Nghiên cứu điều kiện lên men và thu hồi một số hoạt chất sinh học của chủng nấm cordyceps militaris FNA5

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------o0o------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ THU HỒI MỘT SỐ
HOẠT CHẤT SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM Cordyceps militaris FNA5

Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Phí Quyết Tiến
TS. Phạm Thanh Huyền
Sinh viên:

Nguyễn Thị Thu Hiền

Lớp:

1302

Hà Nội - 2017


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp
ngành Công nghệ sinh học, em đã nhận đƣợc nhiều sự giúp đỡ quý báu từ
phía Thầy cô, bạn bè và ngƣời thân.
Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, em xin đƣợc gửi

lời cảm ơn đặc biệt tới TS. Phí Quyết Tiến, Phòng Công nghệ lên men, Viện
Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; TS.
Phạm Thanh Huyền, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là hai Thầy cô đã tạo điều
kiện, tận tâm hƣớng dẫn em từ những bƣớc đi chập chững đầu tiên, những
bƣớc tiếp cận đầu tiên trong nghiên cứu khoa học.
Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới các Thầy cô giáo trong khoa Công
nghệ sinh học, các giáo viên phụ trách, các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm đã
tạo mọi điều kiện hƣớng dẫn, giúp đỡ và góp ý kiến giúp em trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
Em cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các anh chị làm
việc tại Phòng Công nghệ lên men và các bạn sinh viên đã dành thời gian quý
giá của mình để giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập để đạt đƣợc kết quả
tốt nhất.
Và cuối cùng em xin đƣợc cảm ơn gia đình, ngƣời thân và bạn bè đã
động viên em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, giúp em
vƣợt qua rất nhiều khó khăn cả trong công việc, cuộc sống và hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp một cách thuận lợi nhất.
Hà Nội, tháng 05 năm 2017
Sinh viên
Nguyễn Thị Thu Hiền

Nguyễn Thị Thu Hiền

i


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. v
DANH MỤC VIẾT TẮT ....................................................................................... vii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
1.1. Giới thiệu về chủng nấm Đông trùng hạ thảo ............................................... 3
1.1.1. Sơ lƣợc về lịch sử nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo .............................. 3
1.1.2. Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên.............................. 6
1.2. Một số chất có hoạt tính sinh học từ nấm Đông trùng hạ thảo .................... 7
1.2.1. Cordycepin ...................................................................................................... 7
1.2.2. Adenosine ........................................................................................................ 9
1.2.3. Polysaccharide ................................................................................................ 9
1.2.4. Các hợp chất khác ......................................................................................... 10
1.3. Giá trị dƣợc liệu của các hoạt chất sinh học tới sức khỏe con ngƣời ........ 12
1.4. Ứng dụng công nghệ lên men chìm nấm Cordyceps spp. để sản xuất sinh
khối và exopolysaccharide (EPS) .......................................................................... 14
1.5. Thu hồi sinh khối và hoạt chất từ Cordyceps spp....................................... 17
1.6. Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trong và ngoài nƣớc ....... 18
1.6.1. Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trên thế giới ..................... 18
1.6.2. Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam ..................... 19
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP................................................. 20
2.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 20
2.1.1. Chủng giống .................................................................................................. 20
2.1.2. Hóa chất ......................................................................................................... 20
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu .................................................................... 20
2.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy ..................................................................................... 20
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 21

Nguyễn Thị Thu Hiền

ii


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

2.2.1. Phƣơng pháp bảo quản giống ...................................................................... 21
2.2.2. Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy..................................................................... 21
2.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng và phát triển của nấm... 22
2.2.3.1. Nhiệt độ lên men ....................................................................................... 22
2.2.3.2. pH môi trƣờng lên men ............................................................................. 22
2.2.3.3. Tỷ lệ tiếp giống .......................................................................................... 23
2.2.4. Phƣơng pháp xác định các chất có hoạt tính dƣợc học của nấm Đông trùng
hạ thảo .................................................................................................................... 23
2.2.4.1. Xác định Cordycepin................................................................................. 23
2.2.4.2. Xác định Polysaccharide ........................................................................... 24
2.2.5. Nghiên cứu tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ các chủng nấm .. 25
2.2.5.1. Phƣơng pháp tách chiết Cordycepin ........................................................ 25
2.2.5.2. Phƣơng pháp tách chiết Polysaccharide................................................... 26
3.1. Đặc điểm sinh học các chủng nấm ký sinh côn trùng .................................. 27
3.2. Lựa chọn môi trƣờng nhân giống thích hợp ................................................. 28
3.3. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp....................................................... 31
3.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng phát triển của chủng nấm .32
3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ............................................................................... 33
3.4.2. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ban đầu...................................................... 34
3.4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ ............................................................................... 36
3.4.4. Ảnh hƣởng của thể tích ................................................................................ 38

3.5. Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học của
chủng nấm (trong hệ thống bình lên men 5 lít) ..................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 43

Nguyễn Thị Thu Hiền

iii


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Bảng phân loại khoa học ................................................................ 3
Bảng 1.2. Mô tả hình thái một số loài nấm thuộc chi Cordyceps ................... 5
Bảng 3.1. Đặc điểm sinh học của các chủng nấm ký sinh côn trùng .............. 27
Bảng 3. 2. Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm C. militaris FNA5 trên các môi
trƣờng khác nhau theo thời gian nuôi cấy ....................................................... 28
Bảng 3. 3. Khả năng phát triển của chủng C. militaris FNA5 trên các nhiệt độ
khác nhau theo thời gian (đƣờng kính khuẩn lạc, cm) .................................... 33
Bảng 3. 4. Lƣợng sinh khối thu đƣợc chủng C. militaris FNA5 trên các giá trị
pH khác nhau theo thời gian ........................................................................... 35
Bảng 3. 5. Lƣợng sinh khối thu đƣợc chủng C. militaris FNA5 trên các giá trị
nồng độ khác nhau theo thời gian ................................................................... 37
Bảng 3. 6. Lƣợng sinh khối thu đƣợc chủng C. militaris FNA5 trên các giá trị
thể tích khác nhau theo thời gian .................................................................... 39

