Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 3 methoxim isatin hướng ức chế histon deacetylase
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.33 MB, 120 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
----- ------
LÊ THỊ THẢO
TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC
CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG
KHUNG 3-METHOXIM-ISATIN HƢỚNG ỨC
CHẾ HISTON DEACETYLASE
LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC
HÀ NỘI – 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
----- ------
LÊ THỊ THẢO
TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC
CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG
KHUNG 3-METHOXIM-ISATIN HƢỚNG ỨC
CHẾ HISTON DEACETYLASE
LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ
DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC
MÃ SỐ: 60720402
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. TS. Đào Thị Kim Oanh
2. PGS.TS. Nguyễn Hải Nam
HÀ NỘI – 2014
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một
số acid hydroxamic mang khung 3-methoxim-isatin hướng ức chế histon
deacetylase”, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, bạn bè và
đồng nghiệp.
Trƣớc tiên, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS.
Đào Thị Kim Oanh, PGS. TS. Nguyễn Hải Nam – những ngƣời thầy đã tận tâm
hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình
nghiên cứu, thực hiện đề tài tại Bộ môn Hóa dƣợc – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
Với lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Huỳnh Kim
Thoa – ngƣời Thầy đã tạo điều kiện cho tôi cơ hội đƣợc nâng cao kiến thức và có
thời gian để thực hiện cơ hội đó.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên,
các bạn sinh viên nhóm nghiên cứu Hóa dƣợc - Bộ môn Hóa dƣợc – Trƣờng Đại
học Dƣợc Hà Nội, các anh chị Khoa hóa học – Trƣờng đại học Khoa học Tự nhiên
– Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, Viện Hóa hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
Trƣờng Đại học Quốc gia Chungbuk (Cheongji, Hàn Quốc) đã nhiệt tình giúp đỡ tôi
trong thời gian tôi thực hiện đề tài này.
Cuối cùng, xin gửi lời tri ân sâu sắc đến chồng, gia đình, bạn bè và đồng
nghiệp đã động viên, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình học tập, làm việc và hoàn
thành luận văn.
Hà Nội, ngày 29 tháng 8 năm 2014
Lê Thị Thảo
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Trang
DANH MỤC HÌNH VẼ
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
3
1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC)
3
1.1.1. Khái niệm HDAC
3
1.1.2. Phân loại HDAC
4
1.1.3. Mối liên quan giữa ung thƣ và sự hoạt động bất thƣờng của HDAC
5
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACIs)
6
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC
6
1.2.2. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC
9
1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC
9
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC
10
HƢỚNG ỨC CHẾ HDAC HIỆN NAY
1.3.1. Các nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic trên thế giới
10
1.3.1.1. Thay đổi cầu nối
11
1.3.1.2. Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt
16
1.3.2. Các nghiên cứu trong nƣớc
21
1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC
24
1.4.1. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester
24
1.4.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic
25
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
26
NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
26
2.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ
26
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
27
2.3.1. Nội dung nghiên cứu
27
2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
28
2.3.2.1. Tổng hợp hóa học
28
2.3.2.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết
28
2.3.2.3. Phương pháp phân tích cấu trúc
28
2.3.2.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
29
2.3.2.5. Docking
31
2.3.2.6. Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp được
31
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ
33
3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC
33
3.1.1. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và dẫn chất (IIa-g)
33
3.1.1.1. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIa)
34
3.1.1.2. Tổng hợp 5- fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIb)
34
3.1.1.3. Tổng hợp 5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIc)
34
3.1.1.4. Tổng hợp 5-bromoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IId)
34
3.1.1.5. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin (IIe)
35
3.1.1.6. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin (IIf)
35
3.1.1.7. Tổng hợp 7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIg)
35
3.1.2. Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat và dẫn
35
chất (IIIa – g)
3.1.2.1. Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)–2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIa)
36
3.1.2.2.
ethyl-7-(5-fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-
36
3.1.2.3. Tổng hợp ethyl-7-(5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat
36
Tổng
hợp
yl)heptanoat (IIIb)
(IIIc)
3.1.2.4.
Tổng
hợp
ethyl-7-(5-bromo-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-
37
3.1.2.5. Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat
37
yl)heptanoat (IIId)
(IIIe)
3.1.2.6.
Tổng
hợp
ethyl-7-(3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin-1-
37
3.1.2.7. Tổng hợp ethyl-7-(7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat
37
yl)heptanoat (IIIf)
(IIIg)
3.1.3. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-methoxyimino-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid và
38
dẫn chất (IVa-g)
3.1.3.2.
Tổng
hợp
N-hydroxy-7-(5-fluoro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1-
39
N-hydroxy-7-(5-cloro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1-
39
N-hydroxy-7-(5-bromo-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1-
39
N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin-1-
39
3.1.3.6. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin-1-
40
yl)heptanamid (IVb)
3.1.3.3.
Tổng
hợp
yl)heptanamid (IVc)
3.1.3.4.
Tổng
hợp
yl)heptanamid (IVd)
3.1.3.5.
