Nghiên cứu tạo vector và biểu hiện gen drr c từ chủng xạ khuẩn streptomyces peucetius
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.39 MB, 105 trang )
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
********************
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Formatted: Left
Formatted: Centered
Formatted: Font: Not Italic, Portuguese
(Brazil)
ĐỀ TÀI:
Formatted: Portuguese (Brazil)
Nghiên cứu tạo vetor và biểu hiện gen drr C từ chủng xạ khuẩn
streptomyces peucetius
“Nghiên cứu thiết kế vect or pIBR25-drr C và biểu hiện gen drr
C trên chủng xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24
Formatted: Font: Not Italic, Portuguese
(Brazil)
Formatted: Portuguese (Brazil)
Formatted: Font: Not Italic, Portuguese
(Brazil)
Formatted: Portuguese (Brazil)
Formatted: Font: Not Italic, Portuguese
(Brazil)
Formatted: Portuguese (Brazil)
”
Formatted: Font: Not Italic, Portuguese
(Brazil)
Formatted: Portuguese (Brazil)
Formatted: Font: Not Italic, Portuguese
(Brazil)
Formatted: Portuguese (Brazil)
Formatted: Centered
Giáo viên hướng dẫn:
Sinh viên:
TS. Ta Thị Thu Thủy
Nguyễn Trọng Duy
Formatted: Space Before: 0 pt, Line spacing:
Multiple 1.3 li
Formatted Table
Formatted: Space Before: 0 pt, Line spacing:
Multiple 1.3 li
Lớp :
CNSH-1301
Khoa:
Công Nghệ Sinh Học
Formatted: Space Before: 0 pt, Line spacing:
Multiple 1.3 li
Formatted: Space Before: 0 pt, Line spacing:
Multiple 1.3 li
Formatted: Font: 21 pt
Formatted: Tab stops: 2.64", Left
HÀ NỘI – 2017
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
********************
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Formatted: Left
ĐỀ TÀI:
“Nghiên cứu tNghiên cứu tạo vetor và biểu hiện gen drr C từ
Formatted: Font: Not Italic
Formatted: Font: 16 pt
chủng xạ khuẩn streptomyces peucetius hiết kế vector pIBR25-
Formatted: Font: Not Italic
drr C và biểu hiện gen drr C trên chủng xạ khuẩn Streptomyces
Formatted: Font: Not Italic
Formatted: Font: Not Italic
lividans TK24”
Formatted: Font: Not Italic
Giáo viên hướng dẫn:
TS. Ta Thị Thu Thủy
Sinh viên:
Nguyễn Trọng Duy
Lớp :
CNSH-1301
Khoa:
Công Nghệ Sinh Học
HÀ NỘI – 2017
Formatted: Centered
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
Formatted: Header distance from edge:
0.43", Footer distance from edge: 0.43"
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn các thầy, các cô giáo công tác tại khoa
Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tạo mọi điều kiện cho chúng
em được học tập trong một môi trường khoa học và hoàn thiện nhất.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến cô giáo – TS. Tạ Thị Thu Thủy.
Người đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết đinh hướng nghiên cứu, giúp đỡ em
trong suốt quá trình thực hiện bài khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo - Kỹ sư công nghệ
sinh học đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập và hoàn
thành đề tài nghiên cứu của mình.
Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, và toàn
thể các bạn trong phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử đã động viên, giúp đỡ em
trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Trong quá trình nghiên cứu đề tài, mặc dù bản thân em đã có nhiều cố gắng,
nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót, hạn chế nên em rất mong nhận được
những góp ý của quý thầy – cô để bài khóa luận của em được đầy đủ và hoàn
chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội , ngày 17 19 tháng 5 năm 2017
Sinh viên
Nguyễn Trọng Duy
SV: Nguyễn Trọng Duy
1
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
MỤC LỤC
Formatted: Font: 14 pt, Bold
Formatted: Normal, Centered
Contents Error! Hyperlink reference not valid.
