Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh trưởng sinh tổng hợp acid clavulanic sinh ra từ chủng xạ khuẩn streptomyces clavuligerus

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------ -- --

------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI : “ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ
NĂNGSINH TRƯỞNG–SINH TỔNG HỢPACID CLAVULANIC TỪ
CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CLAVULIGERUS”

Giáo viên hướng dẫn : TS. Tạ Thị Thu Thủy
Sinh viên thực hiện

: Trình Thị Thanh Hương

Lớp

: KSCNSH -1302

Hà Nội – 2017


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS.Tạ
Thị Thu Thủy đã tận tình hướng dẫn, truyền thụ cho em những kiến thức
chuyên môn vô cùng quý báu cũng như lòng nhiệt tình trong suốt quá trình
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Em xin cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại
Học Mở Hà Nội đã tận tình dạy dỗ cho em những kiến thức cơ bản đồng thời
đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận này.

Đồng thời em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo – Kỹ sư
công nghệ sinh học đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình
học tập và hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình , bạn bè, những
người đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt thời gian
học tập và nghiên cứu.
Do thời gian và khả năng của bản thân còn hạn chế, vì vậy bài khóa
luận của em không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự chỉ
bảo của thầy cô và sự đóng góp ý kiến của các bạn để khóa luận của em được
đầy đủ và hoàn chỉnh hơn.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, ngày15 tháng 5 năm 2017.

Sinh viên
Trình Thị Thanh Hương

`


MỤCLỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
Phần 1:TỔNG QUAN .................................................................................... 3
1.1.Đại cương về kháng sinh .......................................................................... 3
1.1.1.Lịch sử về nghiên cứu kháng sinh ....................................................................3
1.1.2. Khái niệm về kháng sinh..................................................................................6
1.1.3. Phân loại kháng sinh ........................................................................................6
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh ......................................................................9
1.1.5.Các kháng sinh nhóm β-lactam ............................................................ 11
1.2.Đại cương về xạ khuẩn ........................................................................... 13

1.2.1. Đặc điểm chung của xạ khuẩn ...................................................................... 13
1.2.2.Cấu tạo xạ khuẩn ............................................................................................ 13
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh axit của xạ khuẩn. ...................... 17
1.3.Tổng quan xạ khuẩn Streptomyces clavunigerus .................................... 18
1.3.1.Giới thiệu về Streptomyces clavuligerus ....................................................... 18
1.3.2. Lịch sử nghiên cứu ........................................................................................ 21
1.3.4.Cơ chế hoạt động của axit clavulanic ............................................................ 22
1.3.5 Ứng dụng ........................................................................................................ 22
1.4.Mục tiêu và nội dung đề tài .................................................................... 23
1.4.1. Mục tiêu đề tài ............................................................................................... 23
1.4.2. Nội dung đề tài .............................................................................................. 23
1.4.3. Sơ đồ quy trình nghiên cứu:................................................................ 23
PHẦN 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 25
2.1. Vật liệu, hóa chất, môi trường nuôi cấy chủng VSVvà thiết bị .............. 25
2.1.1.Vật liệu và môi trường nuôi cấy chủng VSV ................................................ 25
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiếtbị.......................................................................... 25
2.2.Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 28
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy các chủng vi sinh vật ............................................... 28
`


2.2.2. Phương pháp bảo quản giống ....................................................................... 30
2.2.3.Phương pháp xác định khối lượng tế bào ...................................................... 30
2.2.4. Phương pháp thí nghiệm xác định khả năng sinh trưởng và sinh axit ........ 31
2.2.5. Phương pháp xác định hoạt tính axit ............................................................ 33
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 35
3.1.Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn Streptomyces
clavuligerus .................................................................................................. 35
3.1.1. Đặc điểm hình thái tế bào chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus ..... 35
3.1.2. Đặc điểm sinh hóa ......................................................................................... 37

3.1.3. Khả năng sinh axit clavulanic ức chế β-lactam của chủng xạ khuẩn
S.clavuligerus tự nhiên.................................................................................... 40
3.1.4. Khả năng hỗ trợ tăng hoạt tính axit của chủngS.clavuligerus .............. 41
3.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp ....................................................................................................... 42
3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng glycerol ............................................................. 42
3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng pepton ............................................................... 44
3.2.3. Ảnh hưởng của chất khoáng ......................................................................... 46
3.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy......................................................... 50
3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy................................................................ 50
3.3.2.Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................. 51
3.3.3.Ảnh hưởng của pH ......................................................................................... 53
3.3.4.Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm từ chủng S.clavuligerus54
Phần 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................... 55
4.1. Kết luận ................................................................................................. 55
4.2. Đề xuất .................................................................................................. 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO

`


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CKS
D

Chất kháng sinh
Đường kính trung bình vòng vô khuẩn tính theo
milimet

Gram (-)

Gram dương

Gram (+)

Gram âm

h

Giờ

HSCC

Hệ sợi cơ chất

HSKS

Hế sợi khí sinh

ISP2

The International Streptomyces Project (Chương trình
Streptomyces quốc tế)

LB

Luria Bertani

s

Độ lệch thực nghiệm hiệu chỉnh (độ lệch chuẩn)

v/p

Vòng/phút

VSV

Vi sinh vật

XK

Xạ khuẩn

`


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1 Cơ chế tác dụng của các kháng sinh ................................................. 10
Bảng 2.1 Dụng cụ và thiết bị dùng trong đề tài ............................................. 25
Bảng 2.2 Thành phần trong 1000ml môi trường giàu khoáng. ...................... 27
Bảng 2.3 Thành phần trong 1000ml môi trường ISP2 .................................. 27
Bảng 2.4 Môi trường LB .............................................................................. 28
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbonhydrat đến khả năng sinh trưởng và
sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus ................................................. 37
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nguồn nito đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng
hợp axit của chủng S.clavuligerus ................................................................ 39
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất khoáng đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng
hợp axit của chủng S.clavuligerus ................................................................ 39
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng và

sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus. ................................................ 40
Bảng 3.5 Kết quả về khả năng ức chế vi sinh vật của chủng xạ khuẩn.......... 41
Bảng 3.6 Thử các nồng độ kháng sinh. ......................................................... 41
Bảng 3.7 Kết hợp giữa axit clavulanic với kháng sinh amoxicilin ................ 42
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của hàm lượng glycerol đến khả năng sinh trưởng và
sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus ................................................. 43
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến khả năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus ........................................................ 45
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của hàm lượng K2HPO4 đến khả năng sinh trưởng và
sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus. ................................................ 46
Bảng 3.11 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả năng sinh trưởng
và sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus. ........................................... 48

`


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Nấm mốc Penicillium chrysogenum và bào tử của chúng ................ 3
Hình 1.2 Cơ chế tác dụng của kháng sinh .................................................... 10
Hình 1.3 Khuẩn ty của xạ khuẩn................................................................... 16
Hình 1.4 Bào tử xạ khuẩn ............................................................................ 17
Hình 1.5 Công thức phân tử axit clavulanic. ................................................. 20
Hình 1.6 Quá trình tổng hợp axit clavulanic ................................................. 21
Hình 3.1 Khuẩn lạc của chủng S.clavuligerus tự nhiên trên đĩa thạch........... 35
Hình 3.2 Hình thái khuẩn ty của chủng xạ khuẩn S.clavuligerus .................. 36
Hình 3.3 Bào tử của xạ khuẩn ...................................................................... 37
Hình 3.4 Màu sắc dịch nuôi sau 24h và 72h của chủng S.clavuligerus ......... 37
Hình 3.5 Ảnh hưởng của nguồn cacbonhydrat khác nhau đến khả năng sinh
trưởng và sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus. ................................ 38
Hình 3.6 Ảnh hưởng của nguồn nito khác nhau đến khả năng sinh trưởng và

sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus ................................................. 39
Hình 3.7 Ảnh hưởng của chất khoáng đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng
hợp axit của chủng S.clavuligerus ................................................................ 40
Hình 3.8 Vòng kháng khuẩn giữa 2 vi sinh vật kiểm định ............................ 41
Hình 3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng glycerol đến khả năng sinh tổng hợp axit
của chủng S.clavuligerus tự nhiên ................................................................ 43
Hình 3.10 Vòng kháng khuẩn của chủng ...................................................... 44
Hình 3.11 Ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến khả năng sinh tổng hợp axit
của chủng S.clavuligerus tự nhiên. ............................................................... 45
Hình 3.12 Vòng kháng khuẩn của B.cereus tại hàm lượng pepton khác nhau46
Hình 3.13 Ảnh hưởng của hàm lượng K2HPO4 đến khả năng sinh tổng hợp
axit của chủng S.clavuligerus tự nhiên ........................................................ 47
Hình 3.14 Vòng kháng khuẩn của B.cereus ở hàm lượng K2HPO4 khác nhau
..................................................................................................................... 47
`


