Cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc Aspergillus niger nhằm tăng khả năng hồi tính của phytase sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao

Header Page 1 of 27.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đặng Thị Kim Anh

CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC
Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA
PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2015

Footer Page 1 of 27.


Header Page 2 of 27.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đặng Thị Kim Anh

CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC
Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA
PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. Vũ Nguyên Thành
TS. Trần Văn Tuấn

Hà Nội – Năm 2015

Footer Page 2 of 27.


Header Page 3 of 27.

Luận văn thạc sĩ

Lời cảm ơn
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Vũ Nguyên Thành,
Thầy đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực
hiện luận văn này. Thầy cũng chính là tấm gƣơng đầy nhiệt huyết, say mê
nghiên cứu khoa học giúp tôi tiếp cận, trau dồi kiến thức mới từ đó có thể
định hƣớng, giải quyết các vấn đề trong quá trình nghiên cứu.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS. Trần Văn Tuấn cùng các thầy, cô
giáo trong Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình
giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại trƣờng.
Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi cũng nhận đƣợc rất nhiều sự
quan tâm giúp đỡ của các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa
sinh. Tôi xin chân thành cảm ơn.

Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị nghiên cứu
viên và các bạn sinh viên làm việc tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp,
Viện Công nghiệp Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập và làm việc tại Trung tâm.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn ở bên, khích
lệ động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 25 tháng 06 năm 2015
Học viên

Đặng Thị Kim Anh

K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 3 of 27.

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 4 of 27.

Luận văn thạc sĩ

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 21
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN ............... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.1. AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE ...................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.2. ENZYME PHÂN GIảI PHYTATE (PHYTASE) ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.2.1. Phân loại enzyme phytase ...........................Error! Bookmark not defined.
1.2.2. Nguồn phytase............................................Error! Bookmark not defined.
1.3. ỨNG DụNG CủA PHYTASE .......................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

1.3.1. Trong chăn nuôi ..........................................Error! Bookmark not defined.
1.3.2. Trong công nghệ thực phẩm .......................Error! Bookmark not defined.
1.3.3. Trong công nghiệp giấy ..............................Error! Bookmark not defined.
1.3.4. Trong cải tạo đất.........................................Error! Bookmark not defined.
1.3.5. Trong tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol phosphateError! Bookmark not
defined.
1.4. CÁC NGHIÊN CứU TÁCH DÒNG BIểU HIệN PHYTASE TRÊN THế GIớI........... ERROR!
BOOKMARK NOT DEFINED.
1.5. CÁC NGHIÊN CứU Về ENZYME PHYTASE ở VIệT NAM.. ERROR! BOOKMARK NOT
DEFINED.

1.6. CấU TRÚC PROTEIN LIÊN QUAN ĐếN KHả NĂNG HồI TÍNH CủA PHYTASE Từ A. NIGER
VÀ A. FUMIGATUS ............................................. ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
CHƢƠNG 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ERROR!
BOOKMARK NOT DEFINED.
2.1. NGUYÊN LIỆU ....................................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
2.1.1. Hóa chất ......................................................Error! Bookmark not defined.
2.1.2. Vi sinh vật ...................................................Error! Bookmark not defined.
2.1.3. Thiết bị ........................................................Error! Bookmark not defined.
2.1.4. Môi trường nuôi cấy ...................................Error! Bookmark not defined.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
2.2.1. Phương pháp Mega-PCR............................Error! Bookmark not defined.
2.2.2. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit GenJETTM Gel
Extraction ..................................................................Error! Bookmark not defined.
2.2.3. Ghép nối plasmid ........................................Error! Bookmark not defined.

K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 4 of 27.

Đặng Thị Kim Anh

Header Page 5 of 27.