Tổng
hợp
yl)heptanamid (IVe)
yl)heptanamid (IVf)
3.1.3.7.
Tổng
hợp
N-hydroxy-7-(7-cloro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1-
40
yl)heptanamid (IVg)
3.2. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT
41
3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
42
3.3.1. Phổ hồng ngoại (IR)
42
3.3.2. Phổ khối lƣợng (MS)
43
3.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
43
3.3.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR
44
3.3.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR
45
3.4. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
47
3.4.1. Thử tác dụng ức chế histon deacetylase
47
3.4.2. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro
47
3.5. KẾT QUẢ DOCKING
47
3.6. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ GIỐNG THUỐC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP
49
Chƣơng 4. BÀN LUẬN
50
4.1. VỀ HÓA HỌC
50
4.1.1. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và các dẫn chất (IIa-g)
50
4.1.2. Phản ứng tổng hợp dãy ester trung gian (IIIa-g)
50
4.1.3. Phản ứng tổng hợp dãy chất acid hydroxamic (IVa-g)
51
4.2. VỀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC
52
4.2.1. Phổ hồng ngoại
52
4.2.2. Phổ khối lƣợng
54
4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
55
4.2.3.1. Phổ 1H – NMR
56
4.2.3.2. Phổ 13C – NMR
61
4.3. VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
64
4.3.1. Về tác dụng ức chế HDAC
64
4.3.2. Về tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro
65
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
72
1. KẾT LUẬN
72
1.1. Về tổng hợp hóa học và khẳng định cấu trúc
72
1.2. Về hoạt tính sinh học
72
2. ĐỀ XUẤT
72
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC PHỔ
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AsPC-1
Tế bào ung thƣ tụy
13
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C
C-NMR
DCM
Dicloromethan
DMF
Dimethylformamid
DMSO
Dimethyl sulfoxid
FDA
Cục quản lý dƣợc phẩm và thực phẩm Mỹ
HAT
Histon acetyl transferase
HDAC
Enzym histon deacetylase
HDACIs
Các chất ức chế HDAC
1
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H
H-NMR
IC50
Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào
IR
Phƣơng pháp phổ tử ngoại
LD50
Liều gây chết cho 50% số cá thể nghiên cứu
MCF-7
Tế bào ung thƣ vú
MeOH
Methanol
MS
Phổ khối lƣợng
NCI-H460
Tế bào ung thƣ phổi
NMR
Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
PC-3
Tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến
SAHA
Acid suberoylanilid hydroxamic
SW620
Tế bào ung thƣ ruột kết
THF
Tetrahydrofuran
TLC
Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
TSA
Trichostatin A
DANH MỤC HÌNH VẼ
Tên hình
Trang
Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo nucleosom
3
Hình 1.2: Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC nhóm I, II, IV
4
Hình 1.3: Vai trò của HDAC trong sinh lý tế bào ung thƣ
5
H h 1.4: HDACIs có cấu trúc hydroxamat
10
Hình 1.5: Các dẫn chất thế 2’ của SAHA
12
Hình 1.6: Các dẫn chất -alkoxy của SAHA
12
Hình 1.7: Các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid
13
Hình 1.8: SAR của các dẫn chất acid hydroxamic hƣớng ức chế HDAC
14
Hình 1.9: Các dẫn chất amid ngƣợc của SAHA
14
Hình 1.10: Các dẫn chất có gắn thêm O, S vào cầu nối của SAHA
16
Hình 1.11: Các dẫn chất phenyl-hydroxamic tƣơng tự SAHA
16
Hình 1.12: Các aryl-hydroxamic tƣơng tự SAHA
17
Hình 1.13: Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic
17
Hình 1.14: Các acid phenylthiazol hydroxamic tƣơng tự SAHA
18
Hình 1.15: Một số acid phenylthiazol hydroxamic
19
Hình 1.16: Dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR3018049
19
Hình 1.17: Dẫn chất 1,3,4-thiadiazol hydroxamic acid
19
Hình 1.18: Các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol hydroxamic
20
Hình 1.19: Các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-oxadiazol hydroxamic
20
Hình 1.20: Cấu trúc N1-(2,5-dimethoxyphenyl)-N(8)-hydroxyoctandiamid
21
Hình 1.21: Cấu trúc các hydroxamic tƣơng tự SAHA với nhóm khóa hoạt động
22
benzothiazol
Hình 1.22: Cấu trúc các hydroxamic tƣơng tự SAHA với nhóm khóa hoạt động
22
5-phenyl-1,3,4-thiadiazol
Hình 1.23: Cấu trúc của các dẫn chất 3-oxim-isatin
24
Hình 3.1: Kết quả phân tích Western blot của các chất IVa – g
47
Hình 3.2: Kết quả docking của chất IVa và SAHA với HDAC8
48
Hình 3.3: Kết quả docking của chất IVa và SAHA với HDAC2
48
Hình 4.1: Hiện tƣợng hỗ biến của nhóm chức hydroxamic
53
Hình 4.2: Phổ hồng ngoại của chất IVa
54
Hình 4.3: Phổ khối lƣợng của chất IVa
55
Hình 4.4: Phổ 1H – NMR dãn rộng của IVa
57
Hình 4.5: Phổ 1H – NMR dãn rộng của IVg
58
Hình 4.6: Phổ cộng hƣởng từ 1H – NMR của 19e
59
Hình 4.7: Phổ cộng hƣởng từ 1H – NMR của IVe
59
Hình 4.8: a, Phổ 13C – NMR của chất IVf.