Hình 3.16 Vòng kháng khuẩn của B.cereus tại các hàm lượng MgSO4.7H2O
khác nhau ..................................................................................................... 49
Hình 3.17 Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng
hợp axit của chủng S.clavuligerus tự nhiên .................................................. 50
Hình 3.18 Vòng kháng khuẩn của B.cereus tại thời gian nuôi cấy khác nhau
..................................................................................................................... 51
Hình 3.19 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng
hợp axit của chủng S.clavuligerus tự nhiên. ................................................. 52
Hình 3.20 Vòng kháng khuẩn của B.cereus nuôi cấy tại nhiệt độ khác nhau 52
Hình 3.21 Biểu đồ ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh
tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus tự nhiên........................................... 53
Hình 3.22 Vòng kháng khuẩn của B.cereus nuôi cấy tại pH khác nhau ....... 54
Hình 3.23 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của chủng S.clavuligerus....... 54

`


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

MỞ ĐẦU
Trung bình mỗi năm có 200.000 người chết/năm do kháng kháng sinh
và ước tính tới năm 2020 con số này lên tới khoảng 10.000.000 người/
năm.Cơn ác mộng mang tên kháng kháng sinh đang đến rất gần.Đó là hiện
tượng vi khuẩn không còn bị tiêu diệt bởi thuốc kháng sinh nữa. Đáng buồn là
điều này xảy ra do chính loài người chúng ta đã sử dụng kháng sinh bừa bãi
không đúng liều lượng tạo điều kiện cho vi khuẩn sống sót, thích nghi và tự
tiến hóa gen kháng thuốc.Chúng sinh sôi nảy nở rất nhanh và phát triển thành
một loại mới.
Hàng năm có tới hơn 50.000 người tại Mỹ chết vì nhiễm trùng mà không
có thuốc chữa. Chúng ta đang quá chậm trong cuộc chạy đua với chúng và
đến một ngày con người sẽ chết vì một vết thương nhỏ do kháng sinh đã
không thể ngăn chặn vi khuẩn tiêu diệt con người nữa.
Việc kiểm soát các loại bệnh này đã và đang chịu sự tác động bất lợi của
sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn.Kết quả
phân lập vi khuẩn cho thấy tỷ lệ kháng penicillin ở Việt Nam cao nhất
(71,4%) tiếp theo là Hàn Quốc (54,8%), Hồng Kông (43,2%) và Đài Loan
(38,6%). Tỷ lệ kháng erythromycin cũng rất cao, ở Việt Nam là 92,1%, Đài
Loan là 86%, Hàn Quốc là 80,6%, Hồng Kông là 76,8% và Trung Quốc là
73,9%.
Hiện nay sử dụng các chất ức chế β- lactamase kết hợp với kháng sinh βlactam được coi là biện pháp hiệu quả chống lại cơ chế kháng thuốc đặc hiệu
của vi khuẩn. Phổ kháng khuẩn của axit được mở rộng trên các chủng vi

khuẩn đề kháng do khả năng ức chế dẫn đến bất hoạt đa số β-lactamase tiết ra
bởi vi khuẩn gram âm, gram dương và vi khuẩn kỵ khí. Các thử nghiệm lâm
sàng cho thấy chế phẩm phối hợp có hiệu quả trong điều trị các bệnh nhiễm
trùng đường hô hấp, nhiễm trùng ổ bụng, nhiễm trùng da và mô mềm. Cũng
có các bằng chứng ghi nhận hiệu quả điều trị của các kháng sinh này trong

Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

1


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

điều trị sốt giảm bạch cầu trung tính và nhiễm trùng bệnh viện, đặc biệt khi
kết hợp với các axit khác.
Một trong những nguyên nhân vi khuẩn kháng kháng sinh là vi khuẩn
tiết ra các enzyme β-lactamase khác nhau ở một số vi khuẩn gây bệnh. Các βlactamase phổ rộng là những enzyme được tạo bởi các vi khuẩn gram âm, có
khả năng thủy phân các kháng sinh β-lactam có chứa một nhóm oxyimino
(các cephalosporins thế hệ 3) nhưng chúng lại bị ức chế bởi các axit
clavulanic.
Hiện nay, các chế phẩm phối hợp axit β-lactam và chất ức chế βlactamase

được

sử

dụng

rộng

rãi

bao

gồm

amoxicilin/axit

clavulanic,ampicilin/axit clavulanic. Axit clavulanic được sinh tổng hợp từ
chủng Streptomyces clavuligerus đã và đang được quan tâm và nghiên cứu
rất nhiều nước trên thế giới trong đó có cả Việt Nam,chủng xạ khuẩn này rất
có triển vọng ứng dụng thực tiễn. Chính vì vậy,song song với việc tìm ra các
loại thuốc kháng sinh mới thì việc nâng cao hiệu suất quá trình tổng hợp axit
clavulanic – chế phẩm phối hợp giúp tăng hoạt tính kháng sinh nhóm nghiên
cứu thực hiện đề tài:“Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh
trưởng-sinh tổng hợp acid clavulanic sinh ra từ chủng xạ khuẩn
Streptomyces clavuligerus ”.

Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

2


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

PHẦN 1-TỔNG QUAN

1.1.Đại cương về kháng sinh
1.1.1.Lịch sử về nghiên cứu kháng sinh
a. Trên Thế giới
Năm 1928, Alexander Fleming, một nhà khoa học Scotland,lần đầu tiên
thấy trong môi trường nuôi cấy tụ cầu vàng nếu có lẫn nấm Penicillium thì
khuẩn lạc gần nấm sẽ không phát triển được.Năm 1939,Florey và Chain đã
chiết ra được ra từ nấm đó chất Penicillin dùng trong điều trị.

Hình 1.1 Nấm mốc Penicillium chrysogenum và bào tử của chúng
[32], [33].

Vìbộ phận sinh sản của loài nấm mốc đó có hình dạng giống cái bút
lông nên được đặt tên là Penicillium(tiếng la tinh Penicillium nghĩa là cái bút
lông).
Năm 1938, Fleming nhận được thư của hai nhà khoa học từ trường Đại
học Oxford là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, với lời đề nghị
được hợp tác với ông để tiếp tục thực hiện công trình nghiên cứu về Penicillin
và họ thử nghiệm thành công Penicillin trên chuột vào năm 1940.
Năm 1944,nhóm đã chọn được loại nấm sinhPenicillin ưu việt nhất là
chủng Penicillium chrysogenum, chế tạo loại Penicillin có hoạt tính cao hơn
cả triệu lần Penicillin do Flemming tìm thấy lần đầu năm 1928.

Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

3


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

Năm 1945,Fleming được giải thưởng Nobel về y học cùng Ernst Boris
Chain và Howard Walter Florey.
Cùng với việc phát hiện ra Penicilin,thập kỉ 40-50 của thế kỉ XX cũng
ghi nhận những bước tiến vượt bậc trong việc khám phá ra hàng loạt chất
kháng sinh (CKS) mới có giá trị trong y học như:Sulfonamid (Gerhard
Domard,1932),

Streptomycin(Selman

Waksmanvà

Albert Schat,1944),

Cloramphenicol(Erhlich,1947), Chlotetraxyclin (Dugar,1948),…
Tốc độ tìm kiếm các CKS ngày càng được đẩy mạnh.Nhiều trung tâm
nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều nước trên
thế giới vẫn liên tục phát hiện hàng loạt CKS mới có giá trị ứng dụng trong
thực tiễn.Năm 1945 phát hiện được 30 CKS, năm 1949 con số này là 150
CKS, năm 1953 xấp xỉ 450 CKS, năm 1980 có 5.500 chất và đến nay số
lượng CKS được phát hiện lên tới 17.000 chất và khoảng 30.000 CKS bán
tổng hợp,[2],[7].Tuy nhiên, trong số đó chi có 1÷2% CKS là có đủ tiêu chuẩn
để được sử dụng trong y học.
Năm 1999, kháng sinh Lospomal HA – 92 được tách chiết từ xạ khuẩn
Streptomyces CDRLL – 312, cótác dụng ngăn chặn cholesterol, tăng sức đề
kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt
tính chống nấm gây bệnh mạnh.
Tại Nhật Bản, năm 2003Yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn
Streptomyces sp. TP – A0356 bằng phương pháp sắc ký cột. CKS này có khả
năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans. Chất

này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư, có giá trị MIC là 0,01÷ 0,3
mg/ml.
Tại Hàn Quốc, năm 2007 phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp.
C684 sinh CKS Laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã
kháng Methicillin và các cầu khuẩn kháng Vancomycin.
Năm 2002, tại Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp. 201 có
khả năng sinh CKS mới là 2 - methylheptyl isonicotinate, CKS này có khả
Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