Luận văn thạc sĩ

2.2.4. Biến nạp sản phẩm ghép nối plasmid vào E. coli bằng sốc nhiệt .....Error!
Bookmark not defined.
2.2.5. Tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid
Miniprep ....................................................................Error! Bookmark not defined.
2.2.6. Chuyển gen vào tế bào nấm men Pichia pastoris bằng phương pháp biến
nạp xung điện ............................................................Error! Bookmark not defined.
2.2.7. Tách chiết DNA tổng số của Pichia pastorisError! Bookmark not defined.
2.2.8. Phương pháp nuôi biểu hiện nấm men Pichia pastoris .. Error! Bookmark
not defined.
2.2.9. Phương pháp điện di protein SDS - PAGE.Error! Bookmark not defined.
2.2.10. Xác định hoạt tính phytase .......................Error! Bookmark not defined.
2.2.11. Lọc enzyme bằng thiết bị Viva Flow 200 ..Error! Bookmark not defined.
2.2.12. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký tương tác kỵ nước .....Error!
Bookmark not defined.
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬNERROR!
DEFINED.

BOOKMARK

NOT

3.1. CẢI BIẾN TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PHYTASE .. ERROR! BOOKMARK NOT
DEFINED.

3.1.1. Phân tích đặc tính các gen phyA đã được tách dòng tại Viện Công nghiệp
Thực phẩm liên quan tới tính bền nhiệt ....................Error! Bookmark not defined.
3.1.2. Tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin bằng Mega-PCRError! Bookmark
not defined.
3.1.3. Tạo plamid chứa gen phyA-P12 mang đột biến điểmError! Bookmark not
defined.
3.2. CHUYỂN GEN PHYA VÀO TẾ BÀO NẤM MEN PICHIA PASTORISERROR!
BOOKMARK NOT DEFINED.
3.2.1. Chuyển gen vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phương pháp biến nạp
xung điện ...................................................................Error! Bookmark not defined.
3.2.2. Kiểm tra gen mã hóa phytase trong genome của Pichia pastoris .....Error!
Bookmark not defined.
3.2.3. Sàng lọc các thể biến nạp sinh phytase tái tổ hợp .... Error! Bookmark not
defined.
3.3. THU HỒI VÀ TINH SẠCH ENZYME PHYTASE TÁI TỔ HỢP ........ ERROR!
BOOKMARK NOT DEFINED.
K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 5 of 27.

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 6 of 27.

Luận văn thạc sĩ

3.4. XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME PHYTASE TÁI TỔ HỢP SAU
KHI CẢI BIẾN GEN ....................................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
3.4.1. Xác định pH tối ưu của phytase tái tổ hợp .Error! Bookmark not defined.
3.4.2. Kiểm tra độ bền với các dải pH của phytase tái tổ hợp . Error! Bookmark

not defined.
3.4.3. Xác định nhiệt độ tối ưu của phytase tái tổ hợp ....... Error! Bookmark not
defined.
3.4.4. Kiểm tra khả năng hồi tính của phytase tái tổ hợp sau khi bị biến tính ở
nhiệt độ cao ...............................................................Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN ............................................ ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
KIẾN NGHỊ ........................................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 22
PHỤ LỤC ............................................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 6 of 27.

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 7 of 27.

Luận văn thạc sĩ
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AOX1

Alcohol Oxidase 1

APS

Ammonium Persulfate

BMGY

Buffered Glycerol Complex Medium

BMMY

Buffered Methanol Complex Medium

cDNA

complementary Deoxyribonucleic acid

CNTP

Công nghiệp thực phẩm

DNA

Deoxyribonucleic acid

EC

Enzyme Commission

FTU

Đơn vị hoạt tính phytase

HIV

Human Immunodeficiency Virus

IU

International Unit

kb

Kilobase

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria-Bertani medium
Northern Regional Research Laboratory

NRRL

(hiện là National Center for Agricultural Utilization Research)
(Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ)

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic acid

rpm

Revolutions per minute

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

SSC

Saline Sodium Citrate

TAE

Tris-Acetate-EDTA

TBE

Tris-Borate-EDTA

TCA

Trichloroacetic acid

TEMED

Tetramethylethylenediamine

YPD

Yeast Extract-Peptone-Dextrose

YPDS

Yeast Extract-Peptone-Dextrose-Sorbitol

K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 7 of 27.

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 8 of 27.