63
b, Phổ 13C – NMR dãn rộng của chất IVf
Hình 4.9: Kết quả phân tích Western blot của 2 dãy chất 19a-g và IVa-g
64
Hình 4.10: Biểu đồ so sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro của các dẫn
67
chất IVa-g
DANH MỤC BẢNG
Tên bảng
Trang
Bảng 1.1: Phân loại các chất ức chế HDAC
7
Bảng 1.2: Khả năng ức chế của một số HDACIs trên HDAC nhóm I, II, IV
8
Bảng 1.3: Hoạt tính ức chế HDAC và kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ
13
in vitro của các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid
Bảng 1.4: Tác dụng kháng các tế bào ung thƣ in vitro của N25
21
Bảng 1.5: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế
23
enzym HDAC của các chất 18a-d
Bảng 3.1: Kết quả tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và dẫn chất
35
Bảng 3.2: Kết
7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-
38
Bảng 3.3: Kết quả tổng hợp N-hydroxy-7-(3-methoxyimino-2-oxoindolin-1-
40
quả
tổng
hợp
ethyl
yl)heptanoatvà dẫn chất
yl)heptanamidvà dẫn chất
Bảng 3.4: Giá trị Rf và Tnc của các chất IVa-g
41
Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ IR của các chất IVa-g
42
Bảng 3.6: Kết quả phân tích phổ khối lƣợng của các chất IVa-g
43
Bảng 3.7: Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất IVa-g
44
Bảng 3.8: Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các chất IVa-g
46
Bảng 3.9: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất IVa-g theo quy tắc
49
Lipinsky
Bảng 4.1: Bảng so sánh phổ cộng hƣởng từ 1H – NMR của 2 chất 19e và IVe
60
Bảng 4.2: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro của các chất IVa-g
66
Bảng 4.3: So sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ của 2 dãy IVa-g và 19a-g
69
Bảng 4.4: So sánh giá trị logP của các chất 19a-g và IVa-g
70
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Tê sơ đồ
Trang
Sơ đồ 1.1: Tổng hợp các dẫn chất -alkoxy của
24
Sơ đồ 1.2: Tổng hợp acid biaryl hydroxamic
25
Sơ đồ 1.3: Tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic
25
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các dẫn chất mang khung 3-methoximisatin
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IIa - g
33
Sơ đồ 3.3: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IIIa - g
36
Sơ đồ 3.4: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IVa-g
38
Sơ đồ 4.1: Cơ chế phản ứng thế ái nhân alkyl tạo IIIa-g
50
Sơ đồ 4.2: Phản ứng thế ái nhân acyl
51
Sơ đồ 4.3: Cơ chế phản ứng tổng hợp acid hydroxamic IVa-g từ ester
51
33
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thƣ là bệnh khó có thể điều trị khỏi mặc dù đã có những tiến bộ vƣợt
bậc trong y học trong hai thập kỷ qua. Theo ƣớc tính và thống kê của tổ chức Y tế
Thế giới (WHO), hàng năm có khoảng 9 – 10 triệu ngƣời mắc ung thƣ mới và một
nửa trong số đó chết vì căn bệnh này. Chỉ tính riêng năm 2012 đã có 8,2 triệu ngƣời
chết vì ung thƣ, đây trở thành căn bệnh gây tử vong nhiều nhất trên Thế giới [51].
Để giảm thiểu tỷ lệ tử vong trong ung thƣ, việc phòng và điều trị ung thƣ
đóng vai trò vô cùng quan trọng. Với những tiến bộ trong y học, di truyền học và
sinh học phân tử thế kỷ 21, đặc biệt khi tìm ra bản đồ gen ngƣời, điều trị ung thƣ đã
có những bƣớc tiến mới trong phẫu thuật, xạ trị, điều trị hóa chất và gần đây nhất là
điều trị ung thƣ hƣớng đích. Phƣơng pháp điều trị này có hiệu quả hơn và ít gây độc
hơn so với các phƣơng pháp điều trị ung thƣ đã có trƣớc đó. Mục tiêu phân tử trong
điều trị ung thƣ hƣớng đích bao gồm các enzym đặc hiệu, protein hoặc thụ thể khác
nhau có liên quan đến sự phát triển tế bào ung thƣ, ví dụ nhƣ: proteasome,
telomerase, histon deacetylase, hoặc protein kinase,... [12]. Nghiên cứu thuốc điều
trị ung thƣ hƣớng đích hiện nay chủ yếu ở giai đoạn tiền lâm sàng, một số đang
trong giai đoạn lâm sàng và số ít đã đƣợc FDA phê duyệt đƣa vào điều trị. Trong số
đó, histon deacetylase (HDAC) là mục tiêu phân tử đem lại nhiều kết quả khả quan
khi nghiên cứu, thiết kế và thử nghiệm lâm sàng các thuốc tác dụng hƣớng ức chế
enzym này [5, 8, 33, 50]. Acid suberoylanilid hydroxamic (Vorinostat, Zolinza®)
là chất ức chế HDAC đầu tiên đã đƣợc FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào
T dƣới da [37]. Bên cạnh đó, một số chất ức chế HDAC khác cũng đã đƣợc nghiên
cứu và đang đƣa vào thử nghiệm lâm sàng nhƣ NVP-LAQ824, MS-275,
cyclodepsipeptid FK-228,... Đáng ngạc nhiên, các chất ức chế HDAC thử nghiệm
có hiệu quả điều trị cao và độc tính thấp đối với tế bào lành tính [33], vì thế hiện
nay chất ức chế HDAC trở thành mục tiêu hấp dẫn và mang đầy tính khả quan trong
công cuộc nghiên cứu tìm ra chất chống ung thƣ của các công ty dƣợc phẩm và các
tổ chức chính phủ.