4


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Furasium oxysporum, F.
Solina,...
b.Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, người đầu tiên nghiên cứu CKS là giáo sư Đặng Văn Ngữ.
Ông đã lấy dịch nuôi cấy nấm Penicillium chrysogenum và xạ khuẩn
Streptomycesgrieus để điều trị vết thương cho thương binh trong chiến dịch
Đông Xuân 1951-1952, kháng chiến chống Pháp.
Năm 1968, bộ môn công nghiệp Dược (trường Đại học Dược Hà Nội)
được thành lập và đào tạo cán bộ chuyên khoa kháng sinh chuẩn bị cho công
nghiệp kháng sinh.Năm 1970, đơn vị nàybắt đầu nghiên cứu chuyên đề kháng
sinh do GS. Trương Công Quyền phụ trách.Tại đâyđã phân lập được hàng
nghìn chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất khác nhau.Đáng chú ý là đã tuyển chọn
được một chủng có khả năng chống vi khuẩn Gram (-), có hiệu quả tốt đối với
vi khuẩn gây bệnh mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa). Kháng sinh này lấy

tên là Dekamycin và sau này được xác định là Neomycin.
Từ năm 1974,tại Viện Khoa học Việt Nam (nay là Viện Khoa học và
Công Nghệ Việt Nam) đã có một nhóm nghiên cứu về CKS.Nhiều chủng
VSV sinh CKS có hoạt tính mạnh đã được ứng dụng trong bảo vệ thực
vật.Một số chế phẩm kháng sinh như: Tetravit, Biovit, Baxitraxin…đã được
sản xuất và đưa vào sử dụng trong chăn nuôi.
Sau đó Việt Nam được nhiều đối tác nước ngoài như Liên Xô (cũ), Trung
Quốc, Tây Ban Nha, Triều Tiên hợp tác và giúp sản xuất điều chế kháng sinh
song cũng không thành công do nhiều nguyên nhân.
Từ năm 1985 – 1990, một chương trình nghiên cứu cấp Nhà nước
vềsản xuất thử kháng sinh Oxytetracyclin và Tetracyclin nhưng kết quả đạt
được không cao về công nghệ lẫn hiệu suất.
Từ năm 2000 đến nay, ở nước ta cũng có một số nhóm đã và đang tham
gia nghiên cứu về kháng sinh và thu được một số kết quả như: nghiên cứu tối
ưu điều kiện lên men và môi trường sản xuất kháng sinhVancomycin từ
chủng Streptomyces orientalis (2004); nghiên cứu quy trình công nghệ lên
men sản xuất Vancomycin (2006); nghiên cứu quy trình tách chiết, tinh chế
Doxorubicin (DXR)từ xạ khuẩn làm nguyên liệu điều chế thuốc điều trị ung
thư và hệ bạch huyết.

Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

5


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

Ở Việt Nam cũng sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ

thực vật nhập khẩu từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số
chủng xạ khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và F.
oxysporum gâybệnh thối rễ ở thực vật. Tuy nhiên việc sử dụng CKS trong
lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác
chỉ quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định.
1.1.2 Khái niệm về kháng sinh
Từ năm 1941, khi Penicillin được đưa vào sản xuất để dùng trong lâm
sàng thì kháng sinh được coi là “những sản phẩm trao đổi tự nhiên được các
VSV tạo ra, có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với
các VSV khác”.
Về sau với sự phát triển của khoa học người ta có thể phát triển tổng
hợp, bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (Chloramphenicol); tổng hợp nhân
tạo các chất có tính kháng sinh Sulfamid, Quynolon hay chiết xuất từ VSV
những chất diệt được tế bào ung thư (Antinomycin). Vì thế định nghĩa kháng
sinh đã được thay đổi “khángsinh là những chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc
tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các VSV nhiễm
sinh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật
hoặc thực vật bằng con đường cung cấp chung”,[25].
1.1.3 Phân loại kháng sinh
Có nhiều cách phân loại kháng sinh tùy theo mục đích nghiên cứu và
cách sử dụng chúng. Có thể dựa vào mức độ tác dụng, dựa vào phổ tác dụng
kháng sinh, dựa vào nguồn gốc, dựa vào cơ chế tác dụng và cấu trúc hóa học
của chất kháng sinh [25].
1.1.3.1Dựa theo cấu trúc hóa học
Phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học nhất, đưa ra
một cái nhìn tổng quát nhất đối với các nhóm kháng sinh. Theo đó, kháng
sinh được phân thành 9 nhóm chính [25].
1) Các kháng sinh cacbonhydrat
Các saccarid thuần nhất (nojimycin)
Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

