Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease của HIV-1 trên nấm men Pichia pastoris

Header Page 1 of 128.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Đặng Thị Thanh Nhàn

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ
HÓA PROTEASE CỦA HIV-1 TRÊN
NẤM MEN PICHIA PASTORIS

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

MỞ ĐẦU

Hà Nội, 2015

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 1 of 128.


Header Page 2 of 128.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đặng Thị Thanh Nhàn

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE
CỦA HIV-1 TRÊN NẤM MEN PICHIA PASTORIS
Chuyên nghành: Di truyền học

Mã số:

60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Đinh Nho Thái
TS. Nguyễn Thị Hồng Loan

Hà Nội, 2015

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 2 of 128.


Header Page 3 of 128.

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đinh Nho Thái,
người thầy đã tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm
thí nghiệm và viết luận văn. Thầy đã không ngại khó khăn hướng dẫn, giúp đỡ tôi
làm quen từ những nguyên tắc và thao tác đầu tiên trong nghiên cứu khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hồng Loan, đã tận tình hướng
dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này.
Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các
cán bộ, thành viên trong nhóm nghiên cứu tại bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học
và phòng protein tái tổ hợp, phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzym và
protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN. Tôi xin chân thành cảm ơn
về sự giúp đỡ quý báu đó.

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo trong bộ môn Di truyền học cũng như các
thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN
đã giảng dạy và chỉ bảo cho tôi những kiến thức và kỹ năng cần thiết trong quá
trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo cùng các đồng nghiệp tại Trường THPT
Nguyễn Du, Thanh Oai, HN, đã ủng hộ, tạo điều kiện cho tôi trong thời gian học
tập vừa qua.
Lời cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, chồng,
con, những người thân trong gia đình tôi đã chia sẻ, động viên và hết lòng giúp đỡ
tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2014

Học viên:
Đặng Thị Thanh Nhàn

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 3 of 128.


Header Page 4 of 128.

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆUERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.1. TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV ...............ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.1.1. Lịch sử hình thành AIDS ......................... Error! Bookmark not defined.

1.1.2. Thực trạng nhiễm HIV-1 .......................... Error! Bookmark not defined.
1.1.3. Cấu trúc hình thể và hệ gen của HIV-1 ... Error! Bookmark not defined.
1.1.4. Các thuốc điều trị HIV/AIDS hiện nay ... Error! Bookmark not defined.
1.2. TỔNG QUAN VỀ PROTEASE HIV-1 .......ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.2.1. Protease HIV-1 .......................................... Error! Bookmark not defined.
1.2.2. Chức năng của protease HIV – 1. ............ Error! Bookmark not defined.
1.2.3. Sơ lƣợc về nghiên cứu biểu hiện protease HIV-1 trên thế giới. ...... Error!
Bookmark not defined.
1.2.4. Thực trạng sản xuất protease HIV-1 ở Việt NamError! Bookmark not
defined.
1.3. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ P. PASTORIS ....ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.3.1. Đặc điểm của P. pastoris ......................... Error! Bookmark not defined.
1.3.2. Ƣu nhƣợc điểm của hệ thống biểu hiện P. pastorisError! Bookmark not
defined.
1.3.3. Chủng nấm men P. pastoris biểu hiện protease HIV-1Error! Bookmark
not defined.
1.3.4. Vector nhân dòng và biểu hiện ở P. pastorisError!

Bookmark

not

defined.
1.3.5. Cơ chế sát nhập gen ngoại lai vào hệ gen P. pastorisError!

Bookmark

not defined.
1.3.6. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastorisError!

Bookmark

not

defined.
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................24
2.1. NGUYÊN LIỆU ..........................................ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 4 of 128.


Header Page 5 of 128.