1
Tại Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành thiết kế công thức
và tổng hợp các chất ức chế HDAC. Trong các chất đã tổng hợp, nghiên cứu về
hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hƣớng ức chế histon
deacetylase đã cho thấy có hoạt tính tốt trên tế bào ung thƣ trong thử nghiệm in
vitro, đặc biệt là một số dẫy chất mang khung benzothiazol [1, 40, 41], 3-oximisatin [4]. Với mong muốn đem lại nhiều ứng viên lâm sàng để tìm ra thuốc điều
trị ung thƣ mới, theo hƣớng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung
3-methoxim-isatin hướng ức chế histon deacetylase” với mục tiêu:
1. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid và
một số dẫn chất.
2. Thử tác dụng ức chế histon deacetylase và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in
vitro trên một số dòng tế bào ung thƣ của các chất tổng hợp đƣợc.
2
Chƣơ g 1. TỔNG QUAN
1.2.
HISTON DEACETYLASE (HDAC)
1.2.1. Khái niệm HDAC
Histon – một phần của cấu trúc nhiễm sắc thể, là các protein cơ bản giàu acid
amin nhƣ lysine, arginin, đƣợc chia thành 5 nhóm chính (H1, H2A, H2B, H3, H4)
[26]. Các cặp histon lõi (H2A, H2B và H3, H4) có 2 phần quan trọng: đuôi C nằm
bên trong lõi và đầu N nằm bên ngoài nucleosom. Phần đầu N tận của histon, đặc
biệt H3, H4 là nơi diễn ra rất nhiều quá trình biến đổi khác nhau trong phiên mã nhƣ
acetyl hóa/deacetyl hóa lysin, methyl hóa lysin và arginin, phosphoryl hóa serin và
ubiquinin, sumoyl hóa lysin [52].
Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo nucleosom [52]
Histon có thể tồn tại ở một trong hai dạng đối lập nhau là acetyl hóa hoặc
deacetyl hóa. Các enzym đóng vai trò trong sự chuyển đổi này là histon acetyl
transferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) [13, 50]. Histon acetyl
transeferase (HAT) xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl coenzym A đến liên kết
với nhóm ε-amino của lysine ở phần đầu N của histon, sự chuyển đổi này xảy ra
nhiều hơn trên histon H3 và H4. Sự acetyl hóa histon làm tháo xoắn nhiễm sắc thể
bằng cách trung hòa điện tích dƣơng của phần đầu N của histon, do vậy làm giảm ái
3
lực của histon với phần điện tích âm trên ADN [45]. Ngƣợc lại, histon deacetylase
(HDAC) xúc tác việc loại bỏ nhóm acetyl của lysin ở phần đầu N của histon, dẫn
đến nhiễm sắc thể bị đóng xoắn và ức chế quá trình phiên mã [18].
1.1.2. Phân loại HDAC
HDAC đƣợc bảo tồn trong quá trình tiến hóa và biểu hiện trong tổ chức của
các sinh vật từ đơn bào nguyên thủy cho tới loài ngƣời. Hiện nay, 18 HDAC đƣợc
tìm thấy và chia thành 4 nhóm: I, II, III và IV [13, 35].
HDAC nhóm I, II, IV là những enzym phụ thuộc Zn2+ và bị ức chế bởi các
chất tạo phức chelat với Zn2+ [50], khác với các HDAC nhóm III có cơ chế hoạt
động phụ thuộc cofactor NAD+. Các HDAC đều có trung tâm hoạt động gồm 2
phần chính: ion Zn2+ là coenzym của các HDAC và kênh enzym dạng túi hình ống.
Cấu trúc túi rất linh động, có thể biến đổi để phù hợp với chiều dài của các cơ chất
khác nhau. Trên miệng túi có 1 vành nhỏ đƣợc tạo nên từ 1 vài vòng xoắn protein,
phần vành này sẽ tƣơng tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC [25, 49].