Formatted: Font: 14 pt
MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1978
Formatted: TOC Heading, Justified, Tab
stops: Not at 2.2" + 6.1"
PHầN I:.TỔNG QUAN ........................................................................... 21910
Formatted: Font: 14 pt
1.1 Xạ KHUẩN ......................................................................................... 29910
1.1.1. Xạ khuẩn Streptomyces peucetius. .......................................... 29910
Formatted: TOC Heading, Justified, Tab
stops: 6.1", Right,Leader: … + Not at 6.1"
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
Formatted: Justified
1.1.2. Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24. ................................... 30910
1.2. TổNG QUAN Về KHÁNG SINH DOXORUBICIN.................................... 311011
1.2.1 Giới thiệu chung về kháng sinh Doxorubicin ......................... 311011
1.2.2.Cấu trúc của kháng sinh Doxorubicin.................................... 311112
1.2.3. Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin ................................. 321112
1.2.4.Cơ chế hoạt động và hoạt tính sinh học của kháng sinh
Doxorubicin ..................................................................................... 351516
1.3.CÁC NGHIÊN CứU VÀ ứNG DụNG CủA KHÁNG SINH DOXORUBICIN TRÊN
THế
GIớI ....................................................................................................... 371718
1.3.1 Lịch sử nghiên cứu Doxorubicin ............................................ 371718
1.3.2 Ứng dụng cuả Doxorubicin .................................................... 381819
1.3.3.Thành tựu nghiên cứu ............................................................. 391920
1.4.GEN DRRC....................................................................................... 492122
1.5. TổNG QUAN Về VECTOR TÁCH DÒNG VÀ VECTOR BIểU HIệN. ........... 502123
1.6. MụC TIÊU VÀ NộI DUNG NGHIÊN CứU .............................................. 522425
1.6.1 Mục tiêu nghiện cứu ............................................................... 522425
1.6.2 Nội dung nghiên cứu............................................................... 522425
PHẦN II:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 552627
2.1. VậT LIệU, HÓA CHấT, MÔI TRƯờNG VÀ THIếT Bị................................ 552627
2.1.1 Vật liệu .................................................................................... 552627
2.1.2 Môi trường nuôi cấy ............................................................... 582627
2.1.3 Hóa chất.................................................................................. 602829
SV: Nguyễn Trọng Duy
2
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
Formatted: Justified
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
2.1.4. Thiết bị ................................................................................... 633132
2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CứU...................................................... 643233
2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA genome từ xạ khuẩn ............... 643233
2.2.2 Phương pháp PCR .................................................................. 663334
2.2.3 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ......................... 663334
2.2.4 Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose .......................... 673435
2.2.5 Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn ............. 683435
2.2.6 Phương pháp chuyển gen vào E. coli bằng sốc nhiệt............. 683536
2.2.7 Phương pháp nối DNA ........................................................... 703637
2.2.8 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn ....................... 703638
2.2.9 Phương pháp chuyển gen vào xạ khuẩn Streptomyces lividans bằng
tế bào trần ........................................................................................ 713738
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 733839
3.1. TÁCH DÒNG GEN. ........................................................................... 733839
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
Formatted: Justified
3.1.1 Tách DNA tổng số từ xạ khuẩn Streptomyces peucetius ........ 733839
3.1.2. Nhân gen drr C bằng phản ứng PCR ................................... 743940
3.1.3. Tạo vector tái tổ hợp pGEM-T-drr C .................................... 764041
3.2..THIếT Kế VECTOR BIểU HIệN PIBR25-DRRC TRÊN VI KHUẩN E.COLI JM 109
............................................................................................................. 794243
3.3.CHUYểN
VECTOR PIBR25-DRR
C
VÀO Tế BÀO TRầN
(STREPTOMYCES
LIVIDANS) ............................................................................................. 824445
3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh Thiostrepton phủ tế bào 834445
3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng enzyme (lysozyme) ......... 854546
3.3.3.Ảnh hưởng của nồng độ PEG bổ sung khi chuyển gene ........ 854647
3.4. TÁCH VÀ THU NHậN HỗN HợP ENZYME THÔ DRR C .......................... 864647
4.1 KếT LUậN......................................................................................... 884849
4.2 Đề XUấT .......................................................................................... 884849
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................... 914950
SV: Nguyễn Trọng Duy
3
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
HÌNH 1.1.8: QUY TRÌNH THựC HIệN .................................................... 34
7
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 8
PHầN I:.TỔNG QUAN ................................................................................. 10
1.1 Xạ KHUẩN ............................................................................................... 10
Formatted: Justified
1.1.1. Xạ khuẩn Streptomyces peucetius. ................................................ 10
1.1.2. Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24. ......................................... 10
1.2. TổNG QUAN Về KHÁNG SINH DOXORUBICIN............................................ 11
1.2.1 Giới thiệu chung về kháng sinh Doxorubicin ................................. 11
1.2.2.Cấu trúc của kháng sinh Doxorubicin............................................ 12
HÌNH 1.1. CấU TRÚC KHÔNG GIAN HÓA HọC CủA DOXORUBICIN
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
......................................................................................................................... 12
1.2.3. Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin ......................................... 12
HÌNH 1.2.