Nguyễn Thị Thu Hiền

iv


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Nấm Đông trùng hạ thảo loài Cordyceps militaris ........................... 4
Hình 1.2. Một số hình thái của các chủng nấm thuộc chi Cordyceps.............. 5
Hình 1.3. Hình thái tự nhiên một số loài nấm :A- C. sinensnis; B-C. gunnii;
C-C. barnesii; D- C. gracilis; E- C. liangshanensis; F-C. militaris ................. 6
Hình 1. 4. Cấu trúc hóa học của Cordycepin và Adenosine ............................. 8
Hình 3.1. Hình ảnh bề mặt khuẩn lạc chủng FNA5 trên đĩa thạch sau 15 ngày
nuôi cấy ............................................................................................................. 28
Hình 3.2 Hình thái túi bào tử lúc mới nẩy mầm và bào tử khi trƣởng thành
chủng FNA5 sau 10 ngày nuôi cấy (SEM, x 3.500 và 7.500 lần) .................... 29
Hình 3. 3. Hình thái khuẩn lạc chủng C. militaris FNA5 trên các môi trƣờng
rắn theo thời gian nuôi cấy. ............................................................................... 29
Hình 3. 4. Biểu đồ đƣờng kính khuẩn lạc của chủng C. militaris FNA5 trên
các môi trƣờng khác nhau theo thời gian (đƣờng kính khuẩn lạc, cm) ............ 31
Hình 3.5. Biểu đồ sự ảnh hƣởng của các môi trƣờng khác nhau tới khả năng
phát triển của chủng C. militaris FNA5 theo thời gian nuôi cấy ...................... 31
Hình 3.6. Biểu đồ sự ảnh hƣởng của các môi trƣờng khác nhau tới khả năng
sinh EPS của chủng C. militaris FNA5 theo thời gian nuôi cấy....................... 31
Hình 3.7. Hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
CNLM của dịch sau lên men chủng C. militaris FNA5 trên môi trƣờng MPA
theo thời gian nuôi cấy ...................................................................................... 32
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sự phát triển của chủng nấm FNA5 trên
đĩa petri sau 7 ngày ........................................................................................... 33

Hình 3. 9. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của nấm C. militaris FNA5 ở
các giá trị pH khác nhau .................................................................................... 35
Hình 3. 10. Hàm lƣợng EPS thu đƣợc chủng C. militaris FNA5 trên các giá trị
pH khác nhau theo thời gian ............................................................................. 36

Nguyễn Thị Thu Hiền

v


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

Hình 3. 11. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của nấm C. militaris FNA5 ở
các tỷ lệ giống. .................................................................................................. 37
Hình 3. 12. Hàm lƣợng EPS thu đƣợc chủng C. militaris FNA5 trên các giá trị
nồng độ khác nhau theo thời gian. .................................................................... 38
Hình 3. 13. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của nấm C. militaris FNA5 ở
các thể tích khác nhau. ...................................................................................... 38
Hình 3. 14. Hàm lƣợng EPS thu đƣợc chủng C. militaris FNA5 trên các giá trị
thể tích khác nhau theo thời gian. ..................................................................... 39
Hình 3. 15. Chu kỳ sinh trƣởng của chủng C. militaris FNA5 trong thời gian
18.5 ngày ........................................................................................................... 40
Hình 3. 16. Kết quả đo phổ xác định hàm lƣợng cordycepin trong dịch lên
men của chủng nấm C. militaris FNA5 ............................................................ 41

Nguyễn Thị Thu Hiền

vi

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

DANH MỤC VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nội dung

EPS

Exopolysaccharide (Extracellular polysaccharide)
Polysaccharide ngoại bào

rpm

Tốc độ lắc vòng/phút

w/v

Khối lƣợng/thể tích

w/w

Khối lƣợng/ khối lƣợng

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

Nguyễn Thị Thu Hiền

vii


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Nấm Đông trùng hạ thảo là một loại nấm ký sinh trên côn trùng, không
chỉ đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu, mà còn đƣợc cả xã hội quan tâm đến,
vì nấm là loại dƣợc liệu quý, rất tốt cho sức khỏe con ngƣời, phù hợp với mọi
lứa tuổi, từ trẻ con, phụ nữ mang thai, thanh thiếu niên, cho đến ngƣời già.
Theo các tài liệu ghi chép về đông dƣợc cổ, Đông trùng hạ thảo là một vị
thuốc bồi bổ hết sức quý giá, có tác dụng tích cực đối với các bệnh nhƣ rối
loạn tình dục, thận hƣ, liệt dƣơng, đau lƣng, mỏi gối, ho hen, và có tác dụng
tốt đối với trẻ em còi xƣơng chậm lớn. Một số nghiên cứu hiện tại gần đây đã
chỉ ra rằng nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng làm tăng cƣờng công năng
của tuyến thƣợng thận, cải thiện đƣợc chức năng thận, nâng cao năng lực
miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thƣ và chất phóng xạ.
Trên thế giới, nấm Đông trùng hạ thảo đã đƣợc các nhà khoa học
nghiên cứu và thu đƣợc rất nhiều thành tựu có giá trị. Với công nghệ sinh học
tiên tiến, nhiều nƣớc đã thành công trong việc nuôi cấy nhân tạo các chủng
nấm thuộc chi Cordyceps và thƣơng mại hóa các sản phẩm của chúng.Hiện
nay, với phƣơng pháp lên men đƣợc sử dụng chủ đạo, các sản phẩm thƣơng
mại sinh khối nấm ký sinh đã đƣợc sản xuất rất thành công ở Trung Quốc,

Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ. Các chất chiết xuất sau quá trình lên men chứa đầy
đủ các hợp chất có hoạt tính sinh học tƣơng tự nhƣ nấm ký sinh nguồn gốc tự
nhiên.
Ở Việt Nam việc nghiên cứu về nấm Đông trùng hạ thảo vẫn còn gặp
nhiều khó khăn cả về cơ sở vật chất cũng nhƣ kiến thức. Chúng ta sử dụng
chủ yếu dựa trên khai thác tự nhiên hay nhập khẩu từ Trung Quốc, nguồn gốc
và chất lƣợng không rõ ràng, giá cả đắt đỏ và không đáp ứng đƣợc nhu cầu
cho xã hội.

Nguyễn Thị Thu Hiền

1


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

Để góp phần vào nghiên cứu và phát triển nâng cao thị trƣờng sản xuất
nấm dƣợc liệu Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam, chúng tôi đã thực hiện đề tài
“Nghiên cứu điều kiện lên men và thu hồi một số hoạt chất sinh học của
chủng nấm Cordyceps militaris FNA5”. Với mục đích tìm ra đƣợc điều kiện
nuôi cấy phù hợp nhằm tạo ra các hợp chất có hoạt tính sinh học bởi chủng
nấm Cordyceps militarisFNA5. Đồng thời đóng góp một phần nhỏ bé trong
việc xây dựng nền công nghiệp dƣợc ở trong nƣớc.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Xác định đƣợc một số điều kiện lên men nấm Cordyceps militaris
FNA5 và điều kiện thu hồi một số dƣợc chất polysaccaride, cordycepin từ
sinh khối và dịch lên men của nấm nhằm ứng dụng trong sản xuất thực phẩm
chức năng.