2.1.1. Chủng vi sinh vật ..................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác ................ Error! Bookmark not defined.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
2.2.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng kỹ thuật PCR ..... Error!
Bookmark not defined.
2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose .................. Error! Bookmark not defined.
2.2.3. Gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện: .......... Error!
Bookmark not defined.
2.2.4. Tách chiết và định lƣợng DNA plasmid .. Error! Bookmark not defined.
2.2.5. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1Error! Bookmark not
defined.
2.2.6. Biến nạp vector vào nấm men bằng phƣơng pháp xung điện .......... Error!
Bookmark not defined.
2.2.7. Điện di protein trên gel polyacyamide (SDS-PAGE)Error!

Bookmark

not defined.
2.2.8. Thẩm tách miễn dịch (Western Blotting) Error! Bookmark not defined.
2.2.9. Phƣơng pháp biểu hiện và thu nhận protein.............................................35
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………37
3.1. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1. .................. ERROR!
BOOKMARK NOT DEFINED.
3.1.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCRError! Bookmark
not defined.
3.1.2. Tinh sạch plasmid pPIC9 từ E. coli ......... Error! Bookmark not defined.
3.1.3. Cắt sản phẩm PCR và cắt mở vòng plasmid bằng enzym giới hạn . Error!
Bookmark not defined.
3.1.4. Tạo vector tái tổ hợp pPIC9 chứa gen mã hóa protease HIV-1 bằng phản
ứng ligase .................................................................. Error! Bookmark not defined.
3.1.5. Kết quả giải trình tự xác định sự có mặt của protease HIV-1 trong vector
biểu hiện pPIC9 ......................................................... Error! Bookmark not defined.

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 5 of 128.


Header Page 6 of 128.

3.2. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1 TRÊN P.
PASTORIS. .........................................................ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
3.2.1. Tạo dòng nấm men P. pastoris có chứa plasmid tái tổ hợp mang gen mã
hóa protease HIV-1 ................................................... Error! Bookmark not defined.
3.2.2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 trên P. pastoris Error!
Bookmark not defined.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1. KẾT LUẬN ....................................................ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
2. KIẾN NGHỊ ....................................................ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................3

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 6 of 128.


Header Page 7 of 128.

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Cấu trúc của một hạt virus HIV-1......................................................................6
Hình 2. Cấu tạo của hệ gen virus HIV-1......................................................................7
Hình 3. Mô hình cấu trúc bậc hai của protease HIV-1................... ..............................12
Hình 4. Bản đồ vector biểu hiện pPIC9.... ...................................................................21
Hình 5. Cơ chế trao đổi chéo xảy ra tại locus HIS4 giữa bộ gen của tế bào với vector
biểu hiện....................................................................................................................22

Hình 6. Kết quả nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng
PCR.................Error! Bookmark not defined.
Hình 7. Điện di sản phẩm tách chiết
plasmid...........................................................Error! Bookmark not defined.
Hình 8. Điện di sản phẩm cắt mở vòng plasmid và sản phẩm PCR bằng các enzym
giới hạn NotI và
EcoRI..............................................................................................Error! Bookmark
not defined.
Hình 9. Điện di sản phẩm PCR của các khuẩn lạc E. coli
DH5α............................Error! Bookmark not defined.
Hình 10. So sánh trình tự cấu trúc Prot trên khuẩn lạc với cấu trúc Prot lý
thuyết..Error! Bookmark not defined.
Hình 11. Sự hình thành khuẩn lạc trên P. pastoris
SMD1168................................Error! Bookmark not defined.
Hình 12. Sản phẩm PCR khuẩn lạc thu đƣợc sau biến nạp vector tái tổ hợp vào nấm

men............................................................................................................................E
rror! Bookmark not defined.

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 7 of 128.


Header Page 8 of 128.

Hình 13. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng P. pastoris SMD1168 sau khi biểu
hiện ở môi trƣờng có chứa 0.5% methanol theo thời
gian…………………………Error! Bookmark not defined.
Hình 14. Điện di SDS-PAGE kiểm tra sự có mặt của protease HIV-1 trong chủng
tái tổ hợp
SMD1168..................................................................................................Error!
Bookmark not defined.
Hình 15. Kết quả kiểm tra protein bằng thẩm tách miễn dịch Western
Blot...........Error! Bookmark not defined.