CấU TRÚC KHÔNG GIAN CủA DAUNORUBICIN VÀ
Formatted: Justified
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
DOXORUBICIN ............................................................................................. 13
HÌNH 1.3. CÁC GEN THAM GIA VÀO QUÁ TRÌNH SINH TổNG HợP
KHÁNG SINH DXR [32]. .............................................................................. 14
HÌNH 1.4. CÁC GEN THAM GIA VÀO QUÁ TRÌNH MÃ HÓA CHO CÁC
ENZYME POLYKETIDE SYNTHASE LOạI II VÀ TổNG HợP HợP CHấT
TRUNG GIAN Ε-RHODOMYCINONE ....................................................... 15
HÌNH 1.5. CƠ CHế VÀ CON ĐƯờNG TổNG HợP DNR VÀ DXR Từ ΕRHODOMYCINONE ..................................................................................... 16
1.2.4.Cơ chế hoạt động và hoạt tính sinh học của kháng sinh
Doxorubicin ............................................................................................. 16
1.3.CÁC NGHIÊN CứU VÀ ứNG DụNG CủA KHÁNG SINH DOXORUBICIN TRÊN
THế
GIớI ............................................................................................................... 18
1.3.1 Lịch sử nghiên cứu Doxorubicin .................................................... 18
1.3.2 Ứng dụng cuả Doxorubicin ............................................................ 19
SV: Nguyễn Trọng Duy
4
Formatted: Justified
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
1.3.3.Thành tựu nghiên cứu ..................................................................... 20
1.4.GEN DRRC............................................................................................... 22
1.5. TổNG QUAN Về VECTOR TÁCH DÒNG VÀ VECTOR BIểU HIệN. ................... 23
HÌNH 1.6: CấU TRÚC PGEM – T VECTOR DÙNG TRONG TÁCH
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
DÒNG GEN .................................................................................................... 23
HÌNH 1.7. CấU TRÚC VETCOR BIểU HIệN PIBR25 ............................... 24
1.6. MụC TIÊU VÀ NộI DUNG NGHIÊN CứU ...................................................... 25
Formatted: Justified
1.6.1 Mục tiêu nghiện cứu ....................................................................... 25
1.6.2 Nội dung nghiên cứu....................................................................... 25
1.7.2 Nội dung nghiên cứu....................................................................... 26
HÌNH 1.8: QUY TRÌNH THựC HIệN ......................................................... 26
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
PHẦN II:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 27
2.1. VậT LIệU, HÓA CHấT, MÔI TRƯờNG VÀ THIếT Bị........................................ 27
Formatted: Justified
2.1.1 Vật liệu ............................................................................................ 27
- THIếT Kế MồI .............................................................................................. 27
2.1.2 Môi trường nuôi cấy ....................................................................... 27
2.1.3 Hóa chất.......................................................................................... 29
BảNG 1.1 HÓA CHấT Sử DụNG .................................................................. 29
2.1.4. Thiết bị ........................................................................................... 32
BảNG 1.2 THIếT Bị Sử DụNG...................................................................... 32
2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CứU.............................................................. 33
2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA genome từ xạ khuẩn ....................... 33
2.2.2 Phương pháp PCR .......................................................................... 34
2.2.3 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ................................. 34
2.2.4 Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose .................................. 35
2.2.5 Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn ..................... 35
2.2.6 Phương pháp chuyển gen vào E. coli bằng sốc nhiệt..................... 36
2.2.7 Phương pháp nối DNA ................................................................... 37
SV: Nguyễn Trọng Duy
5
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
Formatted: Justified
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
Formatted: Justified
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
2.2.8 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn ............................... 38
2.2.9 Phương pháp chuyển gen vào xạ khuẩn Streptomyces lividans bằng
tế bào trần ................................................................................................ 38
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 39
3.1. TÁCH DÒNG GEN. ................................................................................... 39
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
Formatted: Justified
3.1.1 Tách DNA tổng số từ xạ khuẩn Streptomyces peucetius ................ 39
HÌNH 3.1 ĐIệN DI DNA TổNG Số............................................................... 40
3.1.2. Nhân gen drr C bằng phản ứng PCR ........................................... 40
HÌNH 3.2 ĐIệN DI CHạY PCR GEN DRRC .............................................. 41
3.1.3. Tạo vector tái tổ hợp pGEM-T-drr C ............................................ 41
HINH 3.3 QUI TRINH TạO VECTOR PGEM-T-DRRC ........................... 41
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
Formatted: Justified
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
Formatted: Justified
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
HÌNH 3.4 ĐIệN DI KIểM TRA PLASMID Từ KHUẩN LạC..................... 42
HÌNH 3.5
ĐIệN DI PLASMID PGEM-T-DRRC ĐƯợC CắT BằNG 2
ENZYME ECORI VÀ HINDIII .................................................................... 43
3.2..THIếT Kế VECTOR BIểU HIệN PIBR25-DRRC TRÊN VI KHUẩN E.COLI JM 109
Formatted: Justified