Luận văn thạc sĩ
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................................... 19
Bảng 2.2. Danh sách các chủng phục vụ trong nghiên cứu tách dòng gen mã hóa
phyA ......................................................................................................................... 20
Bảng 2.3. Thành phần gel chạy điện di protein ....................................................... 27
Bảng 2.4. Tƣơng quan giữa hàm lƣợng phospho vô cơ và OD700nm........................ 28
Bảng 3.1. Hoạt tính phytase tái tổ hợp của các thể biến nạp nuôi biểu hiện trên vi
đĩa 24 giếng .............................................................................................................. 41
Bảng 3.2. Hiệu suất thu hồi enzyme phytase tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lọc luân
hồi Viva Flow 200 với kích thƣớc màng 5 kDa ....................................................... 42

K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 8 of 27.

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 9 of 27.

Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của myo-inositol - 1, 2, 3, 4, 5, 6 - hexakis dihydrogen
phosphate (axit phytic) ............................................................................................. 3
Hình 1.2. Cấu trúc protein của 4 nhóm enzyme phytase......................................... 5
Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của enzyme phytase từ Aspergillus fumigatus............. 14
Hình 1.4. Các cấu trúc đóng vai trò trong khả năng hồi tính của phytase
A. fumigatus.............................................................................................................. 16
Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc của vector pPICZαA, B, C .............................................. 18
Hình 2.2. Phƣơng pháp Mega-PCR cơ bản ............................................................. 22
Hình 3.1. Mô tả thí nghiệm tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin trên gen phyA
.................................................................................................................................. 31
Hình 3.2. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 1 trên gel agarose 1%
trong đệm TAE ×0.5 ................................................................................................ 32
Hình 3.3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 2 trên gel agarose 1%
trong đệm TAE ×0.5 ................................................................................................ 33
Hình 3.4. Kết quả biến nạp sản phẩm ghép nối gen phyA mang 4 đột biến điểm vào
vector pPICZαA ....................................................................................................... 34
Hình 3.5. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt giới hạn trên gel agarose 1% trong đệm
TAE ×0.5 .................................................................................................................. 35

Hình 3.6. Kết quả phân tích trình tự 5 plasmid pPICZαA/phyA/AAS1 - 5 sau khi
tạo đột biến điểm bằng phần mềm Bioedit 7.2.5 ..................................................... 36
Hình 3.7. Trình tự gen mã hóa phyA bền nhiệt từ Aspergillus niger CNTP 5131 và
vị trí liên kết trong pPICZαA của chủng tái tổ hợp Pichia pastoris CNTP 9057 .... 37
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn bằng MssI trên gel agarose 1%
trong đệm TAE ×0.5 ................................................................................................ 39
Hình 3.9. Kết quả biến nạp vector pPICZαA/phyA/P12 và pPICZαA/phyA/AAS5
vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phƣơng pháp xung điện ................................ 39
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng cặp mồi T-phyA-EcoRI-F/ phyAStop-XbaI-R2 trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5 ........................................ 40
Hình 3.11. Kết quả điện di phytase tái tổ hợp trên gel SDS – PAGE 12% ............. 43
Hình 3.12. Xác định pH tối ƣu của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin ....
.................................................................................................................................. 45
Hình 3.13. Đánh giá độ bền pH của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin
.................................................................................................................................. 46
K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 9 of 27.

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 10 of 27.

Luận văn thạc sĩ

Hình 3.14. Xác định nhiệt độ tối ƣu của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit
amin .......................................................................................................................... 47
Hình 3.15. Đánh giá độ bền nhiệt của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit
amin .......................................................................................................................... 48

K21-Sinh học thực nghiệm

Footer Page 10 of 27.

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 11 of 27.

Luận văn thạc sĩ

MỞ ĐẦU
Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng phospho dự trữ chủ yếu
của thực vật. Axit phytic có thể chiếm 65 – 80% lƣợng phospho trong các loại ngũ
cốc, hạt các cây họ đậu và họ cải. Ngoài chức năng dự trữ phospho, axit phytic còn
liên kết chặt chẽ với các nguyên tố khoáng nhƣ Ca, Mg, Fe, Zn ... Axit phytic có
tính chất kháng tiêu hóa do khả năng liên kết với các protein, enzyme trong dịch
tiêu hóa của động vật.
Enzyme

phytase

(myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate

phospho-

hydrolase) có vai trò quan trọng trong chăn nuôi. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy
phân axit phytic thành những gốc phospho đơn vô cơ và các dẫn xuất đơn giản của
myo-inositol. Do vậy, khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, phytase không chỉ có tác
dụng làm tăng khả năng hấp thu phospho, các nguyên tố khoáng mà còn cải thiện
khả năng tiêu hóa các hợp chất khác, đồng thời làm giảm lƣợng phospho thải ra
ngoài, góp phần bảo vệ môi trƣờng.