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 8 of 128.


Header Page 9 of 128.

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1. Một số chủng P. pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tái tổ
hợp............................................................................................................................Er
ror! Bookmark not defined.
Bảng 2. Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng
PCR.................................................Error! Bookmark not defined.

Bảng 3. Thành phần phản ứng
PCR.........................................................................Error! Bookmark not defined.
Bảng 4. Thành phần phản ứng cắt enzym giới
hạn..................................................Error! Bookmark not defined.
Bảng 5. Thành phần gel tách và gel cô trong SDS-PAGE
......................................Error! Bookmark not defined.
Bảng 6. Khả năng sinh trƣởng của các dòng nấm men tái tổ hợp thông qua chỉ số
OD600 theo thời gian lên men, lặp lại thí nghiệm 3
lần.............................................Error! Bookmark not defined.

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 9 of 128.


Header Page 10 of 128.

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AIDS

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải
(Acquired Immuno Deficiency Syndrome)

ART

Liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus(Antiretroviral drug therapy)

AOX

Alcohol oxidase

Amp

Ampicillin

BMGY

Buffered Minimal Glycerol Yeast

Bp

Base pair

DNA

Axit deoxyribonucleic

ddNTP

dideoxyribonucleotide – triphosphate

E. coli

Escherichia coli

HIV

Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời
(Human immunodeficiency virus)

HIS:

Histidine

KLPT

Khối lƣợng phân tử

kb

Kilobase

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria-Bertani

mRNA

RNA thông tin (Messenger RNA)

MM:

Môi trƣờng Minimal Methanol

P. pastoris

Pichia pastoris

PCR

Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase Chain Reaction)

PI

Chất ức chế protease (Protease Inlibitor)

RNA

Axit ribonucleic

SDS

Sodium dodecyl sunfat

SDS-PAGE:

phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamid có SDS
(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)

UNAIDS

Chƣơng trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc
( United Nation Program on HIV/AIDS)

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 10 of 128.


Header Page 11 of 128.

MỞ ĐẦU
Virus gây suy giảm miễm dịch ở ngƣời (Human Immuno Deficiency VirusHIV) là nguyên nhân chính gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở
ngƣời (AIDS). Đây là một trong các bệnh đã làm nhiều ngƣời chết nhất trong lịch
sử loài ngƣời [49]. Có hai type HIV gây nên AIDS là HIV type 1 (HIV-1) và HIV
type 2 (HIV - 2), nhƣng HIV-1 độc hơn HIV-2 và là nguyên nhân chính của các ca
nhiễm HIV trên toàn thế giới từ khi xuất hiện cho tới nay [28].
Để tồn tại và phát triển, HIV-1 cần đến 3 enzym quan trọng không thể thiếu
trong sao chép, đóng gói và hình thành virus hoàn chỉnh đó là: enzym phiên mã
ngƣợc reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease. Nếu một trong ba
enzym này bị ức chế chu kì sống của HIV sẽ bị ảnh hƣởng, chính vì vậy hƣớng
nghiên cứu tìm ra chất ức chế các enzym trên để sản xuất thuốc điều trị cho các bệnh
nhân AIDS đã đƣợc rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Các điều trị theo
hƣớng sử dụng chất ức chế 3 enzym đó gọi là liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus
ART (antiretroviral drug therapy) [28].
Enzym protease của HIV-1 (đƣợc gọi tắt là protease HIV-1) đƣợc mã hoá bởi
gen pol của virus có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag – pol) thành các
protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus có thể tiếp tục lây nhiễm. Nếu
protease bị mất hoạt tính, HIV-1 sẽ không đƣợc đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn
chỉnh [19]. Tuy nhiên, do HIV-1 có tốc độ sinh sản nhanh, có khoảng 10 triệu hạt
virus mới đƣợc tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót của enzym reverse transcriptase là
1/10.000 base dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm
bệnh thậm chí khi chƣa điều trị. Ngày càng có nhiều chất ức chế protease (PI)
chống HIV đƣợc phát triển và thƣơng mại hóa nhƣng vẫn chƣa tìm đƣợc chất ức
chế nào thực sự có hiệu quả. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra chất ức chế protease
một cách hiệu quả là nhiệm vụ quan trọng góp phần đẩy lùi HIV/AIDS. Quá trình
nghiên cứu nhằm tìm ra chất ức chế protease này cần một lƣợng lớn protease nên
việc sản xuất, tinh sạch protease HIV-1 là rất cần thiết.