..................................................................................................................... 43
HÌNH 3.6 CHạY ĐIệN DI VECTOR TÁI Tổ HợP PIBR25-DRRC........... 44
3.3.CHUYểN
VECTOR PIBR25-DRR
C
VÀO Tế BÀO TRầN
(STREPTOMYCES
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
Formatted: Justified
LIVIDANS) ..................................................................................................... 45
Để tìm được điều kiện phù hợp cho sự thành công tạo tế bào tái tổ hợp
các thí nghiệm khảo sát về các yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất đến
hiệu xuất chuyển gen đó là: i) Thời gian ủ lysozim để loại bỏ lớp thành tế
bào (petidoglycan) từ 20 đến 70 phút; ii) nồng độ PEG xúc tác cho quá
trình chuyển gen từ 10 đến 60% và iii) nồng độ kháng sinh phủ bề mặt
đĩa chuyển gen từ 50 đến 100 µg.ml-1. .................................................... 45
3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh Thiostrepton phủ tế bào........ 45
BảNG 2.1 ẢNH HƯởNG NồNG Độ KHÁNG SINH KHI PHủ Bề MặT ĐĨA
NUÔI Tế BÀO (OVERLAY) .......................................................................... 45
SV: Nguyễn Trọng Duy
6
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng enzyme (lysozyme) ................. 46
BảNG 2.2 KHảO SÁT NồNG Độ LYSOZYME THÍCH HợP CHO CHUYểN
Formatted: Justified
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
GENE .............................................................................................................. 46
3.3.3.Ảnh hưởng của nồng độ PEG bổ sung khi chuyển gene ................ 47
BảNG 2.3 ẢNH HƯởNG NồNG Độ PEG ĐếN HIệU SUấT CHUYểN
Formatted: Justified
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
GENE .............................................................................................................. 47
3.4. TÁCH VÀ THU NHậN HỗN HợP ENZYME THÔ DRR C .................................. 47
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................... 49
4.1 KếT LUậN................................................................................................. 49
NGHIÊN CứU ĐÃ THựC HIệN ĐƯợC KếT QUả NHƯ SAU:................ 49
4.2 Đề XUấT .................................................................................................. 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 50
Formatted: Justified
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
Formatted: Justified
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
Formatted: Justified
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,
After: 0 pt
Formatted: Justified, Space Before: 0 pt
Formatted: Font: 14 pt
Phần I:.TỔNG QUAN
Formatted: Normal
9
Formatted: Normal, Justified, Tab stops: Not
at 6.1"
1.1. Tổng quan về kháng sinh 9
1.1.1.Định nghĩa về kháng sinh. 9
1.1.2. Lịch sử kháng sinh
9
1.1.3. Phân loại kháng sinh
11
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
12
1.1.5 Các nghiên cứu gần đây về kháng sinh 15
1.2 Xạ Khuẩn
16
1.2.1. Xạ khuẩn Streptomyces peucetius.
16
1.2.2. Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24.
17
1.3. Tổng quan về kháng sinh Doxorubicin 17
1.3.1 Giới thiệu chung về kháng sinh doxorubicin 17
1.3.2.Cấu trúc của kháng sinh Doxorubicin 18
1.3.3. Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin
SV: Nguyễn Trọng Duy
19
7
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
1.3.4.Cơ chế hoạt động và hoạt tính sinh học của kháng sinh Doxorubicin
22
1.4.Các nghiên cứu và ứng dụng của kháng sinh Doxorubicin trên thế giới
24
1.4.1 Lịch sử nghiên cứu Doxorubicin 24
1.4.2 Ứng dụng cuả Doxorubicin
1.4.3.Thành tựu nghiên cứu
1.5.Gen drrC
25
26
28
1.6. Tổng quan về vector tách dòng và vector biểu hiện. 29
1.7. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 31
17.1 Mục tiêu nghiện cứu
31
1.8.2 Nội dung nghiên cứu.
32
PHẦN II:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất, môi trường và thiết bị
2.1.1 Vật liệu
33
2.1.3 Hóa chất
34
2.1.4. Thiết bị
38
2.2 Các phương pháp nghiên cứu
33
33
38
2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA genome từ xạ khuẩn 38
2.2.2 Phương pháp PCR 40
2.2.3 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
40
2.2.4 Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose 41
2.2.5 Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn 41
2.2.6 Phương pháp chuyển gen vào E. coli bằng sốc nhiệt 42
2.2.7 Phương pháp nối DNA
43
2.2.8 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn 43
2.2.9 Phương pháp chuyển gen vào xạ khuẩn Streptomyces lividans bằng
tế bào trần 44
SV: Nguyễn Trọng Duy
8
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách dòng gen.
45
45
3.1.1 Tách DNA tổng số từ xạ khuẩn Streptomyces peucetius
45
3.1.2. Nhân gen drr C bằng phản ứng PCR 45
3.1.3. Tạo vector tái tổ hợp pGEM-T-drr C 46
3.2..Thiết kế vector biểu hiện pIBR25-drrC trên vi khuẩn E.coli JM 109
48
3.3.Chuyển vector pIBR25-drr C vào tế bào trần (Streptomyces lividans)
49
3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh Thiostrepton phủ tế bào
3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng enzyme (lysozyme)
51
3.3.3.Ảnh hưởng của nồng độ PEG bổ sung khi chuyển gene
51
3.4. Tách và thu nhận hỗn hợp enzyme thô drr C
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
50
52
53
4.1 Kết luận 53
4.2 Đề xuất 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO
54
Formatted: Normal
MỞ ĐẦU
8
Formatted: Normal, Justified, Tab stops: Not
at 6.1"
Phần I:.TỔNG QUAN
10
1.1. Tổng quan về kháng sinh 10
1.1.1.Định nghĩa về kháng sinh.
1.1.2. Lịch sử kháng sinh
10
1.1.3. Phân loại kháng sinh
12
Formatted: Normal, Justified, Tab stops: Not
at 6.1"
10
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
13
1.1.5 Các nghiên cứu gần đây về kháng sinh
1.4.Xạ khuẩn.
16
27
Formatted: Normal, Tab stops: Not at 6.06"
+ 6.1"
1.4.2. Xạ khuẩn Streptomyces peucetius. 27
SV: Nguyễn Trọng Duy
9
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
1.4.4. Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24.