Phytase thƣơng phẩm hiện nay đƣợc sản xuất chủ yếu dựa trên nguồn gen từ
nấm mốc Aspergillus niger. Phytase từ A. niger có một số ƣu điểm nhƣ hoạt động ở
pH thấp, phù hợp với môi trƣờng axit của dịch dạ dày, có tính đặc hiệu cơ chất với
phytate cao, và bền với tác động của pepsin. Phytase từ A. niger có nhƣợc điểm là
kém bền nhiệt. Trong công đoạn ép viên, thức ăn chăn nuôi thƣờng đƣợc gia nhiệt
tới 70-80°C để diệt Salmonella. Chính vì vậy, enzyme bổ sung vào thức ăn chăn
nuôi phải đáp ứng yêu cầu về độ bền nhiệt.
Để đáp ứng yêu cầu kỹ thuật ngày càng cao, enzyme công nghiệp thƣờng đƣợc
cải biến theo hƣớng thay đổi cấu trúc nội tại. Một số nghiên cứu cấu trúc của
phytase bền nhiệt từ A. fumigatus cho thấy liên kết hydro và tƣơng tác ion trong cấu
trúc không gian có vai trò đảm bảo khả năng “đàn hồi” nhiệt của enzyme. Phytase
của A. niger không có những liên kết này nên dễ dàng bị bất hoạt và không có khả
năng hồi tính. Việc cải biến trình tự axit amin của phytase có thể gia tăng tính “đàn
hồi” nhiệt của enzyme.
Một trong những hƣớng nghiên cứu đƣợc thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật
Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm là khai thác nguồn gen thiên nhiên Việt
Nam nhằm tạo enzyme tái tổ hợp phục vụ ứng dụng trong chăn nuôi. Với phytase,
đã có 24 gen từ các loài khác nhau thuộc chi Aspergillus đƣợc tách dòng và nghiên
K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 11 of 27.

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 12 of 27.

Luận văn thạc sĩ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt

1. Nguyễn Thùy Châu, (2009), “Hoàn thiện công nghệ sản xuất enzym phytaza để
bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và phục vụ một số ngành công nghiệp”, Báo cáo
dự án khoa học kỹ thuật-Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Viện Cơ
điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch.
2. Vũ Duy Giảng, (2004), “Enzyme thức ăn”, Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn
chăn nuôi, 3, tr. 11-13.
3. Đỗ Thị Ngọc Huyền, (2007), Nghiên cứu tính chất phytase tự nhiên và tái tổ
hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam
4. Đỗ Hữu Phƣơng, (2004), “Vai trò của enzyme trong chăn nuôi”. Đặc san khoa
học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, 1, tr. 25-26.
5. Nguyễn Văn Viết, (2008), Nghiên cứu biểu hiện gene phyC có nguồn gốc từ
Bacillus subtilis trên E. coli BL21 (DE3) và bước đầu ứng dụng enzyme tái tổ
hợp cho chăn nuôi, Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, Trƣờng đại học Sƣ
phạm Hà nội.
6. Ngô Thanh Xuân, Mai Thị Hằng, Nguyễn Phƣơng Linh, Đinh Thị Mỹ Hằng,
Vũ Nguyên Thành, (2012), “Phân tích trình tự gene (phyA) mã hóa phytase
thành thục từ một số chủng Aspergillus niger”, Tạp chí Công nghệ Sinh học,
10(1), tr. 115-122.
Tiếng anh
7. Anderson R. J., (1914), “A contribution to the chemistry of phytin”, J. Biol.
Chem., 17, pp. 171 –190.
8. Anno T., Nakanishi K., Matsuno R., Kamikubo T., (1985), “Enzymatic
elimination of phytate in soybean milk”, J. Japan Soc. Food Sci. Techno.l, 32,
pp. 174-180.
9. Baruah K., Pal A. K., Sahu N. P., Jain K. K., Mukherjee S. C., Debnath D.,
(2005), “Dietary protein level, microbial phytase, citric acid and their
K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 12 of 27.