Hình 1.2. Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC nhóm I, II, IV [25]
(Ion Zn2+ biểu thị là hình tròn màu tím)
HDAC không chỉ điều hòa các protein histon mà rất nhiều protein không
histon cũng bị ảnh hƣởng bởi hoạt tính của các HDAC. Thuật ngữ các chất ức chế
HDAC để chỉ các chất có khả năng ức chế HDAC “kinh điển” nhóm I, II và IV [9]
– mục tiêu phân tử mà các nghiên cứu điều trị ung thƣ hƣớng đích đang tiến hƣớng
đến.
4
1.1.3. Mối liên quan giữa u g thƣ và sự hoạt động bất thƣờng của HDAC
Hoạt động của HDAC ảnh hƣởng tới quá trình acetyl hóa histon. Do đó, sự
mất cân bằng trong hoạt động của enzym này có thể dẫn tới những thay đổi trong
cấu trúc của NST và sự rối loạn điều hòa phiên mã các gen tham gia vào điều khiển
chu trình tế bào, phân hóa và/hoặc gây chết tế bào, do đó dẫn đến ung thƣ [13].
Sự gia tăng bất thƣờng của HDAC1 và/hoặc HDAC2 và/hoặc HDAC6 đƣợc
quan sát trong một số bệnh ung thƣ tạng đặc nhƣ ung thƣ tiền liệt tuyến, ung thƣ dạ
dày, trực tràng, ung thƣ vú và ung thƣ não cũng nhƣ các bệnh lý ác tính về máu
(bệnh bạch cầu tủy bào cấp, bạch cầu tế bào B, bệnh u lympho tế bào T ngoại vi,
bệnh u lympho tế bào B) và bệnh u lympho da tế bào T. Việc tìm ra các cơ chất của
HDAC là các protein nhƣ p53, GATA1, GATA2, E2F, Rb, Bc16, Gli1,… liên quan
đến xu hƣớng gây ung thƣ và tiến triển của bệnh ung thƣ đã khẳng định vai trò của
HDAC trong ung thƣ [16], chúng có liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản
của quá trình sinh học trong tế bào ung thƣ nhƣ chu trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết
tế bào theo chƣơng trình trình kể cả sự xâm lấn, sự di chuyển và sự tạo mạch [20,
28, 48, 50].
Hình 1.3. Vai trò của HDAC trong sinh lý tế bào ung thƣ [50]
Nhƣ vậy ức chế quá trình phiên mã đƣợc điều hòa bởi sự gia tăng HDAC và
có thể kiểm soát ung thƣ bằng cách ức chế hoạt động của HDAC, chính điều này đã
mở ra tƣơng lai mới hứa hẹn hơn cho điều trị ung thƣ hƣớng đích.
5
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACIs)
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC
Trichostatin (TSA) là dẫn chất hydroxamat tự nhiên đầu tiên có tác dụng ức
chế trực tiếp HDAC đƣợc Yoshida và cộng sự phát hiện ra năm 1990 với tác dụng
chống nấm. Sau đó, dựa vào những hiểu biết về mối liên quan giữa HDAC và ung
thƣ đồng thời xác định đƣợc cấu trúc 3D của các HDAC, một số dẫn chất ức chế
HDAC đã đƣợc nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng để ứng dụng trong điều trị ung
thƣ [36]. Năm 2006 và 2009, SAHA (Vorinostat®, Merck) và Depsipeptid
(Istodax®, Celgene) đã đƣợc FDA cấp phép dùng trong điều trị u lympho tế bào T
dƣới da.
Cho tới nay, nhiều HDACIs đƣợc tìm thấy có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng
hợp với cấu trúc đa dạng. Dựa vào những cấu trúc hóa học này, HDACIs đƣợc chia
thành 5 nhóm: các acid hydroxamic, các peptid vòng, các acid béo, benzamid và các
dẫn chất ceton (bảng 1.1).
Mỗi nhóm HDACIs có những hạn chế riêng.Các acid hydroxamic là những
chất bị chuyển hóa nhanh và ức chế không chọn lọc các HDAC. Các benzamid và
các acid béo có hiệu lực hạn chế. Dẫn chất ceton dễ bị khử hóa trong huyết tƣơng.
Trong khi các peptid vòng có cấu trúc phức tạp, khó tạo thành về mặt hóa học, gây
ra sự chảy máu khó chữa và FK-228 trong cấu trúc có một phần liên kết với ion
Zn2+ có chứa lƣu huỳnh không mong muốn [24].
Khi nghiên cứu về hoạt tính của HDACIs trên các HDAC kinh điển, các nhà
khoa học nhận thấy hoạt tính sinh học của các HDACIs phụ thuộc vào khả năng
liên kết với túi enzym và khả năng tạo phức với ion Zn2+ ở phần đáy kênh của các
chất này. Do HDAC đƣợc bảo vệ trong túi enzym, hầu hết các HDACIs đều không
thể ức chế chọn lọc riêng một HDAC nào, chúng có thể ức chế tất cả các HDAC
hoặc ức chế đồng thời nhiều thành viên HDAC khác nhau (bảng 1.2).