Formatted: Normal, Justified, Tab stops: Not
at 6.1"
1.2. Tổng quan về kháng sinh Doxorubicin
1.2.1 Giới thiệu chung về kháng sinh dDoxorubicin
1.2.2.Cấu trúc của kháng sinh Doxorubicin
1.2.3. Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin
18
1.2.4.Cơ chế hoạt động và hoạt tính sinh học của kháng sinh Doxorubicin
1.4Các nghiên cứu và ứng dụng của kháng sinh Doxorubicin trong nước và trên
Formatted: Normal
thế giới
1.4.1 Lịch sử nghiên cứu Doxorubicin
1.4.2Ứng dụng cuả Doxorubicin
1.4.3Thành tựu nghiên cứu
Formatted: Normal, Justified, Tab stops: Not
at 6.1"
1.2.5. Ứng dụng cuả Doxorubicin
1.2.6. Những nghiên cứu trên thế giới và trong nước về Doxorubicin
1.3.Xạ khuẩn.
1.3.1.Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên. 27
1.3.2. Xạ khuẩn Streptomyces peucetius. 31
1.3.4. Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24.
1.45.Giới thiệu về gen drrC
31
2832
1.6 Tổng quan về vector tách dòng và vector biểu hiện.
1.57. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
1.75.1 Mục tiêu nghiện cứu
3233
3233
1.57.2 Nội dung nghiên cứu. 3334
2.1. Quy trình thỰực hiỆện
3334
Formatted: Normal, Justified, Tab stops: Not
at 6.1"
PHẦN II:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất, môi trường và thiết bị
2.1.1 Vật liệu
3435
2.1.3 Hóa chất
3639
2.1.4. Thiết bị
3942
SV: Nguyễn Trọng Duy
3435
3435
Formatted: Normal, Justified, Tab stops: Not
at 6.1"
10
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
2.2 Các phương pháp nghiên cứu
3942
2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA genome từ xạ khuẩn
2.2.2 Phương pháp thiết kế mồi
2.2.3 Phương pháp PCR
3942
4044
4045
2.2.4 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
4145
2.2.5 Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose
4146
2.2.6 Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn
4246
2.2.7 Phương pháp chuyển gen vào E. coli bằng sốc nhiệt
4347
2.2.8 Phương pháp nối DNA 4448
2.2.9 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn
4448
2.2.10 Phương pháp chuyển gen vào xạ khuẩn Streptomyces lividans
bằng tế bào trần 4549
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4751
Formatted: Normal, Justified, Tab stops: Not
at 6.1"
3.1 Thiết kế mồi 51
3.2. Tách dòng gen.
Formatted: Normal, Justified, Tab stops: Not
at 6.1"
4751
3.2.1 Tách DNA tổng số từ xạ khuẩn Streptomyces peucetius
4751
3.2.2. Nhân gen drr C bằng phản ứng PCRTách dòng gene drrC bằng vector
Formatted: Normal
pGEM-T
3.2.3. Tạo vector tái tổ hợp pGEM-T-drr C
Formatted: Normal, Justified, Tab stops: Not
at 6.1"
3.2.2.Tách dòng gene drrC bằng vector pGEM-T
52
3.3. Thiết kế vector biểu hiện pIBR25-drrC trên vi khuẩn E.coli JM 109
5055
3.4.Chuyển vector pIBR25-drr C vào tế bào trần (Streptomyces
lividans)
5156
3.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh Thiostrepton phủ tế bào 5257
SV: Nguyễn Trọng Duy
11
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
3.4.2 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng enzyme (lysozyme) 5358
3.4.3.Ảnh hưởng của nồng độ PEG bổ sung khi chuyển gene 5358
3.5. Tách và thu nhận hỗn hợp enzyme thô drr C
5459
Formatted: Normal, Justified, Tab stops: Not
at 6.1"
SV: Nguyễn Trọng Duy
12
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
4.1 Kết luận
5561
5561
Formatted: Normal, Justified, Tab stops: Not
at 6.1"
4.2 Đề xuất 5561
4.3. Ứng dụng và khả năng phát triển của đề tài.
5661
4.3.1 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc
phòng.
Formatted: Normal, Justified, Tab stops: Not
at 6.1"
5661
4.3.2 Khả năng ứng dụng kết quả nghiên cứu của đề tài
5661
4.3.3.Khả năng phát triển của đề tài 5662
TÀI LIỆU THAM KHẢO
5663
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Normal
Formatted: Space Before: 0 pt, Tab stops:
6.06", Right + 6.1", Right,Leader: …
Formatted: Space Before: 0 pt
SV: Nguyễn Trọng Duy
13
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Chú thích
Amp
Ampicillin
bp
Base paire
C
Carbon
DMSO
Dimethyl sulfoxide
DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTPs
Deoxyribonucleotides
ARN
Ribonucleic Acid
HTKS
Hoạt tính kháng sinh
kb
Kilobase
PCR
Polymerase Chain Reaction
SDS
Sodium dodecyl sulfate
IPTG
Isopropyl-thio-β-galactoside
SDS-PAGE
Sodium Dodecyl Sulfate
DTT
Dithinotheitol
Da
Dalton
Formatted: Normal, Centered, Tab stops: Not
at 6.1"
SV: Nguyễn Trọng Duy
14
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
DANH MỤC BẢNG
Formatted: Font: 14 pt
Bảng 1.1 Hóa chất sử dụng ..........................................................................................