22

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 13 of 27.

Luận văn thạc sĩ
interactions on bone mineralization of Labeo rohita (Hamilton) juveniles”,
Aquacult. Res., 2005, 36, pp. 803–812.

10. Baruah K., Sahu N. P., Pal A. K., Debnath D., Yengkokpam S., Mukherjee S.
C., (2007), “Interactions of dietary microbial phytase, citric acid and crude
protein level on mineral utilization by Rohu, Labeo rohita (Hamilton),
juveniles”, J. W. Aquacult. Soc., 38, pp. 238–249.
11. Billington D. C., (1993), “The Inositol Phosphates. Chemical Synthesis and
Biological Significance”, Verlag. Chemie. Weinheim., 26, pp. 38-42.
12. Cheng C., Lim B. L., Turner B. L., Richardson A. E., Mullaney E. J., (2005),
“Beta-propeller phytases in the aquatic environment: characterization of a
novel phytase from Shewanella oneidensis MR-1. In Inositol Phosphates in the
Soil-Plant-Animal

System:

Linking

Agriculture

and

Environment”.

Proceedings of the Bouyoucos Conference to Address the Biogeochemical
Interaction of Inositol Phosphates in the Environment; USA, pp. 55–56.
13. Copper J. R., Gowing H. S., (1983), “Mammalian small intestine phytase”, Br.
J. Nutr., 50, pp. 673-678.
14. Correa R. L. T., Queiroz V. M., Araujo F. E., (2014), “Cloning, recombinant
expression and characterization of a new phytase from Penicillium
chrysogenum”, Microbiol. Res., pp. 201-213
15. Craxton A., Caffrey J. J., Burkhart W., Safrany S. T., Shears S. B., (1997)
“Molecular cloning and expression of a rat hepatic multiple inositol
polyphosphate phosphatase”, Biochem. J., 328, pp. 75-81.
16. Dalal R. C., (1978), “Soil organic phosphorus”, Adv. Agronom., 29, pp. 83–
117.
17. Davies N. T., Vahoung G. V. and Kritchevsky D., (1982), “Effects of phytic
acid on mineral availability”, In Dietary Fiber in Health and Disease, Eds.
Plenum Press, New York, pp. 125-138.
18. Dawei F., Huoquing H., Huiying L., Yaru W., Peilong Y., Kun M., (2008), “A
highly pH-stable phytase from Yersinia kristeensenii: Cloning, expression, and
characterization”, Enz. Microbiol. Tech., 42, pp. 499-505.
K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 13 of 27.

23

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 14 of 27.

Luận văn thạc sĩ

19. Debnath D., Pal A. K., Sahu N. P., Jain K. K., Yengkokpam S., Mukherjee S.
C, (2005), “Effect of dietary microbial phytase supplementation on growth and
nutrient digestibility of Pangasius pangasius (Hamilton) fingerlings”,
Aquacult. Res., 36, pp. 180–187.
20. Deshpande S. S., Cheryan M., (1984), “Effect of phytic acid, divalent cations,
and their interactions on alpha-amylase activity”, J. F. Sci., 49, pp. 516-524.
21. Ellestad L. E., Angel R., Soares J. H., (2002), “Intestinal phytase II: A
comparison of activity and in vivo phytate hydrolysis in three teleost species
with differing digestive strategies”, Fish. Physiol. Biochem., 26, pp. 259–273.
22. Findenegg G. R., Nelemans J. A., (1993), “The effect of phytase on the
vailability of P from myo-inositol hexaphosphate (phytate) for maize roots”,
Plant Soil, 154, pp. 189-196.
23. Forsberg C. W., Phillips J. P., Golovan S. P., Fan M. Z., Meidinger R. G.,
Ajakaiye A., Hilborn D., Hacker R. R., (2003), “The enviropig physiology,
performance, and contribution to nutrient management advances in a regulated
environment: the leading edge of change in the pork industry”, J. Anim. Sci.,
81, pp. 68–77.
24. Freund W. D., Mayr G. W., Tietz C., Schultz J. E., (1992), “Metabolism of
inositol phosphates in the protozoan Paramecium”, Eur. J. Biochem., 207, pp.
359-367.
25. Greaves M. P., Anderson G., Webley D. M., (1967), “The hydrolysis of inositol
phosphates by Aerobacter aerogenes”, Biochem. Biophys. Acta., 132, pp. 412418.
26. Greiner R. and Konietzny U., (1996), “Construction of bioreactor to produce
special breakdown products of phytate”, J. Biotechnol., 1996, 48, pp. 153-159.
27. Hartig, T., (1885), “Uber das Klebermehl”, Bot. Z., 13, 881–882
28. Hartig T., Weitere M., (1856), “das Klebermehl (Aleuron) betreffend”, Bot. Z.,
14, 257 –269