3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài
a. Đối tƣợng nghiên cứu
- Chủng nấm Cordyceps militaris FNA5phân lập tại Việt Nam, nhận từ
bộ sƣu tập giống của phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
b. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu một số điều kiện lên men (môi trƣờng, tỷ lệ tiếp giống, sục
khí, pH…) chủng nấm Cordyceps militaris FNA5 quy mô 5 lít/mẻ để
sinh tổng hợp cordycepin, polysaccharide.
- Nghiên cứu điều kiện tách chiết thu hồi các chất có hoạt tính sinh học
cordycepin, polysaccharide.

Nguyễn Thị Thu Hiền

2


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Giới thiệu về chủng nấm Đông trùng hạ thảo

1.1.1. Sơ lƣợc về lịch sử nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo
Hàng ngàn năm nay, Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) đƣợc coi là thần
dƣợc trong y học cổ truyền Việt Nam và Trung Quốc.Trong y học cổ truyền
Trung Quốc, “Đông Trùng, Hạ Thảo” dùng để chữa các bệnh về phổi và hô

hấp, thận, gan, tim mạch; trị bệnh yếu sinh lý và cao huyết áp; trị rối loạn
miễn dịch và chống ung thƣ (Zhou et al., 1998a,b).Tại viện Nghiên cứu nội
tiết Thƣợng Hải (Trung Quốc), nấm Đông trùng hạ thảo đã đƣợc dùng để
chữa liệt dƣơng có hiệu quả tốt. Vì vậy, nấm đông trùng hạ thảo đƣợc ngƣời
Trung Quốc xem nhƣ một loại dƣợc tảo quý, chỉ dùng cho vua chúa và ngƣời
giàu.
Nấm Cordyceps là một giống nấm túi, đƣợc các nhà khoa học Trung
Quốc phát hiện lần đầu tiên ở vùng núi cao nguyên Tây Tạng, loại dƣợc liệu
quý này thực chất là ấu trùng các loài bƣớm thuộc chi Thitarodes hoặc
Hepialus bị nấm Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc ký sinh (Bảng 1.1.)
Bảng 1.1. Bảng phân loại khoa học
Giới (Regnum)

Fungi

Ngành (phylum)

Ascomycota

Lớp (Class)

Ascomycetes

Bộ (Ordo)

Hypocreales

Họ (Familia)

Clavicipataceae

Chi (Genus)

Cordyceps

Loài (Species)

C. militaris

Đông trùng hạ thảo còn có tên gọi khác là Trùng thảo hay Hạ thảo đông
trùng. Chi nấm Cordycepsgồm khoảng 400 loài đã đƣợc miêu tả, chỉ riêng
Trung Quốc đã tìm thấy 60 loài (Wang, 1995; Sung, 1996; Li et al., 2006).
Nguyễn Thị Thu Hiền

3


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

Tuy nhiên cho đến nay ngƣời ta chỉ nghiên cứu nhiều nhất đƣợc về 2 loài
Cordyceps sinensis ( Berkeley, 1843) và Cordyceps militaris Link.
Giống nhƣ hầu hết các loài Cordyceps khác, C. militaris là một loài
nấm ký sinh trên côn trùng và ấu trùng của côn trùng. Loài này chủ yếu lây
nhiễm ở giai đoạn nhộng của các loài bƣớm khác nhau, rồi nhân lên trong cơ
thể ký chủ vào mùa đông.

ào tử nấm theo gió d nh vào bên ngoài ký chủ,

sau đó từ bào tử h nh thành các ống nảy mầm có các thể bám. Các ống này
tiết ra các enzyme nhƣ lipase, chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ
và xâm nhập vào bên trong cơ thể. Sau đó hệ sợi nấm hút dinh dƣỡng và sinh
trƣởng mạnh m chiếm toàn bộ cơ thể và gây chết ký chủ. Đến cuối hè hoặc
thu quả thể nhô ra ngoài để phát tán bào tử vào không khí (Kobayasi et al.,
1982; Kamble et al., 2012). Do đó,nó có tên gọi là nấm Đông trùng hạ thảo.
Các quả thể nấm C. militaris thƣờng có màu vàng nhạt hoặc màu da cam
(Zheng et al., 2011) (Hình 1.1).

Hình 1.1. Nấm Đông trùng hạ thảo loài Cordyceps militaris
Đông trùng hạ thảo ở ngoài tự nhiên , ngƣời ta có thể trông rõ hình con
sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá. Khi sấy khô, nó có mùi tanh nhƣ cá,
đốt lên có mùi thơm. Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 –
11 cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành. Đầu sâu non
giống nhƣ con tằm, dài chừng 3–5 cm, đƣờng kính khoảng 0,3 - 0,8 cm. Bên
ngoài có màu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía ở
gần đầu nhỏ hơn. Phần đầu có màu nâu đỏ, đuôi giống nhƣ đuôi con tằm, có
tất cả 8 cặp chân, nhƣng 4 đôi ở giữa là rõ nhất. Chất đệm nấm hình que cong

Nguyễn Thị Thu Hiền

4


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút. Sâu non dễ bẻ gãy, ruột
bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng, có nhiều sợi nấm nên khá dai và bên

trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà (Đái Duy

an và Lƣu Tham Mƣu,

2009) (Hình 1.2).

Hình 1.2. Một số hình thái của các chủng nấm thuộc chi Cordyceps
Bảng 1.2. Mô tả hình thái một số loài nấm thuộc chi Cordyceps
Loài
C. sinesis

C. gunnii

C. barnesii

C. liangshanensis

Nguyễn Thị Thu Hiền

Ấu trùng

Chất nền

Phần cơ thể giống nhƣ nhộng
tằm, có chiều dài từ 3-5 cm,
đƣờng kính từ 3-8 mm, màu
vàng đạm tới vàng nâu.

Chất nền hình trụ mảnh, chiều
dài 4-7 cm, đƣờng kính

khoảng 3 mm, với đỉnh nhọn
vô trùng

Phần cơ thế ấu trùng giống
nhƣ nhộng tằm, dài từ 3-6
cm, đƣờng kính 3-10 mm,
vàng nâu đến nâu

Chất nền hình trụ, mập mạp
và thô, 4-14 cm chiều dài và
khoảng 4mm, với bulgy vô
trùng hoặc phân nhánh đỉnh

Cơ thể ấu trùng cong hình
thận, ngắn, 1,5-2 cm chiều
dài , đầu nhỏ với một cặp
răng.