6


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

Các aminiglycosid (streptomycin)
Các ortozomycin (eveminomycin)
Các N-glycosid (streptortycin)
Các glycoside peptid (vancomycin)
Các glycolipid (moenomycin)
2) Các lacton macrocyclic
Các kháng sinh macrolid (erythromycin)
Các kháng sinh polyen (nystatin)
Các anzamycin (rifamycin)
Các macrotetrolid (tetranacin)
Các benzoquinon (mitomycin)
3) Các kháng sinh quinon và dẫn xuất
Các tetracylin (tetracylin)
Các antracylin (adriamycin)
Các naftoquinon (actinorodin)
Các benzoquinon (mitomycin)
4) Các kháng sinh peptid và acid amin
Các dẫn chất axit amin (cycloserin)
Các kháng sinh β-lactam (penicillin)
Các kháng sinh peptid (bacitracin)
Các cromopeptid (actinomycin)
Các depipeptid (valinomycin)

Các peptid tạo kelat (bleomycin)
5) Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ
Các kháng sinh nucleozid (polyoxin)
6) Các kháng sinh dị vòng chứa oxi
Các polyete (monenzin)
7) Các kháng sinh mạch vòng no
Các dẫn chất alkan (cyclohexamid)
Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

7


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

Kháng sinh stroid (acid fuzidic)
8) Các kháng sinh chứ nhân thơm
Các dẫn chất benzene (chloramphenincol)
Các chất nhân thơm ngưng tụ (griseofulvin)
Các ete thơm (novobiovin)
9) Các kháng sinh mạch thẳng
Các chất chứa P (phosphomycin)
Dựa vào phổ tác dụng kháng sinh
Nhóm có phổ tác dụng hẹp, chỉ tác dụng lên một loại hay một nhóm vi
khuẩn nào đó: Penicillin cổ điển chỉ tác dụng lên vi khuẩn Gram (+) hay
nhóm thuốc tác dụng lên vi khuẩn Gram (-) như Streptomycin.
Nhóm kháng sinh có tác dụng rộng, chúng có tác dụng với cả vi khuẩn
Gram (+), Gram (-), Rickestsia, virus cỡ lớn, đơn bào: Chloramphenicol,
Tetracillin.

Nhóm kháng sinh dùng ngoài là các chất kháng sinh không hoặc ít
được hấp thụ ở đường tiêu hóa. Chất kháng sinh này thường độc, bao gồm
các kháng sinh có tác dụng với vi khuẩn Gram(-) như: Baxitraxin,
Heliomycin: tác dụng vớivi khuẩn Gram (-) như Neomycin, Polymycin.
Nhóm kháng sinh chống lao: Rifamycin.
Nhóm kháng sinh chống nấm như: Nystatin, Frycefulvin, AmpoterytinB.
Dựa vào nguồn gốc
Kháng sinh có nguồn gốc từ sinh vật, xạ khuẩn.
Nhóm kháng sinh có nguồn gốc hóa dược hay do con người tổng hợp
nên.
Dựa vào cơ chế tác dụng
Dựa vào cơ chế tác dụng người ta chia thành 2 nhóm:
Nhóm kháng sinh có tác dụng lên tế bào vi khuẩn gồm các kháng
sinh:
Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

8


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

- Nhóm kháng sinh tác dụng lên quá trình tạo vách tế bào: Penicillin và
các chất thuộc nhóm β – lactamin, Vanomycin, Baxtracin…
- Kháng sinh tác dụng lên màng tế bào. Các chất này làm rối loạn tính
thấm của vỏ và màng nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn, làm cho chức
năng hàng rào bị phá hủy, vi khuẩn bị rối loạn quá trình động hóa và dị hóa.
Do vậy mất khả năng lấy chất dinh dưỡng cần thiết và thải các sản phẩm của
quá trình dị hóa ra ngoài: Colisstin, Polymycin…

Nhóm kháng sinh tác dụng lên hệ phi bào làm rối loạn các họat
động sống của tế bào trong nguyên sinh chất bao gồm:
- Kháng sinh làm rối loạn và ức chế tác dụng tổng hợp protein của tế
bào vi khuẩn ở mức ribosome. Vi khuẩn không tạo nên các chất tham gia vào
quá trình phân chia, di truyền của tế bào vi khuẩn.
- Kháng sinh ức chế sự tổng hợp nên các acid nucleic: DNA và RNA.
Các kháng sinh này rất động, cùng để chữa ung thư, ít dùng trong thú y.
Dựa vào mức độ tác dụng.
Kháng sinh diệt khuẩn là những kháng sinh có cơ chế tác dụng đến khả
năng tạo vách tế bào, sinh tổng hợp ADN và ARN, giải phòng men autolyza,
vi khuẩn tự phân giải như: nhóm Lactamin gồm các loại Penicillin và các chất
kháng sinh thuộc nhóm Stephalosporin, nhóm Aminoglucozid (Streptomycin,
Neomycin, Canamycin, Gentamycin, Framonomycin), nhóm đa peptid:
Colistin, Bacitracin, Vanomycin.
Chất kháng sinh kìm khuẩn gồm các chất ức chế sinh tổng hợp protein
của vi khuẩn bằng cách gắn các emzyme hay các ribosome 30S, 50S, và 70S
như: Slphamid Teracillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Novobiocin, các
chất kháng sinh được phối hợp giữa Sulphamid với Trimethorpim theo tỉ lệ
5/1 và Tiamulin.
1.1.4Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