Formatted: Normal, Centered, Tab stops:
6.2", Right,Leader: … + Not at 6.1"
60283439
Formatted: Normal, Tab stops:
6.2",
Right,Leader: … + Not at 6.1"
Bảng 1.2 Thiết bị sử dụng .......................................................................................... g
63313842
Bảng 2.1. Ảnh hưởng nông độ kháng sinh khi phủ bề mặt đĩa nuôi tế bào (overlay)..44Bảng 2.1 Ảnh hưởng nồng độ kháng sinh
Bảng 2.2 Khảo sát nồng độ lysozyme thích hợp cho chuyển genne ............................ e
85455158
Bảng 2.3 Ảnh hưởng nồng độ PEG đến hiệu suất chuyển gene ....................................
85465158
Formatted: Left, Tab stops: 6.2",
Right,Leader: …
Formatted: Font: 13 pt
Formatted: Left
Formatted: Font: 14 pt, Not Bold, Vietnamese
(Vietnam)
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Normal, Centered
SV: Nguyễn Trọng Duy
15
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
Formatted: Font: 14 pt, English (United
States)
Formatted: English (United States)
Formatted
Formatted: Vietnamese (Vietnam)
Formatted: Font: Italic
Formatted: French (France)
DANH MỤC HÌNH VẼ
Formatted: French (France)
Formatted: French (France)
Formatted: Vietnamese (Vietnam)
Hình 1.1.1. Kháng sinh được phát hiện qua các năm (Hopwood, 2007) .. 23911
Hình 1.1..2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh............................................ 26914
Hình 1.1.3. Cấu trúc không gian hóa học của Doxorubicin............... 32112012
Hình 1.1.42.
Cấu trúc không gian của Daunorubicin và Doxorubicin
............................................................................................................. 32122013
Hình 1.1.53. Các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp kháng sinh DXR
Field Code Changed
Formatted: French (France)
Formatted: French (France)
Formatted: Font: Italic, French (France)
Formatted: French (France)
Formatted: French (France)
Formatted: Vietnamese (Vietnam)
Field Code Changed
Formatted: French (France)
............................................................................................................. 33132114
Formatted: French (France)
Hình 1.1.64. Các gen tham gia vào quá trình mã hóa cho các enzyme Polyketide
Field Code Changed
synthase loại II và tổng hợp hợp chất trung gian ε-rhodomycinone ........ 34142215
Formatted: French (France)
Hình 1.1.75. Cơ chế và con đường tổng hợp DNR và DXR từ ε-rhodomycinone
............................................................................................................. 35152316
Hình 1.1.8: Quy trình thực hiện ............................................................................ 34
Hình 1.36: Cấu trúc pGEM – T vector dùng trong tách dòng gen ..... 57263423
Hình 1.74. Cấu trúc vetcor biểu hiện pIBR25 .................................... 58263424
Hình 1.8: Quy trình thực hiện ........................................................................ 26
Hình 23.1 Điện di DNA tổng số ..................................................... 7438464038
Hình 23.2 Qui trình tạo vector pGEM-T-drrC .............................. 7539464139
Hình 23.3 Điện di chạy PCR gen drrC ............................................ 753947140
Hình 23.4 Điện di kiểm tra plasmid từ khuẩn lạc ................................ 7841482
Hình 23.5 Điện di plasmid pGEm-T-drrC được cắt bằng 2 enzyme EcoRI và
HindIII ................................................................................................... 7941492
Hình 23.6 Chạy điện di vector tái tổ hợp pIBR25-drrC ................... 804350443
Hình 23.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR pIBR25-drrC ................ 824450453
SV: Nguyễn Trọng Duy
16
Formatted: French (France)
Formatted: French (France)
Formatted: Font: Italic, French (France)
Formatted: French (France)
Field Code Changed
Formatted: French (France)
Formatted: French (France)
Formatted: French (France)
Formatted: Font: Italic, French (France)
Formatted: French (France)
Field Code Changed
Formatted: French (France)
Formatted: French (France)
Formatted: Vietnamese (Vietnam)
Formatted: French (France)
Formatted: French (France)
Formatted: Font: Italic, French (France)
Formatted: French (France)
Field Code Changed
Formatted: French (France)
Formatted: French (France)
Formatted: Vietnamese (Vietnam)
... [1]
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
Hình 23.8 Điện di enzyme tổng số của: (1) chủng tái tổ hợp ở nhiệt độ 280C;
(băng 2) enzyme tổng số biểu hiện ở nhiệt độ 370C; (băng 4) nhiệt độ 320C;
Formatted: French (France)
Formatted: French (France)
(Băng 3) enzyme tổng số của chủng đối chứng ; M: thang protein chuẩn.