Chất nền duy nhất, thanh
mảnh và cong, 2-6 mm chiều
dài và khoảng 2mm đƣờng
kính.

Cơ thể ấu trùng giống nhƣ
một con tằm, dày, chiều dài
3-6 cm, đƣờng kính 6-10
mm, bề mặt bên ngoài màu
nâu, nâu sẫm

Chất nền nhƣ sợi, phân nhánh

hoặc không phân nhánh, 1030 cm chiều dài, đƣờng kính
1-2 mm.

5


Khóa luận tốt nghiệp

C. militaris

Khoa CNSH- 1302

Môi chất dinh dƣỡng không Chất nền phẳng, hơi cong
có cơ thể ấu trùng
khoảng 5 cm chiều dài, màu
vàng cam đến màu đỏ da cam

Hình 1.3. Hình thái tự nhiên một số loài nấm :A- C. sinensnis; B-C. gunnii;
C-C. barnesii; D- C. gracilis; E- C. liangshanensis; F-C. militaris
1.1.2. Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên
Các chủng thuộc chi Cordyceps đƣợc thu mẫu ở các vùng khác nhau
trên toàn thế giới. Đông trùng hạ thảo đƣợc tìm thấy vào mùa hè ở một số cao
nguyên cao hơn mặt biển từ 3500 đến 5000 mét thuộc các vùng Tây Tạng, Tứ
Xuyên, Thanh Hi, Cam Túc, Vân Nam… Mao và cộng sự (2000) đã mô tả
đặc điểm hình thái, công dụng và ảnh minh họa cho 13 loài nấm thuộc chi
Cordyceps phân bố ở Trung Quốc, gồm các loài: Cordyceps barnesii
Thwaites, C.capiata (Holmsk.:Fr.) Link., C. crassispora Zang, C. gunii
(Berk.) Berk., C.hawkesiiGray, C. kyushuensis Kobayasi, C. martialis Gray,
C. militaris (L.:Fr.) Link., C. nutans Pat., C. ophioglossoides (Ehrenb.) Link.,
C. sinensis (Berk.) Sacc., C. sobolifera (Hill.) Berk. Et Br., C. tubeculata

(Leb.) Maire.
Tuy nhiên theo một số nghiên cứu cho thấy, các thành viên của chi nấm
Cordyceps còn có thể đƣợc tìm thấy ở Thái Lan, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt
Nguyễn Thị Thu Hiền

6


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

Nam (John et al., 2005). Nhƣ vậy, có thể thấy thành phần loài nấm Đông
trùng hạ thảo khá phong phú ở trên các vùng sinh thái khác nhau và nhiều loài
có phạm vi phân bố rộng, các loài có đặc điểm phân bố đặc hữu cho từng
vùng.
Quả thể của nấm C. militaris dùng làm thực phẩm, dùng trong các món
hầm, súp, trà ... ở các nƣớc Đông Nam Á nhƣ Hongkong, Đài Loan, Trung
Quốc. Liều lƣợng an toàn khoảng ít hơn 2.5 g kg thể trọng (Che et al., 2003).
Quả thể và sinh khối nấm cũng đƣợc sử dụng làm thuốc và bồi bổ sức khỏe
nhƣ nƣớc uống, viên nhộng, rƣợu, trà… (Wang et al, 2006). Các loại thuốc
từ nấm này dùng duy trì chức năng thận, phổi, chống lão hóa, điều hòa giấc
ngủ, viêm phế quản mạn tính (Das et al., 2010). Hiện có hơn 30 loại sản
phẩm chăm sóc sức khỏe từ C. militaris trên thi trƣờng (Huang et al.,
2010;Park et al., 2001; Kim et al., 2005; Shin et al., 2007; John & Matt, 2008;
Đái Duy an et al., 2009).
1.2.

Một số chất có hoạt tính sinh học từ nấm Đông trùng hạ thảo
Trong nấm Cordycepscó các nhóm chất quan trọng là cordycepic acid,

cordycepin và polysaccharide có tác dụng rất tốt trong điều trị bệnh ung thƣ
và các bệnh do virus. Ngoài ba thành phần trên, khi phân tích nấm ngƣời ta
còn phát hiện rất nhiều hợp chất có giá trị là N-acetylgalactosamine,
adenosine, ergosterol và ergosterol ester, bioxanthracenes, hypoxanthine,
polysaccharide và exopolysaccharide, chitinase, cicadapeptins, và myriocin,
các chất có hoạt tính sinh học là saccharide (trehalose và polysaccharide),
nucleoside (adenosine, inosine và cordycepin), manitol và sterol (ergosterol).
1.2.1. Cordycepin
Cordycepin lần đầu tiên đƣợc tách ra từ loài C. militaris (Cunningham
et al., 1950). Cordycepin là một hợp chất quan trọng trong nấm đông trùng hạ
thảo (Mina et al., 2005), chúng cũng đƣợc tìm thấy ở loài C. sinensis và C.
kyushuensis. Cordyceps tự nhiên chứa lƣợng cordycepin vào khoảng 0,0066,36 mg/g. Trong sinh khối sinh nấm nuôi và quả thể của Cordyceps, hàm
Nguyễn Thị Thu Hiền

7


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

lƣợng cordycepin ở giai đoạn đầu sau khi đƣợc tách và nuôi thƣờng thấp với
hàm lƣợng từ 0,006-1,64 mg/g. Các nhà khoa học cho biết khi thu nhận trong
tự nhiên, nồng độ cordycepin trong quả thể C. militaris cao hơn C. sinensis
với hàm lƣợng lần lƣợt là 2,65 và 1,64 mg/g, trong khi trong nuôi cấy trong
các bình lên men hàm lƣợng chất này thu đƣợc là 1,59 mg g tƣơng đƣơng với
C. sinensis trong tự nhiên (Lo et al., 2013).