6
Chất
Bảng 1.1.Phân loại các chất ức chế HDAC [18]
Cấu trúc
Chất
Cấu trúc
Các acid hydroxamic
O
TSA
(Trichostatin A)
O
O
NHOH
Oxamflatin
NHOH
H
N
O
S
N
O
Acid
suberoylanilid
hydroxamic
(SAHA)
OH
O
H
N
NHOH
O
H
N
NVP-LAQ824
NHOH
N
O
HN
O
CBHA (Acid mcarboxycinnamic
bishydroxamid)
Acid
sulfonamid
hydroxamic
Scriptaid
Peptid vòng
O
Depsipeptid
(FK-228)
HN
O
CH3
O
H
N
NH
S
S
CH3
CH3
H3C
O
HN
O
CH3
O
Acipidin
CHAP
Benzamid
O
MS-275
O
N
H
H
N
NH2
N
CI-994
O
Các acid béo
O
Acid valproic
Phenyl
butyrat
OH
Các dẫn chất ceton
Trifluoromethyl
ceton
Alphacetoamid
7
ONa
O
Bảng 1.2. Khả năng ức chế của một số HDACIs trên HDAC nhóm I, II, IV [50]
Nhóm I
HDAC10
HDAC11
nd
nd
nd
NVP-LAQ824
nd
nd
nd
Panbinostat
nd
nd
nd
Belinostat
nd
nd
nd
nd
Chất ức chế
không chọn lọc
Depsipeptid
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
Apicidin
Valproic acid
nd
Trapoxin
nd
nd
SB-429201
nd
Bispyridinum diene
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
SHI-1:2
R306465
nd
SB-379278A
nd
nd
PCI-34051
Cpd2
nd
nd
APHA derivaties
nd
nd
nd
Tubacin
nd
nd
nd
NCT-10a/14a
Ghi chú:
nd
nd
MGCD0103
Mercaptoacetamide
HDAC6
Vorinostat (SAHA)
nd
HDAC9
nd
MS-275
HDAC7
nd
nd
HDAC5
HDAC4
HDAC8
HDAC3
HDAC2
HDAC1
nd
PCI-24781
Chất ức chế nhóm I
Nhóm IV
TSA
HDACIs
Chất ức chế
nhóm II
Nhóm II
B
Nhóm II A
nd
nd nd
Ức chế mạnh
Ức chế yếu
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
Không ức chế
nd: không có dữ liệu công bố
Trong số các HDACIs, nhiều chất đang đƣợc nghiên cứu và thử nghiệm lâm
sàng pha I, II hoặc III trên các đối tƣợng bệnh nhân ung thƣ máu, ung thƣ thể rắn
hoặc ung thƣ các cơ quan khác trong cơ thể nhƣ: Phenyl butyrate, SAHA, LAQ824,
Acid valproic, PXD101, ITF-2357, Depsipeptid, MS275, CI-994, Pyroxamid,…
[36]. Những dữ liệu bƣớc đầu của các thử nghiệm lâm sàng cho thấy, HDACIs có
hiệu quả tốt trong điều trị ung thƣ và độc tính thấp đối với các tế bào lành tính. Các
8
ƣu điểm trong lâm sàng này khiến HDACIs trở thành mục tiêu phân tử đầy hứa hẹn
cho tƣơng lai điều trị ung thƣ và là hƣớng nghiên cứu khả quan cho các nhà khoa
học.
1.2.2. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC
Có nhiều bằng chứng cho rằng HDACIs có tác dụng chống ung thƣ do tác
động lên nhiều giai đoạn quan trọng của chu trình tế bào, làm mất sự điều hòa trong
tế bào ác tính. Trong đó, các cơ chế chính quyết định hoạt tính chống ung thƣ của
HDACIs là thúc đẩy sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và gián tiếp gây ra sự chết
tế bào theo chƣơng trình. Ngoài ra, HDACIs còn ức chế sự phát triển của khối u
bằng cách ngăn cản cung cấp oxy và chất dinh dƣỡng, từ đó ức chế quá trình tạo
mạch của khối u, làm giảm khả năng hình thành và sống sót của khối u; đồng thời
làm tăng sự nhận dạng và hoạt hóa của tế bào miễn dịch, ngăn cản rõ rệt sự phát
triển khối u ban đầu và sự di căn [5, 26].
1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC
Các chất ức chế HDAC đƣợc chia thành nhiều nhóm khác nhau, nhƣng cấu
trúc đều có các phần chính sau [2, 16, 38]:
CAP (C)
Cầu nối (B)
Nhóm gắn
Zn2+ (A, ZBG)
Trong đó:
-
Nhóm khoá hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt (C):
thƣờng là vòng thơm hoặc peptid vòng, nằm trên bề mặt của enzym.
-
Cầu nối sơ nƣớc (B): thƣờng là các hydrocarbon thân dầu, nằm trong lòng
mạch enzym, quyết định sự phù hợp về cấu trúc của các chất với chiều dài kênh
enzym.