9


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

Hình 1.2 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
rất khác nhau của tế bào VSVgây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí chính
xác hay các phân tử đích của tế bào VSV mà tạo ra các phản ứng trao đổi
chất.Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong
nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết. Nhìn chung, có
thể phân chia cơ chế tác dụng của kháng sinh theo các nhóm kháng sinh như
bảng 1:
Bảng 1 Cơ chế tác dụng của các kháng sinh

Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

10


Khoa Công nghệ Sinh học

Nơi tác dụng

Viện Đại học Mở Hà Nội

Kháng sinh

Quá trình bị ngăn cản

Loại tác
dụng

Thành tế bào

Bacitracin

Tổng hợp mucopeptid

Diệt khuẩn

Các

Thành tế bào

-

cephalosporin

Thành tế bào

-

Các penicillin

Tổng hợp peptid của

-

Cycloserin

thành tế bào
Tổng hợp mucopeptid

-

Amphotericin B

Chức năng của màng

Diệt nấm

Nystatin

Chức năng của màng

-

Polymycin

Tương tác của màng

Diệt khuẩn

Tổng hợp protein

Kháng

Vancomycin
Màng tế bào

Các Ribosom Chloramphenicol

khuẩn
Tiểu phân

Erythromycin

Tổng hợp protein

50S

khuẩn

Tiểu phân

Các

Tổng hợp protein và làm

30S

aminoglycosid

sai lệch quá trình này
Tổng hợp protein

Các tetracyclin
Các axit

Kháng

Actinomicin

nucleic

Diệt khuẩn
Kháng
khuẩn

Tổng hợp ADN và

Diệt khuẩn

m.ARN
Griseofulvin

Phân chia tế bào

Kháng nấm

ADN hoặc

Mitomycinl

Tổng hợp ADN

Diệt nấm

ARN

Rifampin

Tổng hợp mARN

Diệt khuẩn

1.1.5 Các kháng sinh nhóm β-lactam

Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

11


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

Giới thiệu về kháng sinh nhóm β- lactam
• Amoxycillin

Amoxycillin hoặc moxicillin hay được gọi tắt là amox, là thuốc kháng
sinh cùng họ với penicilin thuộc nhóm kháng sinh β- lactam, nó ngăn chặn và
diệt các loại vi khuẩn gram dương như viêm họng, da tấy mủ hay nhiễm trùng
da, nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm phổi…
Công thức phân tử:C16H19N3O5S

Công thức hóa học:
• Ampicillin

Ampicillin là kháng sinh phổ rộng thuộc nhóm β- lactam, tức là nhóm kháng
sinh có cấu trúc phân tử gồm khung β- lactam.
Ampicillin thực chất là một penicillin bán tổng hợp nhóm A có phổ tác
dụng rộng với nhiều chủng vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-).
Ampicillin có tác dụng chống lại những vi khuẩn mẫn cảm gây nhiễm khuẩn

đường hô hấp, dẫn mật, tiêu hoá, tiết niệu, một số bệnh ngoài da như viêm bì
có mủ, áp -xe, đầu đinh... viêm tai giữa, bàng quang và thận...
Ampicilin là một kháng sinh tương tự penicilin tác động vào quá trình
nhân lên của vi khuẩn, ức chế sự tổng hợp mucopeptid của thành tế bào vi
khuẩn nhưng không có khả năng kháng β- lactamase.

Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

12


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

Công thức hóa học:
Công thức phân tử:C16H19N3O4S
1.2Đại cương về xạ khuẩn
1.2.1 Đặc điểm chung của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất đa dạng trong đó đa số sinh
trưởng hiếu khí và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm. Tên xạ khuẩn
là actinomycete, bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và “mykes” (nấm).
Ban đầu xạ khuẩn được coi là nấm nhỏ vì chúng sinh trưởng giống với nấm.
Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc ngành Tenericutes
(gồm vi khuẩn Gram (+) và xạ khuẩn(-), thuộc giới vi khuẩn thật và vi khuẩn
nhân sơ. Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ
Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài trong đó
có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chị còn lại được
xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm [33].