1 Page 11 of 128.

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer


Header Page 12 of 128.

Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1
trên toàn thế giới. Trong thực tế nghiên cứu, protease HIV-1 không dễ dàng biểu
hiện trong tế bào vật chủ do đặc tính gây độc tế bào, khó tan, lƣợng protease thu
đƣợc sau biểu hiện thƣờng thấp, khó phát hiện. Do đó, cần có những nghiên cứu để
sản xuất protease HIV-1 có tính tan và hiệu quả hơn.
Phần lớn các công trình nghiên cứu sản xuất protease HIV-1 ở Escherichia
coli (E. coli), vì đây là hệ thống biểu hiện đơn giản, dễ nuôi cấy [3; 18; 41]. Tuy
nhiên, E. coli là một sinh vật nhân sơ và thiếu các cơ quan nội bào chẳng hạn nhƣ
mạng lƣới nội chất và bộ máy golgi nhƣ trong sinh vật nhân chuẩn (có chức năng
cải biến protein sau tổng hợp). Nhiều protein của sinh vật nhân chuẩn khi biểu hiện
ở E. coli không tạo thành dạng protein hoàn chỉnh có chức năng bởi những cải biến
sau dịch mã không diễn ra. Hạn chế này đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng các hệ
thống biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn nhƣ nấm men và động vật có vú. Nấm men
có cấu trúc đơn giản, nhƣng chúng mang đầy đủ các đặc điểm của một cơ thể và là
một mô hình tiêu biểu cho cấu trúc tế bào nhân chuẩn. Nhiều protein của tế bào
nhân thực đã đƣợc sản xuất thành công bằng hệ thống biểu hiện nấm men
Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) [10]. Ngoài S. cerevisiae, nấm men Pichia
pastoris (P. pastoris) cũng bắt đầu đƣợc quan tâm sử dụng để biểu hiện protein của
sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt từ khi promoter alcohol oxidase đƣợc phân lập và tạo
dòng. P. pastoris còn là hệ thống biểu hiện đáng tin cậy và có tiềm năng hơn E. coli
hay S. cerevisiae để sản xuất protein ngoại lai dạng hòa tan [27].
Để tạo ra chế phẩm protease HIV-1 nhằm phát triển chất ức chế sự nhân lên
của virus HIV-1, làm cơ sở cho việc nghiên cứu tìm ra thuốc điều trị HIV/AIDS,
cùng với thuận lợi của hệ thống biểu hiện của nấm men P. pastoris so với E. coli,
chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa

protease của HIV-1 trên nấm men P. pastoris” với các nội dung:
- Nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện.
- Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa protease HIV-1 trên nấm men P.
pastoris.

2 Page 12 of 128.
luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer


Header Page 13 of 128.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tài liệu Tiếng Việt
1. Phan Trọng Hoàng, Ngô Văn Trƣờng, Lê Văn sơn, Lê Trần Bình, Chu Hoàng
Hà (2007) “Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa tiểu đơn vị p66 của enzym
phiên mã ngƣợc của virus HIV-1”, Tạp chí khoa học Công nghệ Sinh học, 5,
tr 463-470.
2. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thành Hổ, Chương 20 – Di truyền học vi sinh vật
học, giáo trình Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Việt Nam.
3. Nguyễn Thị Hồng Loan (2012), Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số
tính chất của protease từ HIV-1 tại Việt Nam, Luận án Tiến sỹ Sinh học,
Trƣờng Đại học khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
4. Đỗ Thị Hồng (2005), Nghiên cứu biểu hiện vùng gen