Hình 1. 4. Cấu trúc hóa học của Cordycepin và Adenosine

Cordycepin có cấu trúc 3’-deoxyadenosin là một purin alkaloid có dạng
của nucleosid adenosin bị mất một oxy ở vị trí 3’ phần đƣờng ribose.
Cordycepin đƣợc phân lập lần đầu vào năm 1950 từ Cordyceps militaris.
Bằng phân tích phổ NMR (nuclear magnetic resonance) và IR (infrared),
cordycepin đƣợc xem nhƣ là một hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc ly trích
từ quả thể và sợi nấm. Cordycepin có công thức C10H13N5O3 và có phân tử
lƣợng 251, điểm nóng chảy tại 230-231oC, độ hấp thu cực đại tại 259 nm. Có
thể hoà tan trong dung dịch đệm muối, methanol hay ethanol, nhƣng không
hoà tan trong benzen, ether hay chloroform, do vậy nhiều nghiên cứu đã sử
dụng dung dịch muối khử trùng và đệm phosphat làm dung môi.
Các nhà khoa học thƣờng sử dụng saline để khử trùng và đệm
phosphate để hòa tan cordycepin (Xuanwei et al., 2009). Cordycepin có khả
năng kháng nấm, kháng ung thƣ và kháng virus. Gần đây, cordycepin cũng
cho thấy khả năng điều hòa sản sản phẩm interleukines trong tế bào lympho T
(Mina et al., 2005). Cordycepin phát huy tác dụng gây độc tế bào thông qua
Nguyễn Thị Thu Hiền

8


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

methyl hóa acid nucleic, ức chế sự phát triển của Clostridium paraputrificum
và Clostridium pefringens nhƣng không có tác động nào tới Bifidobacterium
spp. và Lactobacillus spp. do Ahn và cộng sự đã chứng minh năm 2000 (Lu et
al.,2012; Seok et al.,2009).
1.2.2. Adenosine
Adenosine xuất hiện khá nhiều trong quả thể và đƣợc cho là phong phú

ở tất cả các loài thuộc chi Cordyceps với hàm lƣợng dao động từ 0,28 đến
14,15 mg/g. Khi thu nhận nấm Cordyceps spp.trong tự nhiên, nồng độ
adenosine là 2,45 ± 0,03 mg/g trong quả thể và ở nấm C. militaris cao hơn C.
sinensis, ở C. sinensis hàm lƣợng chỉ có 1,643±0,03 mg g, trong khi đó, hàm
lƣợng trong sợi nấm C. militaris lên men là 1,592±0,03 mg/g gần tƣơng tự C.
sinensis trong tự nhiên (Lo et al., 2013). Adenosine đƣợc cho là có tác dụng
điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch(Shashidhara et al., 2013).
1.2.3. Polysaccharide
Trong nấm Cordyceps chứa một lƣợng lớn polysaccharid, khoảng 3-8%
khối lƣợng, đây là một trong những hợp chất sinh học chínhvà đƣợc đánh giá
cao về giá trị dinh dƣỡng trong sản xuất thực phẩm chức năng và sản xuất
thuốc phòng, chữa bệnh cho ngƣời và với cấu trúc phức tạp gồm cyclofuran
(đƣờng 5C, mạch vòng), beta-glucan; beta-mannan; và phức hợp
polysaccharide có cả đƣờng 5C và 6C cùng tham gia vào các chuỗi nhánh,
dùng cả cầu nối alpha- và beta-).
Các Polysaccharide chính trong nấm Cordyceps là một dạng glucans
với các mối liên kết glycosidic chứa các liên kết: (1/3) – (1/6) – β glucan và
(1/3) -1 – glucan. Mặc dù, vách tế bào nấm là nguồn cung cấp chính của
polysaccharide đã đƣợc chứng minh kháng khối u, trong khi polysaccharide
thu nhận từ thực vật lại không có đặc điểm này, điều này chỉ có thể giải thích
đƣợc thông qua sự khác nhau trong cấu trúc hóa học của các
polysaccharide(Hui et al., 2011). Các polysaccharide có khả năng chống lại

Nguyễn Thị Thu Hiền

9


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

hoạt động của các tế bào ung thƣ chúng bao gồm homopolyme có cấu tạo từ
đơn giản đến phức tạp bao gồm glucose, galactose, mannose, xylose,
arabinose, fucose, ribose và acid glucuronic.
Trong một số loài nấm, polysaccharide liên kết với các protein hoặc
peptide tạo thành các hệ polysaccharide- protein hoặc polysaccharide- peptide
cấu trúc có hoạt tính kháng u mạnh hơn (Hardeep et al., 2014; John và Matt,
2008; Lu et al., 2012). Cấu trúc 1/3- β- glucans có khả năng kháng khối u
đƣợc biết nhiều nhất, theo các nhà nghiên cứu cho biết những glucan có đƣợc
hoạt tính sinh học này là do trong cấu tạo các phân tử có dạng mạch thẳng
hoặc phân nhánh với cấu trúc chính là phân tử đƣờng glucose liên kết với các
đơn vị trong chuỗi tại các vị trí khác nhau, với các chuỗi bên bao gồm các đơn
vị nhƣ acid glucuronic, xylose, arabinose, fucose hoặc ribose. Heteroglycan là
một nhóm lớn polysaccharide lớn hoạt tính sinh học đa dạng đƣợc phân loại
là galactan, fucan, xylan, mannan (John et al., 2008; Hardeep et al., 2014; Lu
et al., 2012).
1.2.4. Các hợp chất khác
Acid Cordycepic
Acid Cordycepic, một isomer của acid quinic, đƣợc nghiên cứu đầu tiên
ở Cordyceps sinensis năm 1957. Cấu trúc tinh thể của acid cordyceptic đƣợc
xác định là D-mannitol. Mannitol là hợp chất sinh học chính có nhiều hoạt
tính quan trọng nhƣ kháng gốc tự do, lợi tiểu, trị ho. Chất này tồn tại trong tự
nhiên chủ yếu ở rễ, thân và lá cây; đƣợc tìm thấy nhiều trong nấm ăn, cà rốt
và rêu. Hàm lƣợng acid cordyceptic trong Cordyceps khoảng 7-29%.
Mannitol có cấu tạo gồm một alcohol và một đƣờng, hoặc một polyol; tƣơng
tự nhƣ xylitol hay sorbitol. Tuy nhiên, mannitol có xu hƣớng loại bỏ ion
hydrogen trong nƣớc làm dung dịch trở nên acid. Công thức hóa học của
mannitol là C6H14O6, trọng lƣợng phân tử 182, nhiệt độ nóng chảy 166oC, tỷ
trọng 1,489 (20oC) và nhiệt độ sôi 290-295oC (467 kPa). Mannitol có nhiều

đặc tính quan trọng đã đƣợc sử dụng trong y học và thực phẩm, hàm lƣợng
Nguyễn Thị Thu Hiền