-
Nhóm gắn với Zn2+ trên vị trí tác dụng của các enzym HDAC (A) nhƣ acid
hydroxamic, các thiol, benzamid, mercaptoceton... quyết định tính đặc hiệu và hiệu
lực tác dụng của các HDACIs.
Cấu trúc tinh thể kết tinh của các HDAC cho thấy phần B, C và một phần
của A nằm trong túi enzym, làm đầy khoảng trống trong lòng kênh enzym. Phần
9
còn lại của A tƣơng tác với phần vành trên bề mặt miệng túi enzym. Việc nghiên
cứu thiết kế công thức cho các HDACIs mới đều dựa trên cấu trúc cổ điển này.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC
HƢỚNG ỨC CHẾ HDAC HIỆN NAY
1.3.1. Các nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic trên thế giới
Năm 1986, TSA đã đƣợc Morioka và cộng sự chứng minh tác dụng rất tốt
trong việc làm giảm sự biệt hóa tế bào trong bệnh bạch cầu Friend và ức chế chu
trình tế bào bình thƣờng ở cả pha G1 và G2 [53]. Bên cạnh đó, TSA có tác dụng ức
chế mạnh, đặc hiệu với HDAC (Ki = 3,4nM) [46, 48] và đóng vai trò nhƣ chất ngăn
cản sự di căn trong ung thƣ đại tràng. Tuy nhiên, hiện nay TSA chủ yếu dùng làm
chất đối chiếu trong nghiên cứu tìm ra các chất ức chế HDAC mới [46] do việc sản
xuất TSA rất tốn kém mà lại không hiệu quả (trải qua 20 bƣớc và hiệu suất 2%).
Năm 2006, sau khi trải qua các pha trong tiến trình thử nghiệm lâm sàng, SAHA
(Vorinostat, Zolinza) đã đƣợc FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị u lympho da
tế bào T, đƣợc chứng minh nhạy cảm với các dòng tế bào Hut78, HH, M [53].
Ngoài TSA, SAHA, nhiều dẫn chất acid hydroxamic ức chế HDAC khác
đang đƣợc nghiên cứu và chia thành nhiều phân nhóm nhỏ: acid hydroxamic mạch
thẳng, dẫn chất cinnamic, dẫn chất phenyl... (hình 1.4).
H h 1.4. HDACIs có cấu trúc hydroxamic
10
Cho tới nay, dẫn chất acid hydroxamic đã trở thành nhóm chất ức chế HDAC
đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhất, với nồng độ ức chế nằm trong khoảng micromol đến
nanomol. Giống nhƣ các HDACIs khác, cấu trúc của các dẫn chất acid hydroxamic
cũng gồm 3 phần chính: Nhóm khóa hoạt động (C), cầu nối sơ nƣớc (B) và nhóm
gắn Zn2+(Zinc Binding Group, ZBG) là acid hydroxamic. Nhiều nghiên cứu đã thay
đổi nhóm gắn Zn2+ này bằng nhiều nhóm chức khác với mong muốn tìm ra nhiều
chất ức chế HDAC có hiệu lực. Tuy nhiên,khi thay nhóm chức hydroxamic bằng
một số nhóm chức nhƣ sulfonamid, thiocarbonat, dithiocarbonat và trithiocarbonat,
hoạt tính ức chế HDAC của các chất tổng hợp đƣợc đều giảm so với SAHA, thậm
chí có chất còn không có hoạt tính [17, 24, 34]. Nhƣ vậy có thể thấy, các acid
hydroxamic là nhóm có cấu trúc đơn giản, hoạt tính ức chế HDAC mạnh do rất dễ
tạo phức với ion Zn2+. Tuy nhiên, cũng vì nhóm chức acid hydroxamic dễ tạo phức
với ion Zn2+ của HDAC nên các dẫn chất này ức chế không chọn lọc cả HDAC
nhóm I, II. Thêm vào đó, chúng bị chuyển hóa nhanh nên nửa đời in vivo ngắn [21,
38]. Chính vì vậy, rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đang nỗ lực tìm kiếm các
dẫn chất mới dựa trên phiên mẫu của TSA, SAHA và các dẫn chất acid hydroxamic
đã tìm đƣợc trƣớc đó nhằm tìm ra sự liên quan về cấu trúc tác dụng của các dẫn chất
này, phục vụ cho việc nghiên cứu thiết kế và tổng hợp các ứng viên lâm sàng mới
cho điều trị ung thƣ. Một số nghiên cứu trên thế giới đã tiến hành thay đổi cấu trúc
cầu nối và nhóm nhận diện bề mặt của SAHA và thu đƣợc các kết quả dƣới đây.
1.3.1.1. Thay đổi cầu nối
Nhằm hiểu rõ hơn về vai trò của cầu nối trong cấu trúc hoạt động của các
dẫn xuất acid hydroxamic tƣơng tự SAHA, nhóm nghiên cứu do Anton V.