preM-env

của virus

Dengue typ 2 trong nấm men Pichia pastoris, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh

học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội.
5. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Hóa sinh học thực nghiệm, giáo trình, NXB Giáo
dục Việt Nam, tr 91-109.
6. Phạm Đức Minh, Đặng Xuân Kiên, Trần Văn Tuấn, Trần thị Oanh, Lê Bách
Quang, (2013), “Đặc điểm phân bố các subtyp HIV-1 tại Việt nam”, tạp chí
Y-Dược học quân sự (số 5-2013) tr 33-40.
7. Đồng Văn Quyền, Hoàng Anh, Bạch Thị Nhƣ Quỳnh, Phạm Minh Tuấn,
Nguyễn Thanh Tùng, Lê Thị Tâm, Đinh Duy Kháng (2008), “Tách dòng và
biểu hiện gen p24 từ chủng HIV lƣu hành ở Việt Nam và nghiên cứu phản
ứng của protein tái tổ hợp với kháng thể HIV trong huyết thanh bệnh nhân”,
Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6, tr 27-34.
8. Bạch Thị Nhƣ Quỳnh, Vũ Thị Hiền, Hà Thị Thu, Nguyễn Phƣơng Hoa, Lê
Phƣơng Hằng, Nguyễn Thanh Tùng, Nguyễn Xuân Bắc, Đồng Văn Quyền,
Lê Văn Phủng, Đinh Duy Kháng (2011), “ Biểu hiện protein GP41 của virus
HIV phân type CRF01_ AE trong E. coli ứng dụng để phát hiện kháng thể
kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân bằng Western blot và ELISA”, Tạp
chí Công nghệ Sinh học, 9, tr 29-36.

3 Page 13 of 128.
luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer


Header Page 14 of 128.

9. Bạch Thị Nhƣ Quỳnh (2012), Nghiên cứu tạo protein tái tổ hợp của HIV-1 và
ứng dụng để phát triển kit chẩn đoán HIV/AIDS, Luận án Tiến sỹ Sinh học,
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
10. Nguyễn Thị Phƣơng Trang, Kim Young-Ho, Đinh Duy Kháng, Đồng Văn
Quyền (2007), "Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa polymerase của virus
viêm gan B trên bề mặt tế bào Sacharomyces", Tạp chí Công nghệ sinh học

5(4), 419-424.

II. Tài liệu Tiếng Anh
11. Randy S., (2007), And The Band Played On, St. Martin's Press, pp. 227.
12. Aurel Lupulescu, Maibach Howard I., (1990), Hormone and vitamins in
cancer treatment, CRC PR INC, pp. 131 - 133
13. Anson B.D., Weaver J.G., Ackerman M.J., Akinsete O., Henry K., January
C.T., Badley A.D.(2005), “Blockade of HERG channels by HIV protease
inhibitors”, Lancet 365: pp. 682-686.
14. Chen J., Liang Z., Wang W., Yi C., Zhang S., Zhang Q., (2014), "Revealing
origin of decrease in potency of darunavir and amprenavir against HIV-2
relative to HIV-1 protease by molecular dynamics simulations", Sci Rep.
Nov 3;4:6872. doi: 10.1038/srep06872.
15. Cheng Y.S.E., McGowan M.H., Kettner C.A., Schloss J.V., Erickson S., Yin
F.H. (1990), “High-level synthesis of recombinant HIV-1 protease and the
recovery of active enzym from inclusion bodies”, Gen, 87, pp. 243-248.
16. Cereghino L. N., Geoffrey P., Sunga A. J., Lin Cereghino J., and Cregg J.
M. (2001), “Expression of foreign gens in the yeast P. pastoris”, Gent. End.
23, pp. 157-16
17. Cuba reports modest progress in HIV -1 (2013), Xinhua via NewsPoints Desk.
18. Danley D.E., Geoghegan K.F., Scheld K.C., Lee S.E., Merson J.R.,
Hawrylik S.J., Rickett G.A., Atmnirati M.J. and Hobart P.M. (1989),
“Crystallizable HIV-l protease derived from expression of the viral pol gen
in Escherichia coli”. Biochem Biophys Res Commun, 165, pp. 1043-1050.