10


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

mannitol có trong quả thể nấm Cordyceps vào khoảng 29-85 mg/g, sợi nấm
có hàm lƣợng acid cordyceptic cao hơn so với trong quả thể (Zhoua et al.,
2009).
Protein và acid amin
Hàm lƣợng protein trong Cordyceps vào khoảng 29,1 – 33% bao gồm
18 acid amin: acid aspartic, threonin, serin, glutamat, prolin, glycin, valin,
methionin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin, histidin, cystin,
cystein và tryptophan. Các acid amin có hàm lƣợng cao nhất là glutamat,
arginin và acid aspartic và có dƣợc tính cao nhất là arginin, glutamat,
tryptophan và tyrosin (Xuanwei Zhoua et al., 2009). Khi nghiên cứu họ
protein trong C. militaris cho thấy bộ gen C. militaris chứa 61 họ protease
nhƣng hầu hết là serin protease và metallopeptidase, 12 gen mã hóa trypsin,
167 gen mã hóa protein kinase, 105 gen mã hóa glycosid hydrolase. Hơn
nữa, C. militaris sở hữu hầu hết các gen cần thiết cho hoạt động biến dƣỡng
adenin và adenosin, ngoại trừ việc thiếu ribonucleotid triphosphat reductase
và deoxyadenosin kinase (Zheng et al.,2011).
Ergosterol
Ergosterol là sterol duy nhất của nấm và là tiền chất thiết yếu của
vitamin D2. Hàm lƣợng ergosterol ở C. militaris nuôi cấy rất cao (10,68mg/g),
cao hơn nhiều so với hệ sợi nấm chỉ có 1,44 mg/g và chỉ đứng

sau C.sinensis tự nhiên phân lập ở Tây Tạng (Xuanwei Zhoua et al., 2009).
Các ergosterol và các chất đồng dạng của nó có hoạt tính kháng virus, điều
hoà tim mạch, điều trị bệnh thận do giảm immunoglobin A.
Acid béo và nguyên tố kim loại
Acid béo bao gồm carbon, hydro, và oxy và là thành phần chính của
lipid, phospholipid và glycolipid, chúng đƣợc phân loại thành acid béo no và
không no. Ở Cordyceps, lƣợng acid béo no đƣợc tìm thấy là 57,84%. Acid
linoleic chiếm hàm lƣợng cao nhất 38,44%, tiếp đó là acid oleic 17,94%.Các

Nguyễn Thị Thu Hiền

11


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

acid béo nó chiếm 42,16% bao gồm C14, C15, C16, C17, C18, C20 và C22. Acid
palmitic và acid octadecanoic chiếm hàm lƣợng cao nhất lần lƣợt là 21,86%
và 15,78%. Các acid béo không no có chức năng giảm lipid máu và bảo vệ
chống lại bệnh tim mạch, chứa một loạt các hợp chất dinh dƣỡng nhƣ các acid
amin thiết yếu, vitamin E và K, các vitamin tan trong nƣớc nhƣ

1,

B2 và B12

và các nguyên tố đa lƣợng và vi lƣợng (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi,
Se, Al, Si,Ti, Cr, Ga) (John et al., 2005).

Nucleotid
Nucleotid (gồm có adenosine, uridine và guanosine) là chất có nhiều
trong Cordyceps, có tác dụng kháng khối u, phóng thích các tín hiệu dẫn
truyền thần kinh, chống co giật… Trong đó, hàm lƣợng guanosin thƣờng cao
nhất.

Hàm

lƣợng

nucleotid

trong Cordyceps nuôi

cấy

cao

hơn

hẳn Cordyceps tự nhiên. Hàm lƣợng các nucleotid trong tự nhiên thấp có thể
do sự thoái biến các nucleotid trong quá trình ủ đông. Khí hậu ấm và ẩm ƣớt
là điều kiện làm tăng nucleotid trong Cordyceps khi nuôi trên môi trƣờng rắn
(Xuanwei Zhoua et al., 2009).
1.3. Giá trị dƣợc liệu của các hoạt chất sinh học tới sức khỏe con ngƣời
Nấm Cordyceps có rất nhiều công dụng nhƣ là chống ung thƣ, chống di
căn, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, chống viêm, diệt khuẩn, hạ đƣờng
huyết, chống lão hóa, bảo vệ thần kinh và bảo vệ thận. Cụ thể, polysaccharide
đảm nhiệm chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thƣ, chống di căn khối u,
điều hòa miễn dịch, hypoglycaemic, steroidogenic và hypolipidaemic.

Cordycepin đảm nhiệm chống ung thƣ, trừ sâu, chống nhiễm khuẩn.
Ergosterol ức chế ung thƣ, điều hòa miễn dịch (Shrestha et al., 2010; Zhoua et
al., 2009).
Hiệu quả chống ung thư
Khả năng ức chế sự phát triển của các khối u đƣợc phát hiện ở nhiều
chi của loài Cordyceps. Các thành phần hoạt tính sinh học có tác động chống
ung thƣ chủ yếu là polysaccharide, sterol và adenosine. Trong đó, sterol và
Nguyễn Thị Thu Hiền

12


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

adenosine là các chủ đề nghiên cứu nóng nhất về khả năng chống ung thƣ.
Cho tới nay, các nhà khoa học vẫn chƣa thể biết chính xác cơ chế ức chế sự
phát triển của tế bào ung thƣ của Cordyceps, cơ chế này có thể là tăng cƣờng
chức năng của hệ thống miễn dịch và miễn dịch tự nhiên; ức chế có sự chọn
lọc tổng hợp RNA, từ đó ảnh hƣởng tới tổng hợp protein; hoạt động chống
oxy hóa và chống các gốc tự do; chống đột biến; làm nhiễu quá trình sao chép
của virus cảm ứng khối u; cảm ứng methyl hóa acid nucleic (Shashidhara et
al., 2013).
Tác động điều hòa miễn dịch
Các tác động chính của Cordyceps lên hệ thống miễn dịch vào các tế
bào nhƣ đáp ứng tăng sinh lymph, tế bào giết tự nhiên (NK), và kích thích tạo
thành: ngƣng kết tố thực vật (PHA) interleukin-2 (IL-2) và tác nhân hoại tử tế
bào ung thƣ (TNF-α) trên các tế bào đơn nhân ở ngƣời, đây là kết quả sự sản
xuất của cytokine. Các tác động trị liệu của nấm, nhƣ ngăn chặn bệnh tự