Bieliauskas (Mỹ) đứng đầu đã thiết kế và tổng hợp các hydroxamic khác nhau bằng
cách gắn thêm các nhóm thế vào nguyên tử C liền kề với nhóm chức acid
hydroxamic của SAHA (hình 1.5). Kết quả khi thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ
in vitro cho thấy các dẫn chất thu đƣợc có hoạt tính giảm 800 – 1000 lần (IC50 = 3,2
- 226 µM) so với SAHA (IC50 = 0,09 µM) trong cùng thử nghiệm. Điều này cho
thấy vùng không gian tham gia tạo phức với nhóm chức acid hydroxamic trong
11
trung tâm hoạt động của các HDAC có kích thƣớc rất hạn chế và các nhóm thế ở vị
trí gần với nhóm chức này sẽ làm giảm hoạt tính của các HDACIs [14].
Hình 1.5. Các dẫn chất thế 2’ của SAHA
Phân tích cấu tạo trung tâm hoạt động dạng túi của HDAC, nhóm nghiên cứu
thuộc trung tâm nghiên cứu Sigma-Tau (Pomezia, Ý) đặc biệt chú ý phần miệng túi
với các vòng acid amin có thể tham gia nhiều tƣơng tác quan trọng với nhóm nhận
diện bề mặt hoặc các nhóm lân cận. Dựa trên cơ sở này, nhóm nghiên cứu đã thiết
kế và tổng hợp dãy dẫn chất -alkoxy của SAHA (hình 1.6) [23]. Kết quả sàng lọc
hoạt tính ức chế HDAC2 cho thấy tất cả các dẫn chất -alkoxy (dạng racemic) của
SAHA đều cho giá trị IC50 ở mức rất thấp (0,05-0,5 µM), nhiều chất tác dụng tƣơng
đƣơng SAHA. Kết quả này cho thấy các nhóm thế -alkoxy đã có hiệu quả tăng
cƣờng tác dụng sinh học cho các dẫn chất này, có thể do chúng đã tạo thêm các
tƣơng tác với các aminoacid thuộc vùng mép túi tại trung tâm hoạt động của enzym,
đồng thời các dẫn chất -alkoxy có cầu nối với chuỗi alkyl có 6C cho hoạt tính tốt
hơn so với cầu nối có chuỗi alkyl 5C. Đáng chú ý là cấu hình của nhóm chức alkoxy không ảnh hƣởng đến hoạt tính sinh học.
Hình 1.6. Các dẫn chất -alkoxy của SAHA [23]
Một hƣớng thay đổi cầu nối của SAHA đƣợc thực hiện bởi các Maurizio
Taddei và cộng sự (Italia) bằng cách gắn các lactam-carboxyamid vào C7 trong
chuỗi alkyl của SAHA (hình 1.7) đã thu đƣợc kết quả rất đáng lƣu ý. Việc gắn
lactam vào cầu nối này đã tăng cƣờng đáng kể tác dụng kháng tế bào ung thƣ in
vitro. Nhiều dẫn chất đƣợc tạo ra có khả năng ức chế HDAC nhóm I, II B và IV với
12
IC50 ở mức nanomol, thấp hơn SAHA hàng trăm lần, điển hình là 2 dẫn chất 3a, 3b
(bảng 1.3) [39].
Hình 1.7. Các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid
Kết quả trên cho thấy sự có mặt của vòng amid trên C7 của cầu nối alkyl gần
với nhóm khóa hoạt động có ảnh hƣởng đặc biệt lên ái lực với enzym. Có thể sự
xuất hiện của vòng amid đã làm tăng thêm tƣơng tác với các acid amin ở lối vào
trung tâm hoạt động của HDAC đem lại hoạt tính ức chế HDAC mạnh cho các dẫn
chất này. Điều này đƣợc minh chứng khi tiếp tục nghiên cứu tác dụng kháng tế bào
ung thƣ in vitro trên dòng tế bào H460, các dẫn chất 7-aminosuberoylamid
hydroxamic acid cho hoạt tính rất mạnh, đặc biệt các chất 3a, 3b có IC50 = 0,5 µM,
mạnh hơn SAHA 6 lần (bảng 1.3).
Bảng 1.3. Hoạt tính ức chế HDAC và kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in
vitro của các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid [39].
Chất
HDAC (IC50, nM)
IC50, µM
HDAC1 HDAC2 HDAC3 HDAC8 HDAC6 HDAC10 HDAC11
H460
SAHA
258
921
350
243
29
456
362
3,4
3a
2
8
2
32,9
2
10,6
55,5
0,5
3b
7
27
11
52
3
30,3
15,5
0,5
Từ kết quả trên có thể nhận thấy 3a (ST8078AA1) là một chất dẫn đƣờng
hấp dẫn, với các biến đổi đơn giản nhƣng tạo đƣợc đƣợc một chất kháng ung thƣ
mới hƣớng ức chế HDAC đầy triển vọng.
Dựa trên cấu trúc của SAHA, Andrianov Victor và cộng sự đã thiết kế hàng
loạt các dẫn chất hydroxamic có cấu trúc amid hƣớng ức chế HDAC nhằm khảo sát
13