4 Page 14 of 128.
luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer


Header Page 15 of 128.

19. Darke P.L., Leu C.T., Davis L.J., Heimbach J.C., Diehl R.E., Hill W.S.,
Dixon R.A.F. and Siga I.S. (1989), “Human immunodeficiency virus
protease bacterial expression and characterization of the purified aspartic
protease”, J. Biol. Chem, 264, pp. 2307-2312.
20. Dalgleish A.G., Beverley P.C., Clapham P.R., “The CD4 (T4) antigen is an
essential component of the receptor for the AIDS retrovirus”. Nature 1984,
312: 763-7. />21. Ellis S. B., Brust, P. F., Koutz, P. J., Waters, A. F., Harpold, M. M., and Gingeras,
T. R. (1985), “Isolation of alcohol oxidase and two other methanol regulatable
gens from the yeast P. pastoris”, Mol. Cell. Biol, 5, pp. 1111-1121.
22. Jahic M., Veide, A., Charoenrat, T., Teeri, T., and Enfors, S.-O. (2006),
“Process technology for production and recovery of heterologous proteins
with P. pastoris”, Biotechnol. Prog, 22, pp. 1465–1473.
23. Frank Bruce H., Heiney, Richard E., ( 1995). "Process for transformating a
human insulin precursor to human insulin", US Patent 5457066
24. Greene W.C. (2007), "A history of AIDS: looking back to see ahead", Eur. J.
Immunol, 37, pp. 94-102.
25. Galli M., Ridolfo A.L., Adorni F., Gervasoni C., Ravasio L., Corsico L.,
Gianelli E., Piazza M., Vaccarezza M., d'Arminio Monforte A., Moroni M.
(2002), "Body habitus changes and metabolic alterations in protease
inhibitor-naive HIV-1-infected patients treated with two nucleoside reverse
transcriptase inhibitors", AIDS, 29, pp. 21-31.
26. Hare B.C., (2006), "Clinical Overview of HIV Disease", HIV Insite
Knowledge Base Chapter- Nguồn www.hivinsite.ucsf.edu.
27. Higgins D.R. and Cregg J.M., (1998), Pichia protocol, Methods in
molecular biology, Humana Prees.
28. Hoffmann C., Rockstroh J.K., Kamps B.S. HIV medicine (2007), www. HIV
Medicine.com.

5 Page 15 of 128.

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer


Header Page 16 of 128.

29. Invitrogen, Pichia Expression Kit: A manual of Method for Expression of
Recombinant Protein in P. pastoris. Catalog K1710-01
30. Laemmli U.K. (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly
of the head of bacteriophage T4", Nature 227, pp. 680-685.
31. Leuthardt A., Roesel J.L.(1993), “Cloning, expression and purification of a
recombinant poly-HIStidine-linked HIV-1 protease”, FEBS Lett, 36, pp. 275280.
32. Lin-Cereghino, G.P., Stark, C.M., Kim, D., Chang, J., Shaheen, N.,
Poerwanto, H., Agari, K., Moua, P., Low, L.K., Tran, N., et al. (2013), “The
Effect of?-Mating Factor Secretion Signal Mutations on Recombinant
Protein Expression in Pichia pastoris”, Gene 519, pp. 311–317.
33. Marx J.L. (August 1982). "New disease baffles medical community".
Science 217 (4560): 618–21.
34. Macauley-Patrick S., Fazenda M.L., McNeil B., and Harvey L.M., (2005),
“Heterologous protein production using the P. pastoris expression system”.
Yeast, 22, pp. 249–270.
35. McCormac A. C., et al., (1998). “A simple method for the production of
highly competent cells of

Agrobacterium for transformation via

electroporation”. Molecular Biotechnology 9:155-159.
36. Miyeko Mana and David Marcey (2001), HIV-1 Protease, Clu Biology
Department.
37. Mike Romanos (1995), “Advances in the use of P. pastoris for high level
gen expression”, Current Opinion in Biotechnology, 6, pp. 527-533.

