Kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ fish

Kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ Fish








Là kĩ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào vi khuẩn.
Nhận ra các dạng vsv quen thuộc, đã biết môi trường nuôi cấy đặc hiệu.
Xác định các vsv lạ, chưa biết rõ điều kiện & môi trường nuôi cấy.
Hệ thống phức tạp của các quần thể sinh vật.
Kết hợp chính xác kĩ thuật di truyền phân tử .
Hình dung và nhận biết các tế bào vi khuẩn trong môi trường tự nhiên hay trong các mô bệnh.


Kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ Fish

 Mô tả quần thể vsv trong môi trường tự nhiên ( nổi bật trần tích Wadden, vịnh na-uy……).
 Trong y học: xác định các mầm bệnh có nguồn gốc từ vi khuẩn (hô hấp, tiêu hóa,….).
 Chuẩn đoán sự bất thường về cấu trúc và số lượng NST ( trước và sau sinh) của thai nhi.


Quy trình thực hiện

•

Dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của các loài vsv bằng cách dùng
đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc biệt với các trình tự đặc hiểu bổ
sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn ( không cần phá vỡ tế bào)

Quy trình gồm các bước cơ bản

•
•
•
•
•
•
•

Chuẩn bị mẫu và đầu dò.
Cố định mẫu.
Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào.
Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai.
Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang
trực tiếp).
Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả.



Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang

•

Đầu dò: Là những
olionucleotide dài từ 15 đến 30
bp, có trình tự bổ sung với các
rRNA 16S của tế bào vi sinh

vật


 Gần đây các trình tự đích khác như rRNA 23s,rRNA 18s hay mRNA cũng đã được
xác định thành công bởi thí nghiệm Fish.

 rRNA 16 S được sử dụng vì ổn định về mặt di truyền, số lượng bản sao nhiều và
cấu trúc dc bán bảo toàn

 đoạn gen rRNA 16S giúp cho việc nhận biết và định danh các loài vi sinh vật trở
nên dễ dàng và chính xác.


Đánh dấu huỳnh quang lên đầu dò
có 2 cách:

•
•

Trực tiếp: đánh dấu chất nhuộm huỳnh quang lên đầu dò, không cần bước dò
tìm sau quá trình lai
Gián tiếp: đánh dấu bằng một số hợp chất chỉ thị trung gian, đồng thời phải tiến
hành dò tìm sau quá trình lai
Chất chỉ thị Dioxygenin (DIG)
Enzyme nhằm khuếch đại tín hiệu
Đầu dò polyribonucleotide



Trực tiếp: thuốc nhuộm huỳnh quang

•

Đặc điểm quang trọng: các chất huỳnh quang có mức năng lượng kích thích và
phát xạ khác nhau

-> cho phép phát hiện đồng thời 2 hay nhiều vsv khi chỉ lai 1 lần duy nhất



Quy trình thực hiện
B1:Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ

•
•
•

Mục đích: đưa được số lượng lớn các đầu dò thấm ngược vào tế bào, giữ lại tối đa số
lượng trình tự đích RNA, đồng thời bảo quản toàn vẹn cấu trúc tế bào và hình thái của
chúng.
Hình thức: ngâm mẫu trong các hợp chất tạo tủa ethanol hoặc methanol
Yêu cầu: kết hợp chính xác các đầu dò đánh dấu huỳnh quang với trình tự đích bổ sung
với chúng với số lượng lớn nhất


B2: Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu

1.
2.
3.

Xử lý bề mặt kính: phủ lớp chất tráng kính ngoài (gelatin/poly-L-lysine/các hc tạo muối)
Các tế bào sau giai đoạn xử lý cố định vào mặt kính
Điều kiện: môi trường tối ẩm,
T°:27->50°C,
thời gian lai: 30 phút -> vài giờ

4. Rửa bằng nước cất 2 lần
5. Sấy, cố định các p.tử lai ( có thể bổ sung các chất chống phai màu)


B3: quan sát và xử lý tín hiệu

•
•
•

Kính hiển vi có trang bị dải lọc nhiều tần
( hoặc kính hiển vi laze quét đồng tiêu)
Máy ảnh CCD
Phần mềm xử lý ảnh kĩ thuật số


Nhược điểm kỹ thuật Fish
Các chất tự phát huỳnh quang

Kết quả không chính xác
Đầu dò thiếu tính đặc hiệu

Số lượng đầu dò quá ít

Cấu trúc của đầu dò hay trình tự đích quá phức tạp

Không thu được kết quả
Hàm lượng RNA quá thấp

Ảnh chụp bị mất màu



Ứng dụng của Fish

Fish được sử dụng trên toàn thế giới để nghên cứu các quần thể vi khuẩn trong
tự nhiên như môi trường dưới nước,trong đất hay trên bề mặt rễ thực vật.
Vd: Khi sử dụng fish để phát hiện sự nổi trội chủng Bacillus trong đất đồng cỏ tại Hà
Lan.
Loại vi khuẩn có hình que, có chứa ribotype DA001 16S rRNA.


 Vi khuẩn cộng sinh
Sử dụng rRNA 16S để định danh và phân cấp phát sinh loài. Dùng FISH để chứng
minh tính chất cộng sinh của vi khuẩn.

Hệ vi sinh vật trong nước thải
Fish sử dụng các đầu dò oligonnucleotide được tạo ra bằng những kĩ thuật phân tử
PCR để nghiên cứu các quần thể vi khuẩn trong nướn thải, bùn hoạt tính.


Hình 4: Sự tự phát huỳnh quang của Paraformaldehyde trong các tế bào Candida albicans(Moter et al., 2000)

Sự đa dạng của vsv


Ứng dụng trong y học

 Nghiên cứu các quần thể vi khuẩn phức tạp trong cở thể người và động vật.
dạ dày

khoang miệng

phổi




Phát hiện vi khuẩn xoắn trong khoang miệng

Hình 6. nhuộm hình quang các lớp vi khuẩn từ bệnh nhân viêm răng
(a) lai với các huỳnh quang đầu dò vi khuẩn EUB338 gắn nhân FITC
(b) lai với đầu dò TRE I gắn nhãn FITC (xanh lá cây)và TRE II gắn nhãn Cy3 (vàng)


Nghiên cứu và phát hiện các bệnh có nguồn gốc từ nấm Candida đối với các mầm bệnh suy giảm miễn dịch


Xác định chính xác các loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật và thực vậtđể từ đó kiểm soát và triệt tiêu mầm
bệnh này

Khoai tây mục héo và hóa nâu do vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Penaeus vannamei
gây bệnh tôm trắng


Triển vọng của FISH

 Trên thế giới

-

Thực hiện hoàn toàn tự động, nhanh chóng chuẩn đoán chính xác vi
sinh vật.

-

Kết hợp FISH với đánh dấu miễn dịch, giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây
bệnh của vi khuẩn.