K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 14 of 27.

24

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 15 of 27.

Luận văn thạc sĩ

29. Hegeman C. E. and Grabau E. A., (2001), “A novel phytase with sequence
similarity to purple acid phosphatases is expressed in cotyledons of
germinating soybean seedlings”, Plant Physiol., 126, pp. 1598–1608.
30. Hesampour A., Siadat S. E. R., Malboobi M. A., Mohandesi N., Arab S. S.,
Ghahremanpour M. M., (2014), “Enhancement of thermostability and kinetic
efficiency of Aspergillus niger phyA phytase by site direct mutagenesis”,
Appl. Biochem. Biotechnol., pp. 67-81.
31. Howson S. J., and Davis R. J., (1983), “Production of phytate-hydrolysing
enzyme by fungi”. Enzyme Microbiol. Technol., 5, pp. 377-382.
32. Inagawa J., Kiyosawa I., Nagasawa T., (1987), “Effect of phytic acid on the
hydrolysis of lactose with beta-galactosidase”, Agric. Biol. Chem., 51, pp.
3027-3032.
33. Irving G. C. J., Cosgrove D. J., (1971), “Inositol phosphate phosphatase of
microbial origin, Observations on the nature of the active center of a bacterial
(Pseudomonas sp.) phytase”, Austral. J. Biol. Sci., 24, pp. 1559-1564.
34. Jog S. P., Garchow B. G., Mehta B. D., Murthy P. P. N., (2005), “Alkaline
phytase from lily pollen: Investigation of biochemical properties”, Arch.
Biochem. Biophys., 440, pp. 133–140.

35. Laboure A. M., Gagnon J., Lescure A. M., (1993), “Purification and
characterization

of

a

phytase

(myo-inositol

hexakisphosphate

phosphohydrolase) accumulated in maize (Zea mays) seedlings during
germination”, Biochem. J., 295, pp. 413-419.
36. Li Z., Zhao A., Wang X., Jin X., Li J., Yu M., (2013), “Cloning, expression,
and functional characterization of a phytase from the genus Bacillus”, J. Mol.
Microbiol. Biotechnol., 23, pp.193-202.
37. Liu B. L., Rafiq A., Tzeng Y. M. and Rob A., (1998), “The induction and
characterization of phytase and beyond”. Enzyme Microbiol. Technol., 22, pp.
415-424.

K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 15 of 27.

25

Đặng Thị Kim Anh

Header Page 16 of 27.

