t

i d ng retinol s chuy n hóa thành retinal.

Trong bóng t i, retinal k t h p v
t nh y c m v i ánh sáng

t o thành Rhodopsin

võng m c m t, giúp võng m c nh

u ki n thi

m ts c

c các hình nh
i b phân h y thành

opsin và trans-retinal, r i tran[72]. Bên c

tr l i cis-retinol (Wolf 2001)
ra r ng -carotene có kh

t s nghiên c

làm ch m s ti n tri n c a b

m vàng làm gi m thi

mù lòa (Snodderly 1995; Gordon and Schooff 2002) [62, 24]. Vi c thi u h t
vitamin A gây ra m t lo

iv

ng

nhi u nh t là m t. M t trong nh ng bi u hi

u tiên là s suy gi m th l

nh quáng gà (kh

m m

n

chi u sáng th p)

(Roncone 2006) [56].
Gi m thi u các b nh v tim m ch

Theo WHO, b nh tim m

guyên nhân t

u

trên toàn th gi i và chi m nhi u nh t
ch t do b

t qu nhi

n. M

i
i

t rét và HIV c ng l i

(Moran, Forouzanfar et al. 2014) [47]

ca t vong do các b nh tim

m ch là 13,3 tri u ca chi

u

i chi m 31,5% t ng s ca t vong trên toàn th gi i (Mendis, Shanthi; et al.
2014) [44]. B nh tim m ch bao g m các b
m ch vành và nh
do s

ng m

(GBD 2015) [22]. B nh tim m

c hình thành

u s n ph m oxy hóa gây nên (Singh, Dhalla et al. 1995) [59],

c bi t là quá trình oxy hóa lipoprotein t tr ng th p (LDL) do ROS d
thành các m ng bám trên thành m
2000) [19].

ng

n hình

a thành m ch (Dhalla, Temsah et al.

ng chính c a -carotene t i các b nh tim m ch là ch ng l i quá

trình oxy hóa, do -carotene

c v n chuy n trong các lipoprotein t tr ng th p

tr c ti p c ch quá trình oxy hóa c a LDL (Reaven, Ferguson


et al. 1994) [53]. Chính vì th
ph m giàu carotene

ng khuy n các s d ng các th c

phòng ng a và ch a tr các b nh v tim m ch.

ab
Oxy là y u t không th thi
t

i v i cu c s ng. Khi các t bào s d ng oxy

ng, các s n ph m ph

ct

t h qu c a ATP

(adenosine triphosphate) s n xu t b i các ty th và l p th . Nh ng s n ph m ph
ng là ch

n ng (RNS).

vai trò kép v a có l i, v a có h

i v i có th .

m

t
th p ho c trung bình,

ROS và RNS phát huy tác d ng có l i trên các ph n ng c a t bào và ch
mi n d ch.

n

cao, chúng t o ra s

ng oxy hóa có th làm h ng t t

c các c u trúc t bào gây nên các sai h ng (Young and Woodside 2001, Lien Ai
Pham-Huy, Hua He et al. 2008) [76, 39]. Nh
t bào ho c m t nhóm t bào d

ns

kh i U (Cooper GM 1992) [16]. -carotene
u khi

t bi

ng c a t

m t

m soát hình thành các
ng m nh m vào t
u hòa bi u hi

lên các t bào mi n d ch, h n ch các sai khác b

ng

ng d n t i s phát tri n

-carotene

không ng ng c a t
ng: M

ng x y ra

ng vào quá trình oxy hóa t bào do tính ch t ch ng oxy

hóa m nh, hai là chúng tham gia vào quá trình bi t hóa và phân chia t bào (Heller,
Descamps et al. 1998) [27].
2.1.2.2
-carotene
-carotene có tính ch ng oxy hóa m
ng a b

.
ng h mi n d

nh tim m ch và các b nh mãn tính khác chính vì v y
c ng d ng r

h v c th c ph m, m ph

c

ph m (Luis Carlos Mata-Gómez, Julio César Montanez et al. 2014) [40].
có hai m ng ng d ng l n là màu th c ph m và th c ph m b sung. Trong công
nghi
ngoài ch

c ph m, -carotene

c s n xu

id

c ch t, s d ng b sung

i. Trong ngành công nghi p m ph m, -carotene

c thêm vào v i tác d ng b o v da ch ng l i tác h i c a UV (Del Campo,


Moreno et al. 2000) [17]. T
màu s c nên -carotene

c màu th c ph m, do có kh
c s d ng là ch t b sung màu cho các th c ph m t

tr ng gà, th t gà, cá.

ng th i bên c nh các thu c tính màu s c,

-carotene còn có tác d ng b o qu n th c ph m, là ngu n cung c p ch t ch ng oxy

hóa cho th c ph m. Ngoài ra, s d ng -carotene t ngu n vi t o có th t n d ng
ng ch t khoáng có trong vi t

ng hóa trong t bào và

. Vi c s d ng -carotene làm màu th c ph m ngày nay r t ph bi n và
không

c h i cho s c kh e
u s d ng -carotene

Trong nh
báo cáo c a công ty nghiên c u th

ng BCC, th

Theo

ng dành cho

1,2 t
nhu c u s d ng -carotene chi m t tr ng cao nh t v i 262 tri
2010; v i m

ng bình quân h

ki

u USD (BCC 2011) [11] (Hình 2.3).