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt
độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 25-30oC. Tuy nhiên, nhiệt độtối ưu cho
sinh tổng hợp chất kháng sinh thường chỉ nằm trong khoảng 18-28oC. Độ ẩm
thích hợp đối với xạ khuẩn dao động trong khoảng 40 - 50%, giới hạn pH
trong khoảng 6,8 – 7,5. Xạ khuẩn không có giới tính, [25]. Xạ khuẩn có khả
năng hình thành enzyme và các chất kháng sinh nên được ứng dụng vào trong
nhiều lĩnh vực của đời sống.
1.2.2Cấu tạo xạ khuẩn

Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

13


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram (+), toàn bộ cơ
thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh
chất, nguyên sinh chất, chất nhân.
Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác
dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp:
lớp ngoài cùng dày khoảng 60 ÷ 120 Å, khi già có thể đạt tới 150 ÷ 200Å, lớp
giữa rắn chắc, dày khoảng 50Å, lớp trong dày khoảng 50Å. Các lớp này chủ
yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptitbao gồm các gốc N -axetyl glucozamin liên
kết với N-axetyl muramic. Khi xử lý bằng lysozym, thành tế bào bị phá huỷ
tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế
bào với hỗn hợp este - clorofom và các dung môi hoà tan lipit khác. Nguyên
nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipit (thành HSKS có

nhiều lipit hơn so với HSCC) khác với nấm. Thành tế bào xạ khuẩn không
chứa xenlulozơ và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao
đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào,[16], [23], [26],
[29].
Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4
nhóm chính,[14], [8].
Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L
- ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.
Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso -2,6diaminopimelic (m - ADP) và glyxin.
Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso -2,6diaminopimelic.
Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso -2,6diaminopimelic, arabinozơ và galactozơ.

Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

14


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo
chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt
quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ
khuẩn.
Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với
tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật
prokaryot ở chỗ chúng có tỷ lệ G-C rất cao trong ADN, thường lớn hơn 55%,
trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 ÷ 45%,[10].
Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram (+) nên ngoài yếu tố di truyền trong

nhiễm sắc thể (NST) còn có các yếu tố di truyền ngoài NST, chúng có thể tự
nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế bào
nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như: có thêm khả năng phân giải một số hợp
chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển
gen, sản xuất các CKS trong đất và môi trường tuyển chọn, [13].
Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng
là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là
protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối
amôn…Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau
là khác nhau.
a.Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh
và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử), [9].
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng
nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ,
da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.
Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào
điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường kính
mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,52 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường
Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

15


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

kính 1cm hoặc lớn hơn. Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện
chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.

b.Khuẩn ty

Hình 1.3 Khuẩn ty của xạ khuẩn

Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một
loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (HSCC hay khuẩn ty cơ
chất) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển trên bề mặt
thạch gọi là hệ sợi khí sinh (HSKS hay khuẩn ty khí sinh) với chức năng chủ
yếu là sinh sản.
Nhiều loại chỉ có HSCC nhưng cũng có loại lại chỉ có HSKS (như chi
Sporichthya). Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ
dinh dưỡng.
Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm
trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu
cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra
trong môi trường.
c. Bào tử của xạ khuẩn

Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

16


Khoa Công nghệ Sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

Hình 1.4 Bào tử xạ khuẩn

Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí

sinh gọi là cuống sinh bào tử. Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạkhuẩn.
Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhấttrong
phân loại xạ khuẩn.
Bào tửxạ khuẩn được bao bọc bởi màng polysaccarit giàu protein với độ
dày khoảng 300 ÷ 400 Å,chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những
tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH…
Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính
trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại xạ
khuẩn. Tuy nhiên, những tính trạng này cũng có thể có những thay đổi nhất
định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau, [12].
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh axit của xạ khuẩn.

Ảnh hưởng của nguồn cacbon.
Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trưởng và hình
thành axit . Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh
bột. Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại
đường là khác nhau, có chủng sử dụng tốt các loại đường đơn như glucozơ,
mannozơ,glycerol, fructozơ...có chủng sử dụng tốt loại đường đôi như
saccarozơ, maltozơ...Ngoài ra một số chủng còn có thể sử dụng các loại axit
hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong lên men sinh axit .
Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302

17