Luận văn thạc sĩ

38. Mrudula V. U., Jalaja V., Ashok P., (2014), “Gene cloning and soluble
expression of Aspergillus niger phytase in E. coli cytosol via chaperone coexpression”, Biotechnol. Lett., 36, pp. 85-91.
39. Mullaney E., Sethumadhavan K., Stephanie B., Lei X. G., Ullah A. H. J.,
(2012), “Elimination of disulfide bridges in Aspergillus niger NRRl 3135
phytase (phyA) enhances heat tolerance and optimizes its temperature versus
activity profile”, Ad. Bio. Chem., 2, pp. 372 – 378.
40. Ngo Thanh Xuan, Mai Thi Hang and Vu Nguyen Thanh, (2009), “Cloning and
over expression of an Aspergillus niger XP phytase gene (phyA) in Pichia
pastoris”, World Academy of Science, Engineering and Technology, 56, pp.
750 – 753.
41. Nwanna L. C., Schwarz F. J., (2007), “Effect of supplemental phytase on
growth, phosphorus digestibility and bone mineralization of common carp
(Cyprinus carpio L)”, Aquacult. Res., 38, pp. 1037–1044.
42. Pandey A., Szakacs G., Soccol C. R., Rodriguez-Leon J. A., Soccol V. T.,
(2001), “Production, purification and properties of microbial phytases”,
Bioresour. Technol., 77, pp. 203-214.
43. Phillippy B. Q., Wyatt C. J., (2001), “Degradation of phytate in foods by
phytases in fruits and vegetable extracts”, J. F. Sci., 66, pp. 535–539.
44. Phillippy, B. Q., Bland, J. M., Evens, T. J., (2003), “Ion chromatography of
phytate in roots and tubers”, J. Agric. F. Chem., 51, 350–353
45. Raboy

V.,

(2003),

“myo-Inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphates”,

Phytochemistry, 64, 1033–1043
46. Rao D. E., Rao K. V., Reddy T. P., Reddy V. D., (2009), “Molecular
characterization, physicochemical properties, known and potential applications
of phytases: An overview”, Crit. Rev. Biotechnol., 29(2), pp. 182-98.
47. Reddy N. R., Pierson M. D., Sathe S. K., Salunkhe D. K., (1989), “Phytates are
cereals and legumes”, CRC Press. Inc. Boca Raton. Fla, pp. 218-227.
48. Rimbach G., Pallauf J., (1992), “The effect of a supplement of microbial
phytase on zinc availability”, Z. Ernahrungswiss, 31, pp. 269-277.
K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 16 of 27.

26

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 17 of 27.

Luận văn thạc sĩ

49. Sajjadi M., Carter C. G., (2004), “Effect of phytic acid and phytase on feed
intake, growth, digestibility and trypsin activity in Atlantic salmon (Salmo
salar, L)”, Aquacult. Nutr., 10, pp. 135–142.
50. Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T., (1989), Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New
York, pp. 123-128.
51. Sandberg A. S., Hulthen L. R., and Turk M., (1996), “Dietary Aspergillus
niger phytase increases iron absorption in humans”, J. Nutr., 126, pp. 476-480.

52. Shah V., Parekh L. J., (1990), “Phytase from Klebsiella sp. No. PG-2:
Purification and properties”, Indian J. Biochem. Biophys., 27, pp. 98-102.
53. Shieh T. R., Ware J. H., (1968), “Survey of microorganisms for the production
of extracellular phytase”, Appl. Microbiol., 16, pp. 1348-1351.
54. Shimizu M., (1992), “Purification and characterization of phytase from Bacillus
subtilis (natto) N-77”, Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, pp. 1266-1269.
55. Singh M., Krikorian A. D., (1982), “Inhibiton of trypsin activity in vivo by
phytate”, J. Agr. F. Chem., 30, pp. 799-805.
56. Siren M., (1995), “Method of treating pain using inositol triphosphate”, U.S.
Patent 5407924, pp. 23-28.
57. Siren M., (1998), “Use of an ester of inositoltriphosphate for the preparing of
medicaments”, U.S. Patent 5846957, pp. 21-28.
58. Tian S. W., Peng R. H., Xu J., Zhao W., Gao F., Fu X. F., Xiong A. S., Yao Q.
H., (2010), “Mutations in two amino acids in phyI1s from Aspergillus niger
113 improve its phytase activity”, World J. Microbiol. Biotechnol., 26,
pp.903-907.
59. Türk M., Sandberg A. S., Carlsson N., Andlid T., (2000), “Inositol
hexaphosphate hydrolysis from baker’s yeast. Capacity, kinetics, and
degradation products”, J. Agr. F. Chem., 48, pp. 100–104.
60. Ullah A. H. J., (1988), “Aspergillus ficuum phytase: partial primary structure,
substrate selectivity, and kinetic characterization”, Pre. Biochem., 18, pp. 459471.
K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 17 of 27.

27

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 18 of 27.