Hình 2.3: Bi

kh o sát th

ki

t


-carotene

ng nhu c

c s n xu t b

ó

là t ng h p hóa h c và chi t xu t t t nhiên. Nh ng nghiên c u g
vi c s d ng -carotene t ng h p hóa h c
ng bi

n hi n
-carotene t

ng l i s

a ung

n ph m -carotene t

Bên c
m

li

i nhi m s c th , d

nhiên l i có kh

song

y

công nghi p thì ngu n cung -carotene t

m là

ph thu c th i v , ph c t p trong xây d ng và qu n lý vùng nguyên li u. S chênh
l ch v giá gi a -carotene t nhiên (1000-2000 USD/kg) và -carotene t ng h p
hóa h c (400-800 USD/kg) (Tawfiq Abu-Rezq S., Suad Al-Hooti et al. 2010) [67]
ng chuy n hóa -carotene t

c
nhiên.
2.1.3

-carotene
T t c các carotenoid nói chung và -carotene nói riêng quá trình sinh t ng

h

ng isopr

ng t ng h

thành ba giai: (1)

c chia

phân 5 cacbon (C5) g m IPP và DMAPP, (2)

n hình thành các h p ch t C40, (3)

i chu i C40 trong h th ng các

t o thành -carotene
n m t: Sinh t ng h p các ch
ra

n DMAPP và IPP di n

ng riêng bi

ng non-

mevalonate (MEP).
Sinh v t nhân chu
CoA thành IPP, ti
m ts

ng h p ngo i l

DMAPP qua ph n

ng s d

chuy n hóa acetyl-

ng phân hóa IPP thành DMAPP. Sinh v
ng s d

u tiên gi a pyruvateandglyceraldehyde-3-

phosphate. Th c v t và Streptomycetes thì s d ng c
Min Park et al. 2007) [74].
ng MAV

s n xu t IPP và

ng (Yoon, Hye-


ng MAV l

c phát hi n b i Bloch và Lynen vào nh ng

(Lynen, 1967) [41]. Trong
s k th pl iv

ng này, hai phân t acetyl-

t o thành acetoacetyl-

CoA th

tc

beta-methylglutaryl-CoA (HMG
CoA reductase, HMG

CoA).

u tiên

t phân t acetylt o thành beta-Hydroxyi s xúc tác c a enzyme HMG

c chuy n hóa thành mevalonate. Mevalonate sau

c phosphoryl hóa hai l

t o ra IPP (Isopentenyl
ng phân hóa thành m t isoprene khác là

DMAPP (Dimethylallyl pyrophosphate) nh s xúc tác c a enzyme IPP isomerase.

Hình 2.4: Sinh t ng h p

ng MAV

ng MEP

c khám phá, các nhà khoa h

u và

E. coli và S. chromofuscus

ng sinh

phát hi n m t s lo i vi khu
t ng h p carotenoid không ph thu
non-mevalonate hay còn g

c g i là
ng này quá trình sinh t ng h p


IPP và DMAPP không c

u tiên là ph n

gi a

pyruvate v i glyceraldehyde-3-phosphate t o thành DXD nh xúc tác c a DXD
synthetase, t ng h p ch t trung gian không nh
E. coli và A. thaliana làm

t ng h p thiamine và pydoxol. DXD có th
ti n ch t cho các h p ch

n ra m t lo t các ph n ng chuy n hóa

thành MEOP, MEP và t o

ng MEP không có m t trong

ng v

u trong vi khu n gây b nh và kí sinh trùng

Hình 2.5: Sinh t ng h

ng MEP

n hai: Hình thành các h p ch t C40.
DMAPP l

n ti p theo này,

t thêm IPP vào nh enzyme IPP prenyltransferases t o nên các

diphosphate tuy n tính geranyl pyrophosphate (GPP, C10, monoterpenoids), các
phân t

c liên k t v

t o thành các fanesy pyrophosphate
p t c liên k t v

t o thành
n t o carotenoid

b

u v i s t o thành các h p ch

u tiên phyotene t hai phân t GGPP


Hình 2.6: Quá trình sinh t ng h p carotenoids t IPP và DMAPP

c t o thành

d

ng phân 15C, có ba n

liên h p, không có màu s chuy n hóa ti p t c b ng nh ng ph n ng dehydro hóa
t o s n ph m là lycopene