miễn, dị ứng cũng có liên quan đến tác động điều hòa miễn dịch (Xuanwei
Zhoua et al., 2009).
Khả năng điều hòa cơ thể, chống lão hóa, oxy hóa
Các thử nghiệm trên động vật cho thấy, Cordyceps có tác dụng bảo vệ
gan của bệnh nhân, chống nhiễm virus A, viêm gan B mãn tính, viêm gan C,
xơ gan. Các hoạt chất của nấm hỗ trợ tăng các tế bào có chức năng điều hòa,
đƣa trạng thái HBeAg-dƣơng tính về HBeAg-âm tính, tăng cƣờng chức năng
gan và ức chế xơ gan (Zhou et al., 2009). Ngoài ra, C. sinensis có nhiều ảnh
hƣởng đến hệ thống tim mạch, chẳng hạn nhƣ tần số âm tính, cơ tim giảm tiêu
thụ ôxy, cải thiện cơ tim thiếu máu cục bộ, chống đông tụ tiểu cầu, loạn nhịp.
Dịch chiết và tế bào nấm C. sinensis cũng cho thấy tác động lên hệ thần kinh
nhƣ giảm đau, chống co giật và thanh nhiệt. Trên hệ thống hô hấp, dịch chiết
từ C. sinensis có tác dụng làm giãn cuống phổi nhờ quá trình tăng cƣờng tiết
adrenaline từ tuyến thƣợng thận và co khí quản nhờ histamine. Đồng thời, tác
dụng tới hormone, corticosterone trong hệ nội tiết của ngƣời (Klaunig, 2004).

Nguyễn Thị Thu Hiền

13


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

Chống lão hoá, chống các chứng viêm tấy đƣợc thể hiện trong công
trình nghiên cứu của Won và Park (2005). Ahn và cộng sự (2000) nhận định
nấm ĐTHT có tác dụng chống viêm nhiễm kìm hãm sự phát triển của một số
virus, vi khuẩn và nấm. Ngoài ra, nấm ĐTHT C. militaris còn có tác dụng
kìm hãm sự oxy hoá lipit, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig,

2004).
Trong những năm gần đây, Cordyceps trở thành nguồn nguyên liệu rất
quan trọng cho làm thuốc và thực phẩm chức năng. Giá cả của chúng tăng lên
rất nhanh, có rất nhiều ngƣời đã canh tác chúng. Hiện tại, sự phát triển của
Cordyceps và các chế phẩm của chúng chủ yếu tập trung vào ba hƣớng: thực
phẩm ăn kiêng, thực phẩm chức năng và phát triển tính thuốc. Hầu hết các
hoạt chất sinh học chiết xuất từ Cordyceps nhƣ cordycepin, cordycepic acid,
và polysaccharide đều là các chất chống lão hóa và tác động tới điều hòa giấc
ngủ cũng đã đƣợc cấp phép nhƣ một nguồn thuốc mới bởi SFDA của Trung
Quốc. Vì vậy, sử dụng Cordyceps và cả dịch chiết, chúng ta có thể phát triển
rất nhiều sản phẩm nhờ công nghệ hiện đại, các sản phẩm này có rất nhiều
chức năng chủ yếu tập trung vào các phƣơng diện: tăng cƣờng thể chất, chống
lão hóa, bảo vệ tim mạch, cải thiện giấc ngủ, tăng ngon miện, tăng cƣờng
miễn dịch (Shashihara et al., 2013).
1.4.

Ứng dụng công nghệ lên men chìm nấm Cordyceps spp. để sản xuất
sinh khối và exopolysaccharide (EPS)
Nhiều công trình nghiên cứu đã khẳng định sinh khối nấm Cordyceps

spp. có chứa nhiều hợp chất có giá trị nhƣ: 14-19 acid amin khác nhau, 11 loại
bioxanthracen, beauvericin, chất béo, cordycedipeptide, cordyceamide,
adenosine, cordycepin, exopolysaccharide… Một trong những chất có hoạt
tính sinh học cao đang đƣợc quan tâm là expolysaccharide, đƣợc chứng minh
có khả năng tăng cƣờng hệ thống miễn dịch, giảm cholesterol, chống hạ

Nguyễn Thị Thu Hiền

14

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

đƣờng huyết, chống ôxi hóa và kháng tế bào ung thƣ (Xiao et al., 2004; Yang
et al., 2013).
EPS là thành phần chính trong quá trình tạo thành tế bào nấm
Cordyceps spp. nên sự tích lũy EPS trong môi trƣờng lên men có mối tƣơng
quan chặt ch với sinh khối nấm tạo ra (Cui, Zhang, 2010). Phƣơng pháp lên
men tạo quả thể trên giá thể nhân tạo đòi hỏi thời gian nuôi cấy dài ngày, tốn
diện tích, dễ bị nhiễm tạp. Ngƣợc lại, phƣơng pháp lên men chìm có ƣu điểm
thu nhận sinh khối trong thời gian ngắn trong không gian nhỏ, tránh nhiễm
tạp (Kim et al., 2002; Cha et al., 2007). Tuy nhiên, do sản lƣợng sinh khối
thấp nên các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu tối ƣu thành phần môi
trƣờng, điều kiện lên men nhằm nâng cao hàm lƣợng sinh khối và tổng hợp
expolysaccharide của các chủng Cordyceps spp.
Năm 2002, Kim et al. công bố chủng nấm C. militaris trong nghiên cứu
có hàm lƣợng sinh khối và EPS cao nhất, đạt lần 12,73 g/L và 7,3 g/L trên
thiết bị lên men KF-250 quy mô 5 Lít có thành phần môi trƣờng gồm 60 g/L
sucrose; 10 g/L polypeptone; 0,5 g/L KH2PO4. Kết quả ghi nhận ở pH 6,0;
nhiệt độ 25oC; lƣu lƣợng khí 2 vvm; tốc độ khuấy 150 vòng/phút; 10 ngày lên
men. Hình thái hệ sợi có sự biến đổi mạnh khi tại hai điều kiện chỉnh pH và
không chỉnh pH trong quá trình lên men (Kim et al., 2002).
Các nhà khoa học Trung Quốc đã công bố kết quả tối ƣu khả năng sinh
trƣởng của chủng C. jiangxiensis JXPJ 0109 và tổng hợp EPS trong lên men
chìm. Các kết quả công bố cho thấy, hàm lƣợng sinh khối khô đạt cực đại
(14,5 g L) trên môi trƣờng lên men gồm 15 g/L maltose; 10 g/L glycerol; 10
g/L tryptone; 10 g/L cao nấm men; 1 g/L KH2PO4; 0,2 g/L MgSO4; 0,5 g/L
CaCl2, pH 5,0 ở nhiệt độ 26°C sau 8 ngày. Khi sử dụng môi trƣờng tối ƣu có

thành phần 20 g/L maltose; 8 g/L glycerol; 5 g/L tryptone; 10 g/L cao nấm
men; 1 g/L KH2PO4; 0,5 g/L CaCl2; pH 7,0 ở 28°C thì hàm lƣợng EPS đạt 3,5
g L sau 10 ngày lên men. Đây là báo cáo đầu tiên trên thế giới đánh giá chi