............................................................................................................. 47874753
Formatted: French (France)
Formatted: Vietnamese (Vietnam)
Field Code Changed
Formatted: Normal, Centered
Formatted: French (France)
SV: Nguyễn Trọng Duy
17
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
DANH MỤC HÌNH VẼ
Formatted: Font: 13 pt, Bold
Formatted: Heading 1, Centered, Tab stops:
Not at 6.1"
Hình 1.1.1. Kháng sinh được phát hiện qua các năm (Hopwood, 2007) 11
Hình 1.1..2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh. 14
Hình 1.1.3. Cấu trúc không gian hóa học của Doxorubicin 18
Hình 1.1.4. Cấu trúc không gian của Daunorubicin và Doxorubicin
19
Hình 1.1.5. Các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp kháng sinh DXR
20
Hình 1.1.6. Các gen tham gia vào quá trình mã hóa cho các enzyme Polyketide
synthase loại II và tổng hợp hợp chất trung gian ε-rhodomycinone
21
Hình 1.1.7. Cơ chế và con đường tổng hợp DNR và DXR từ ε-rhodomycinone
22
Hình 1.1.8: Quy trình thực hiện 34
Hình 1.3: Cấu trúc pGEM – T vector dùng trong tách dòng gen 36
Hình 1.4 Cấu trúc vetcor biểu hiện pIBR25
Hình 2.1 Điện di DNA tổng số
Formatted: Heading 1, Centered, Tab stops:
Not at 6.1"
37
52
Hình 2.2 Qui trình tạo vector pGEM-T-drrC
52
Hình 2.3 Điện di chạy PCR gen drrC 53
Hình 2.4 Điện di kiểm tra plasmid từ khuẩn lạc
54
Hình 2.5 Điện di plasmid pGEm-T-drrC được cắt bằng 2 enzyme EcoRI và
HindIII
54
Hình 2.6 Chạy điện di vector tái tổ hợp pIBR25-drrC
55
Hình 2.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR pIBR25-drrC
56
Hình 2.8 Điện di enzyme tổng số của: (1) chủng tái tổ hợp ở nhiệt độ 280C;
(băng 2) enzyme tổng số biểu hiện ở nhiệt độ 370C; (băng 4) nhiệt độ 320C;
(Băng 3) enzyme tổng số của chủng đối chứng ; M: thang protein chuẩn.
60
Formatted: Heading 1, Centered
Formatted: (none)
SV: Nguyễn Trọng Duy
18
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
MỞ ĐẦU
Formatted: Font: Bold, (none)
Công nghệ sinh học đang được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như công
Formatted: English (United States)
nghiệp,nông nghiệp, y học, dịch vụ, du lịch… nhằm phục vụ cho mọi nhu cầu của
cuộc sống như dinh dưỡng, giải trí,chăm sóc sức khỏe…Bằng những kiến thức sinh
học về thực vật ,động vật, nấm,vi khuẩn… những nhà khoa học đang cố gắng tạo ra
những cây trồng,vât nuôi có năng xuất và chất lượng cao,những loại thực
phẩm,dược phẩm phục vụ cho việc chữa bệnh cho con người.
Theo bản tin về ung thư của tổ chức Y tế Thế giới (WHO) số 297 tháng 2
Formatted: Indent: First line: 0.5"
năm 2011,ung thưs là nguyên nhân gây tử vong hang đầu trên toàn thế giới.Tị lệ tử
Formatted: English (United States)
vong do ung thư năm 2008 chiếm 13%, với số lượng 7.6 triệu người trong số 57
triệu ca tử vong do bệnh toàn cầu.
Ung thư có thể ở bất kì bộ phận nào của cơ thể.Không thể dễ dàng kể hết tên
tất cả các loại ung thư đã được phát hiện ở thời điểm hiện tại.Một tính năng xác
định của ung thư là các tế bào bất thường phát triển nhanh chóng vượt ra ngoài giới
hạn thông thường của nó,xâm nhập vào các bộ phận liền kề và lây sang các cơ quan
khác của cơ thể ,quá trình đó được gọi là di căn và là nguyên nhân chính gây ra tử
vong cho người bệnh.
Như vậy trong suốt khoảng 5000 năm lịch sử, loài người đã hiểu được bản chất
Formatted: English (United States),
Condensed by 0.2 pt
của bệnh ung thư,tuy nhiên việc phòng tránh và chữa bệnh ung thư vẫn đang là thách
thức to lớn của toàn nhân loại.Với tình hình tốc độ phát triển như hiện nay ,theo Tổ
chức Y Tế thế giới dự đoán đến năm 2030 loài người sẽ đối mặt với số ca tử vong do
các bệnh ung thư tăng lên hơn 11 triệu người trên toàn Thế giới.Nhưng ở một số nước
phát triển như Hoa Kỳ,theo thống kê của tổ chức ung thư Hoa Kỳ cho thấy tỉ lệ ca tử
vong vì bệnh ung thư trong 2 thập kỉ qua có xu hướng giảm từ đỉnh điểm 215/100.000
người năm 1991 xuống 175/100.000 người năm 2010.Điều đó chúng tỏ vai trò vô
cùng quan trọng của các chất kháng sinh tham gia vào quá trình điều trị ung thư.