Hình 2.7: Quá trình chuy n hóa phyopene thành lycopene

Sau cùng, lycopene ti p t
ph

- carotene, -carotene, - carotene

m t ho

u t o ra các s n

Hình 2.8: T ng h p -carotene t lycopene

2.1.4

-carotene
Ngu n cung c p -carotene

i có th là t t c các ngu n có ch a

carotenoid bao g m t th c v t, t o, n m hay t ng h p hóa h c. Tuy nhiên, 80-90%
ngu n cung c p -carotene
carotene có th

i là t th c ph m. Trong công nghi p, -

c t ng h p hóa h c hay lên men t vi sinh v t tùy t ng m c

2.1.4.1
cung
Ngu n cung c p -carotene ch y

i là t các lo i rau, c , qu

(Maiani, Caston et al. 2009) [42]. Các th c ph m có ch

ng -carotene cao

t, khoai lang (Desobry, Netto et al. 1998) [18]
carotene liên quan m t thi

n ki u gen trong các gi ng trái cây và rau c khác

nhau (Maiani, Caston et al. 2009) [42]
-carotene

[51]. Hi n nay

i có th d dàng thu nh n tr c ti p
ng. S h p thu -carotene ch u

m ts y ut

ng -

bi n th c ph m và n
quy mô công nghi

ng

ng (Parker, Swanson et al. 1999)

có nhi u quy trình thu -carotene t th c

c xây d ng và thành công. -carotene trích ly t cà r t (v i kho ng 34%

v
d

ng phân cis, còn l i là 66%

qu g c v i s n ph m

d

ng phân trans -carotene) ho c t

d ng d u g c (ANS 2012) [5].

mc a

c thu c vào th i v , quy trình tinh ch ph c t p, th i gian
dài và hi u su t không cao (Smith 1998) [61].


B ng 2.1

ng carotenoid có trong th c v t (Hà Th Bích Ng c, Tr n

Th Huy n Nga et al. 2007)

2.1.4.2

cung
ng h p -carotene

M t s loài vi sinh v
khu n có kh

t s loài vi

p, vi t o, n m (Heller, Descamps et al. 1998) [27]

có th thu nh n -carotene t vi sinh v

i

c thu -carotene t vi sinh

s d

v t là thu sinh kh i, có th tách chi t t sinh kh i ho c s d ng tr c ti p tùy thu c yêu c u
ch

ng -carotene (Heller, Descamps et al. 1998) [27]. -carotene t vi sinh v t ch

y

c s d ng trong công nghi p làm ch t ph gia th c ph m, th

(Hyung Seok Choi, Sang Yup Lee et al. 2010) [28].
các vi sinh v t ch t ng h p m

ng nh

chúng. Chính vì v y, ngày nay các nhà khoa h
i ch t c a vi sinh v t

ng các k thu t khác nhau tác
chuy n chuy

s lo i vi sinh v t s n xu t ra h p ch t mong mu n. B
c t ng h
1991) [45] và
t ng h p carotene b

-carotene cho b n thân

ng, kích thích m t

u t th

u tiên trên Z. mobilis, A. tumefaciens (Misawa, Yamano et al.
E. coli (Lee, Momen et al. 2003) [36] không mang gene sinh
t DNA tái t h p. Có b n y u t quy

s n xu t -carotene tái t h
(ch t n n cho ph n ng), th

t cao: Th nh t là cung c
hai là c n có s

cân b

nh thành công c a
các ti n ch t
các enzyme


có th chuy n hóa t

là k t h p v

o ra các h p ch t trung gian, th ba

gi m thi u s tích t các các ch

cu i cùng, th

t ch ph

ng ch t

ng t ng h p isoprenoids và kh

-carotene cao (Sies and Stahl 1998) [58].
2.1.4.3

cung
c t ng h p C40 carotenoid là s d
Witting gi a C10- dialdehyde v i hai phân t C15-

t o nên c

ix

c hi n ph n

ix

ng phân hóa và k t tinh t o nên

C40 hoàn ch nh.

u qu

d

c ng

n cu i cùng c a công nghi p t ng h p carotenoid. Trong s

600 lo i carotenoid

c tìm th y thì có 8 lo

c t ng h p hóa h c trên quy mô công

nghi p. Các carotenoid này bao g m lycopene, lutein, zeaxanthin,
canthaxanthin, astaxanthin, s d ng làm ch t ph gia th

- cryptoxanthin. Nh ng s n ph
c bi

-carotene,
c
m và th y

s n (Ernst 2002) [20].
-carotene b

c t ng h p hóa h c t nh

ty là Hofman La Roche (Th y s
t kho ng 500 t n/

c), chi m kho ng 70% s

ng th gi i,

.

T ng h p hóa h c b i Công ty BASF d a trên ph n ng c
hi n b i Badische Anilin và Soda-Fabrik (BASF). Quá trình t ng h
cách n i hai phân t

y u b i hai công

i x ng v i nhau qua trung tâm.

Hình 2.9:

t ng h p - carotene c a BASF

c th c
c th c b ng