Nguyễn Thị Thu Hiền

15


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

tiết về ảnh hƣởng của từng yếu tố tới khả năng tạo sinh khối và EPS của loài
C. jiangxiensis (Xiao et al., 2004).
Do các sản phẩm trao đổi chất trong quá trình lên men nấm Cordyceps
spp. rất phong phú nên chủng giống có vai trò quyết định đến chất lƣợng và
hàm lƣợng sản phẩm tạo thành. Kim & Yun (2005) đã khẳng định lập luận
trên khi so sánh quá trình tối ƣu thu nhận EPS từ chủng C. militaris và C.
sinensis trên quy mô bình tam giác và thiết bị lên men 5 lít. Với môi trƣờng
tối ƣu gồm 40 g/L sucrose; 5 g/L cao ngô; pH 8,0; nhiệt độ 30°C, sinh khối
khô, EPS, cordycepin từ chủng C. militaris đạt cực đại (22,9 g/L và 5 g/L)
sau 16 ngày nuôi cấy. Trái lại, chủng C. sinensis có khả năng sinh trƣởng và
tổng hợp EPS thấp hơn (20,9 g L và 4,9 g L) trên môi trƣờng tối ƣu gồm 20
g/L sucrose; 25 g/L cao ngô; 0,78 g/L CaCl 2; 1,73 MgSO4.7H2O; pH 4,0;
nhiệt độ 20°C. Hàm lƣợng cordycepin thu nhận cùng điều kiện trong nghiên
cứu của chủng Cordyceps sp.gấp 2,1 lần so với chủng C. sinensis (Kim và
Yun, 2005). Nhóm nghiên cứu của Cui và Zhang (2010) đã nâng cao khả
năng sinh EPS ở 3 điều kiện lên men: lắc, tĩnh và hai giai đoạn (140 giờ lắc,
130 giờ tĩnh), hàm lƣợng EPS đạt 3,2 g/L sau khi tối ƣu quá trình lên men hai

giai đoạn. Đồng thời gấp 2,3 lần so với điều kiện tĩnh và 1,6 lần so với lên
men trong điều kiện lắc.
Nhằm tăng khả năng sinh trƣởng và tổng hợp EPS, nhiều nhà nghiên
cứu đã sử dụng một số chất kích thích quá trình sinh trƣởng của các chủng
Cordyceps spp. Tác giả Yang et al. (2000) cho rằng acid có tác động mạnh
đến tốc độ sinh trƣởng của chủng C. militaris. Báo cáo của Park et al. (2002)
đã chứng minh hiệu quả tổng hợp EPS đƣợc nâng cao khi bổ sung dầu thực
vật trong lên men chìm. Ngoài ra, một số chất hoạt hóa bề mặt nhƣ Tween 80
hay glycerol cũng đƣợc chứng minh làm tăng hiệu quả dẫn truyền chất dinh
dƣỡng từ môi trƣờng lên men lên thành tế bào nấm (Liu và Wu, 2012).

Nguyễn Thị Thu Hiền

16


Khóa luận tốt nghiệp

1.5.

Khoa CNSH- 1302

Thu hồi sinh khối và hoạt chất từ Cordyceps spp.
Một yếu tố đóng vai trò quan trọng mang ý nghĩa quyết định trong quá

trình lên men chính là thu hồi, tách chiết sản phẩm tạo thành. Hiện nay có rất
nhiều phƣơng pháp để tách chiết các chất có hoạt tính sinh học cao từ
Cordyceps spp. nhƣ sử dụng nƣớc, dung môi. Nƣớc đƣợc sử dụng để tách
chiết polysaccharide từ nấm C. sinensis với tỷ lệ nƣớc: sinh khối = 2,5:1, pH
7,5-8,0 trong 24 giờ (Sun, Zhang, 2003). Wang và cộng sự (2005) cho rằng

khi sử dụng sóng siêu âm kết hợp với nƣớc với tỷ lệ quả thể nấm C. militaris:
nƣớc = 1:10, lặp lại 3 lần quá trình tách chiết trong 90 phút cho hiệu quả tách
chiết cordycepin và polysaccharide cao. Phƣơng pháp trên khá hiệu quả khi
thay đổi tỷ lệ nƣớc nóng lên 25-30% khi tách chiết chất chống oxy hóa. Ngoài
ra, methanol và ethanol cũng đƣợc chứng minh có tác dụng hiệu quả trong
tách chiết nucleoside, polysaccharide, protein. Trong đó, yếu tố ảnh hƣởng
mạnh đền hiệu suất tách chiết cordycepin là tỷ lệ cồn và thời gian. Khi tối ƣu
tỷ lệ mẫu: ethanol 20% = 1:33 kết hợp sóng siêu âm thu nồng độ cordycepin
đạt cực đại (Song et al., 2007). Chiết xuất bằng ethanol có hiệu quả chống
oxy hóa mạnh, tăng cƣờng miễn dịch. Tuy nhiên, dịch chiết xuất sinh khối C.
sinensis với methanol lại thể hiện độc tính ức chế tế bào ung thƣ mạnh.
Hàm lƣợng các chất nhƣ carbohydrates, adenosine, ergosterol,
cordycepin đƣợc chiết xuất từ Cordyceps spp. với dung môi ethyl acetate có
hàm lƣợng khác biệt so với khi tách chiết bằng nƣớc và cồn. Những nhóm
hợp chất này thể hiện tác động mạnh trong chống ôxy hóa, đáp ứng miễn dịch
tế bào, ức chế tế bào ung thƣ. Hiệu suất thu hồi khi sử dụng ethyl acetate
trong tách chiết các chất thấp hơn nhiều so với nƣớc và cồn. Tuy nhiên, hàm
lƣợng chất ergosterol thu đƣợc lại cao hơn khi chiết bằng dung môi ethyl
acetate, đây là nhân tố chính trong tác động gây độc thế bào bạch cầu tủy
HL60 với hàm lƣợng ED đạt 50 ± 25 µg/mL sau 2 ngày điều trị (Zhang et al.,
2005). Nhìn chung, quá trình tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ
Cordyceps spp. kết hợp sử dụng sóng siêu âm cho kết quả thu hồi sản phẩm
Nguyễn Thị Thu Hiền

17