Luận văn thạc sĩ

61. Ullah A. H., Sethumadhavan K., Mullaney E. J., Ziegelhoffer T., AustinPhillips S., (2003), “Fungal phyA gene expressed in potato leaves produces
active and stable phytase”, Biochem. Biophy. Res. Co., 306(2), pp. 603-609.
62. Van Weerd J. H., Khalaf K. H. A., Aartsen F. J., Tussen P. A. T., (1999),
“Balance trials withAfrican catfish Clarias gariepinus fed phytase-treated
soybean mealbased diets”, Aquacult. Nutr., 5, pp. 135–142.
63. Viveros A., Centeno C., Brenes A., Canales R., Lozano A., (2000) “Phytase
and acid phosphatase activities in plant feedstuffs”, J. Agr. F. Chem., 48, pp.
4009–4013.
64. Vohra A., Satyanarayana T., (2001), “Phytase production by the yeast, Pichia
anomala”, Biotechnol. Lett., 23, pp. 551–554.
65. Volfova O., Dvorakova J., Hanzlikova A., Jandera A., (1994), “Phytase from
Aspergillus niger”, Folia Microbiol, 39, pp. 481-484.
66. Winterstein, E., (1897), “Uber einen phosphorhaltigen Pflanzenbestandteil,
welcher bei der Spaltung Inosit liefert”, Berichte. Deutsch. Chem. Ges., 30,
pp. 2299 –2302
67. Xiang T., Liu Q., Deacon A. M., Koshy M., Kriksunov I. A., Lei G. X., Hao
Q., Thiel D J., (2004), “Crystal structure of a heat-resilient phytase from
Aspergillus fumigatus, carrying a phosphorylated histidine”, J. Mol. Biol., 339,
pp.437-445.
68. Xiong A. S., Yao Q. H., Peng R. H., Han P. L., Li X., Fan H. Q., Guo M. J.,
Zhang S. L., (2004), “Isolation, characterization, and molecular cloning of the
cDNA encoding a novel phytase from Aspergillus niger 113 and high
expression in Pichia pastoris”, J. Biochem. Mol. Biol., 37(3), pp. 282-291.
69. Yan L., Li C., Chen H., Wu Q., Shan Z., Han X., (2013), “Site-directed
mutagenesis improves the thermostability and catalytic efficiency of
Aspergillus niger N25 phytase mutated by I44E, T252R”, Appl. Biochem.
Biotechnol., pp. 25- 37.

K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 18 of 27.

28

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 19 of 27.

Luận văn thạc sĩ

70. Yan W., Xiaorong G., Giao S., Wei W., Lijia A., (2007), “Cloning,
expression, and Enzyme characterization of an acid heatstable phytase from
Aspergillus fumigatus WY-2”, Current microbiology, 55, pp. 65-70.
71. Yin H. F., Fan B. L., Yang B., Liu Y. F., Luo J., Tian X. H., Li N., (2006),
“Cloning of pig parotid secretory protein gene upstream promoter and the
establishment of a transgenic mouse model expressing bacterial phytase for
agricultural phosphorus pollution control”, J. Anim. Sci., 84, pp. 513–519.
72. Yoon S. J., Choi Y. J., Min H. K., Cho K. K., Kim J. W., Lee S. C., Jung Y.
H., (1996), “Isolation and identification of phytase-producing bacterium,
Enterobacter sp. 4, and enzymatic properties of phytase enzyme, Enzyme
Microbiol. Technol., 18, pp. 449-454.
73. Zhang W., Mullaney J. E., Lei X. G., (2007), “Adopting selected hydrogen
bonding and ionic interactions from Aspergillus fumigatus phytase structure
improves the thermostability of Aspergillus niger PhyA phytase”, Applied and
enviromental Microbiology, pp. 3069-3076.
74. Zhong Y. M., Shun C. P., Jing J. J., Huang B., Mei Z. F., Zeng Z. L., (2011),
“A novel thermostable phytase from the fungus Aspergillus aculeatus RCEF

4894: gene cloning and expression in Pichia pastoris”, World J. Microbiol.
Biotechnol., 2011, 27, pp. 679-686.
75. />
K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 19 of 27.

29

Đặng Thị Kim Anh