Formatted: English (United States)
Doxorubicin(DXR) được biết đến bởi các đặc điểm vượt trội của nó như có
Formatted: Left, Space Before: 6 pt
phổ tác dụng và tác động mạnh mẽ ,trực tiếp vào quá trình tổng hợp tế bào ung thư
mới. Doxorubicin(DXR) là một loại kháng sinh có giá thành rất đắt và hiện nay ở
SV: Nguyễn Trọng Duy
19
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
Việt Nam chưa sản xuất được. Tuy nhiên trong con đường sinh tổng hợp tự nhiên
của chủng xạ khuẩn Strepyomyces peucetius thì hàm lượng Daunorubicin (DNR)
được tạo ra với hàm lượng lớn hơn rất nhiều so với DXR. Chính vì vậy,song song
với việc tìm kiếm các loại thuốc kháng sinh trị bênh ung thư mới thì việc nâng cao
hiệu xuất quá trình tổng hợp các loại chống ung thư mới thì việc nâng cao hiệu xuất
sinh tổng hợp các loại thuốc kháng sinh đã biết cũng đóng góp một phần không nhỏ
trong cuộc chiến chống ung thư.Một trong những biện pháp làm tăng năng suất
kháng sinh DXR đó là thực hiện phản ứng in vitro để biến đổi Daunorubicin thành
Doxorubicin. Vì vậy cùng với sự hướng dẫn, giúp đỡ của cô giáo hướng dẫn TS. Tạ
Thị Thu Thủy và các thầy cô cùng toàn thể bạn bè trong phòng thí nghiệm sinh
học phân tử, em đã thực hiện đề tài nghiên cứu mang tên: “Nghiên cứu thiết
Nghiên cứu tạo vetor và biểu hiện gen drrC từ chủng xạ khuẩn streptomyces
Formatted: Font: 13 pt
peucetius kế vector pIBR25-drrC và biểu hiện nhóm gen drrC trên chủng xạ
Formatted: English (United States)
khuẩn Streptomyces lividans” nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh
Formatted: English (United States)
DXR.
Formatted: Font: Bold, English (United States)
Formatted: English (United States)
Formatted: Centered
SV: Nguyễn Trọng Duy
20
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
Phần PHẦN I:.TỔNG QUAN
Formatted: Font: 13 pt
Formatted: Font: 13 pt
Formatted: Font: 13 pt, (none)
Formatted: (none)
Formatted: English (United States)
Formatted: Space Before: 0 pt
SV: Nguyễn Trọng Duy
21
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoa Công Nghệ Sinh Học
1.1. Tổng quan về kháng sinh
Formatted: (none)
1.1.1.Định nghĩa về kháng sinh.
Formatted: Font: 13 pt
Formatted: Font: 13 pt, (none)
Thời kì vàng son của kháng sinh bắt đầu từ khi sản xuất penicillin để dùng
Formatted: Heading 2
trong lâm sàng (1941). Khi đó người ta đã định nghĩa : "Kháng sinh là những
sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm),
Formatted: Font: 13 pt
Formatted: Heading 2, Left
có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật
khác", theo Waksman1942.
Tuy nhiên, với sự phát triển của khoa học, người ta có thể tổng hợp, bán tổng
hợp các kháng sinh tự nhiên (chloramphenicol), tổng hợp nhân tạo các chất có
tính kháng sinh: sulfamid, quinolon hay chiết xuất từ vi sinh vật những chất
diệt được tế bào ung thư (actinomycin). Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được
thay đổi: “Kháng sinh là tất cả các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng
hợp với nồng độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu
diệt đối với các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác
dụng yếu lên con người, động vật và thực vật bằng con đường cung cấp chung”
[3].
Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml dung
Formatted: Heading 2, Left, Indent: First line:
0"
dịch (đơn vị/ml) hay 1 mg chế phẩm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị kháng
sinh. Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan trong một thể
tích môi trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định
trong thời gian xác định [3]. Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI
penicillin = 0,6 µg, còn 1 UI streptomycin = 1,0µg (Hopwood, 2007).
1.1.2. Lịch sử kháng sinh
Formatted: Font: 13 pt, (none)
Kháng sinh được phát hiện và ứng dụng sớm nhất là penicilin cách đây hơn 70
năm. Nhưng thực tế, từ lâu con người đã biết dùng các chất có tác dụng chữa
trị các bệnh mà sau này được gọi là các chất kháng sinh.
Giữa thế kỷ 17, một thầy thuốc hoàng gia Anh đã chữa bệnh bằng cách dùng
rêu đắp lên vết thương.
Cuối thế kỷ 19 tại Anh, các mẫu bánh mì mốc được dùng để chữa vết thương.
Theo quan điểm khoa học hiện nay thì thì mốc meo trên bánh mỳ thực tế có
SV: Nguyễn Trọng Duy
22
Formatted: Heading 2
Formatted: Font: 13 pt
Formatted: Heading 2, Left, Indent: First line:
0"