38. Oriol C., Ramon R., Jose Luis M., & Francisco V., (2006), “Monitoring
and control of hetorologous protein production in the methylotrophic
yeast Pichia pastoris under different promoters”, Bio Med central
Operation strategies

6 Page 16 of 128.
luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer


Header Page 17 of 128.

39. Pichuantes S., Babe L. M., Barr P. l. & Craik C. S. (1989), “Recombinant
HIVl protease secreted by Saccharomyes cerevisiae correctly processes
myristylated gag polyprotein”, Proteins: Struct Funct Gent 6, 324-337.
40. Plantier, J.C. (2009) ''A new human immunodeficiency virus derived from
gorillas'', Nature Medicine, 2nd August.
41. Rangwala S.H., Finn R.F., Smith C.E., Berberich S.A., Salsgiver W.J.,
Stallings W.C., Glover G.I., Olins P.O. (1992), “High-level production of
active HIV-1 protease in Escherichia coli”, Gen, 122, pp. 263-269.
42. Sanger F., Nicklen S. and Coulson A.R. (1977), “DNA sequencing with chain
terminator inhibitors”, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, pp. 5463-5467.
43. Shedlock D.J., Daniel H., Andy Y.C., Christopher W.C., Karuppiah M.,
David B.W. (2008), "HIV-1 viral gen and mitochondria apoptosis",
Apoptosis, 13, pp. 1088-1099.
44. Siliciano J.D., Kajdas J., Finzi D., Quinn T.C., Chadwick K., Margolick
J.B., Kovacs C., Gange S.J., Siliciano R.F. (2003), "Long-term follow-up
studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting
CD4+ T cells", Nat. Med, 9, pp. 727-728
45. Seelmeier S., Schmidt H., Turk, V. and Helm K.V.D. (1988), "Human
immunodeficiency virus has an aspartic-type protease that can be inhibited

by pepstatin A", Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, pp. 6612-6616.
46. Taylor A., Brown P.D., Kadam S., Maus M., Kohlbrenner E.W., Weigl D.,
Turon C.M. and Katz L. (1992), “High-level expression and purification of
mature HIV-I protease in Escherichia coli under control of the araBAD
promoter”, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37, pp. 205-210.
47. Tie Y. (2006), Crystallographic analysis and kinetic studies of HIV-1
protease and drug-resistant mutants, Chemistry Dissertations, Department
of Chemistry, Georgia State University, pp. 2.
48. Tie Y., Wang YF, Boross PI, Chiu TY, Ghosh AK, Tozser J, Louis J.
M., Harrison RW, Weber IT, (2012), Critical differences in HIV-1 and HIV-2
protease specificity for clinical inhibitors, Protein Sci. Epub 2012 Jan 24.

7 Page 17 of 128.
luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer


Header Page 18 of 128.

49. UNAIDS in Vietnam from www.unaids.org.vn.
50. Yanchunas J., Langley D.R., Tao L., Rose R.E., Friborg J., Colonno R.J.,
Doyle M.L. (2005), "Molecular basis for increased susceptibility of isolates
with atazanavir resistance-conferring substitution I50L to other protease
inhibitors", Antimicrob Agents Chemother, 49, pp. 3825-3832.
51. Zhang

W., Bevins

M.A., Plantz

B.A., Smith

L.A., Meagher

M.M.

(2000), "Modelling Pichia pastoris growth on methanol and optimising the
production of a recombinant protein, the heavy-chain fragment C of
botulinum neurotoxin, serotype A". Biotechnol Bioeng 70: 1–8.
52. Zhang W., Inan M., Meagher M. M. (2005), Fermentation strategies for
recombinant protein expression in the methylotrophic yeast P. pastoris,
Biotechnol. Bioprocess Eng, 5, pp. 275 – 28
53. />54. />55. />56. />
8 Page 18 of 128.
luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer