Xác Định Caffein trong một số loại cà phê bán trên thị trường bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA HÓA HỌC
---------***--------

BÁO CÁO
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
ĐỀ TÀI:
Xác Định Caffein trong một số loại cà phê bán trên thị
trường bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao
HPLC

Hà Nội, năm 2017

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên , em xin gửi lời cảm ơn đến cô Chu Ngọc Châu đã giao cho em đề tài
này . Cám ơn cô và thầy Chu Đình Bính đã tận tình hướng dẫn , hỗ trợ em trong suốt
thời gian nghiên cứu .


Em cũng xin cảm ơn các thầy cô , bạn bè ở phòng thí nghiệm bộ môn Hóa phân
tích đã giúp đỡ em trong quá trình làm nghiên cứu.
Một lần nữa em xin cảm ơn tất cả mọi người. Kính chúc các thầy cô và các bạn
và gia đình thật nhiều sức khỏe và hạnh phúc.
Sinh Viên
Lại Thị Thảo


MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ
DANH MỤC BẢNG BIỂU:

DANH MỤC HÌNH VẼ:


ĐẶT VẤN ĐỀ
Caffein là một hoạt chất có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kích thích hệ thần
kinh trung ương; kích thích hô hấp, tăng nhịp tim và lợi tiểu. Vì vậy caffein được sử dụng
nhiều trong y dược như một chất trợ tim. Nếu lạm dụng caffein sẽ dấn đến bị nghiện; sử
dụng thường xuyên sẽ gây mất ngủ. Khi dùng với liều cao có thể dẫn đến bị kích động
,hồi hộp, buồn nôn, tiêu chảy; với liều cao trên 1000mg có thể gây đột quỵ và tử vong .
Liều gây chết người là khi sử dụng 10g caffein. Do tính chất hai mặt này mà caffein
thường được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đưa ra những khuyến cáo khi sử dụng và liệt
kê vào những loại dược chất phải bán theo đơn.
Cà phê là loại cây được trồng khá phổ biến ở nước ta ; đặc biệt là các tỉnh miền núi
phía Bắc, các tỉnh Tây Nguyên. Trong những năm gần đây Việt Nam trở thành nước xuất
khẩu cà phê lớn thứ 2thế giới. Cà phê là một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực ,
góp phần thúc đẩy sự phát triển kinh tế của đất nước . Caffein có nhiều trong cà phê là
loại thức uống phổ biến nhất trên thế giới , có tác dụng tăng lưu thông máu , kích thích
thần kinh, tăng khả năng bài tiết rượu và các chất có hại khác như chất béo, nicotin ra
khỏi cơ thể.
Caffein là một trong sáu chỉ tiêu mà tiêu chuẩn Việt Nam 5251-90 dùng dể đánh
giá chất lượng sản phẩm cà phê . Chính vì vậy trong công trình này chúng tôi nghiên cứu
sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao để phân tích hàm lượng caffein trong một
số loại cà phê hiện đang được bán trên thị trường.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

(HPLC)
1.1.1. Giới thiệu
Sắc kí là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục của các cấu tử chất phân tích
lên hai pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha
tĩnh,một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái
lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương thức của phép sắc kí.Kỹ thuật
phân tích HPLC bao gồm hai nhóm: sắc kí lớp mỏng áp suất cao (HPTLC) và sắc kí
lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Trong nhóm HPLC, tùy theo bản chất của quá trình sắc kí của pha tĩnh trong cột
tách mà người ta chia thành:
o

Sắc kí phân bố (PC) của chất tan giữa hai pha không tan (trộn) vào nhau.

o

Sắc kí hấp phụ pha thường (NP-HPLC).

o

Sắc kíhấp phụ pha ngược hay pha đảo (RP- HPLC).

o

Sắc kí trao đổi ion (IEX-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC).

o

Sắc kí rây phân tử (FG-HPLC).

1.1.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC
Hệ thống trang bị của kỹ thuật HPLC, về cơ bản (đơn giản và đủ để làm việc
được theo kỹ thuật HPLC) bao gồm 5 bộ phận chính sau đây:
a. Bơm cao áp:
Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc kí, rửa giải chất tan ra
khỏi cột sắc kí. Bơm phải điều chỉnh được áp suất (0 – 400 bar) để tạo ra được những
tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc kí, phải có tốc độ
nằm trong vùng 0,5 – 3 ml/phút.
b. Van bơm mẫu:
Để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định không đổi
trong một quá trình sắc kí. Đó là các van 6 chiều có chứa vòng mẫu có thể tích xác định
6


(20, 50 hay 100µl).Van 6 chiều chỉ có một vòng mẫu, nhưng van 10 chiều thì có 3 vòng
mẫu.
c. Cột tách:
Cột tách là cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình tách sắc kí. Nó là một trong
những yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc kí của một hỗn hợp chất mẫu. Cột tách có
nhiều cỡ khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ sắc kí. Nói chung, các cột tách phân tích
thường có kích thước chiều dài từ 10 – 25 cm; đường kính trong thường từ 2 – 5 mm.
d. Bộ phận phát hiện chất phân tích:
Đây thường là các loại detector dựa theo các tính chất của chất phân tích. Một số
detector thông dụng như:
• Detector hấp thụ quang phân tử,vùng phổ UV-VIS.
• Detector nguyên tử phát xạ (AES) hay hấp thụ nguyên tứ (AAS).
• Detector huỳnh quang phân tử.
• Detector điện hoá (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng).
• Detector chiết suất.
• Detector đo độ dẫn nhiệt.

• Detector diode phát quang và diode mảng.
• Detector phổ khối lượng.
Tất nhiên phải tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợp để
đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng như khi định lượng chúng. Trong các
loại trên, thì detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS hiện nay đang
được dùng phổ biến nhất vì nó thích hợp cho nhiều loại chất và lại không quá đắt.
e. Bộ phận hiển thị kết quả:
Bộ phận hiển thị kết quả có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến nhất là các
máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dưới dạng các pic của các chất, rồi đến bộ tích
phân kế (intergrator), sau đó máy tính và máy in kèm theo để xử lý kết quả và in kết quả.

7


Đó là 5 bộ phận chính cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống máy HPLC.
Những hệ thống máy HPLC hoàn chỉnh, hiện đại, ngày nay còn có thêm:
− Bộ chương trình gradient dung môi (pha động).
− Bộ bơm mẫu tự động và pha loãng mẫu.
− Bộ gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho cột tách sắc kí.
− Máy tính và các chương trình (phần mềm) điều khiển toàn bộ hệ thống HPLC và
xử lý kết quả tách, in kết quả tách.

injector

Hình 1.1. Sơ đồ hệ thống HPLC
1.1.3. Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột
Trong quá trình sắc kí các phân tử chất tan luôn phân bố qua lại giữa hai pha trong
khi pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định. Mặt khác, do cấu trúc và
tính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của
mỗi chất tan là khác nhau trong quá trình di chuyển từ đầu cột đến cuối cột sắc kí. Khi ở

trong pha động, phân tử chất tan dịch chuyển theo tốc độ của pha động; khi ở trong pha
tĩnh, phân tử chất tan bị giữ lại. Như vậy sẽ có một thời gian nhất định chất tan bị lưu giữ
lại trong cột sắc kí. Vì vậy, trong quá trình sắc kí, có chất bị lưu giữ lâu trên cột, có chất
tan ít bị lưu giữ.
Quyết định hiệu quả của sự tách sắc kí ở đây là tổng của các mối tương tác:
8


 Giữa chất phân tích và pha tĩnh (F1).
 Giữa chất phân tích và pha động (F2).
 Giữa pha tĩnh và pha động (F3).

Hình 1.2. Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước.
Đối với mỗi chất,sự lưu giữ được qui định bởi ba lực F1, F2, F3. Trong đó F1 và F2 giữ
vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn. Ở đây F1 là lực giữ chất phân
tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy với
các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau. Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển
trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột (như hình dưới đây).

Hình 1.3. Quá trình tách sắc kí của các chất

9


1.1.4. Các đại lượng đặc trưng
1.1.4.1. Thời gian lưu
Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột sắc kí sẽ bị lưu giữ
ở trong cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định. Thời gian lưu là thời gian
tính từ lúc bắt đầubơm mẫu vào cột cho tới khi pic đạt giá trị cực đại. Như vậy nếu gọi

tRi là thời gian lưu tổng cộng của chất tan i thì chúng ta luôn có:
Trong đó:
+ là thời gian không lưu giữ ( thời gian chất tan nằm trong pha động )
+ là thời gian lưu giữ thực của chất i ở trong cột sắc kí (thời gian lưu hiệu chỉnh)
Nếu to = 0 thì ta sẽ có = . Trường hợp này chỉ có khi là rất nhỏ (thường là khi nhỏ
hơn 4 phút).

Hình 1.4. Thời gian lưu trong HPLC
Giá trị của một chất tan trong quá trình sắc kí là phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Ví
dụ như:
• Bản chất sắc kí của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp.
• Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
• Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế.
10


• Trong một số trường hợp còn phụ thuộc cả vào pH của pha động, nồng độ
chất tạo phức nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động
trong quá trình sắc kí.
Giá trị thời gian lưu t′Ri có ý nghĩa rất lớn trong thực tế của kỹ thuật sắc kí. Vì nó
cho ta biết các chất tan (chất phân tích) trong hỗn hợp mẫu được rửa giải ra như thế nào
trong các điều kiện thí nghiệm và một hệ pha đã chọn. Đồng thời đó cũng là đại lượng để
chúng ta phát hiện định tính một chất.
Mặt khác, trong một hệ sắc kí chúng ta còn có:
tRi = L/ui
(1.1)
to = L/u o
(1.2)
(1.3)
tRi = t o ( 1 + k′i )

Trong đó:
ui và uo là tốc độ tuyến tính của pha động;
k’i là hệ số dung lượng của chất tan i;
l là chiều dài của cột sắc kí.
1.1.4.2. Hệ số phân bố
Quá trình tách sắc kí của các chất là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất tan giữa
pha động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong quá trình sắc kí. Sự phân bố này được đặc trưng
bởi mộtđại lượng gọi là hệ số phân bố K i của chất i. Hệ số này được định nghĩa là tỷ số
nồng độ của chất tan i ở trong pha tĩnh và pha động và nó được tính theo công thức:

K =

CiSP
CiMP

(1.4)

Trong đó và là nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh và pha động, hệ số K i cho ta biết khả
năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha (pha động và pha tĩnh).
1.1.4.3. Hệ số dung lượng
Hệ số dung lượng k’cho ta biết tỷ số khối lượng của chất tan i phân bố vào trong
mỗi pha là bao nhiêu:

Mối quan hệ giữa hệ số dung tích k i′ và hệ số phân bố Ki thể hiện qua phương
11


trình sau:

v

ki′ = K i × s
vm

(1.6)

1.1.4.4. Hệ số tách α
Hệ số tách α (hay còn gọi là thời gian lưu tương đối của hai chất A và B) là đại
lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc kí. Nó phụ thuộc vào hệ số
phân bố và là tỉ số của hệ số phân bố của hai chất.

α=

K A k A′ t R′ A
=
=
K B k B′ t R′ B

(1.7)

Điều kiện cần thiết để hai chất A, B tách khỏi nhau là α ≠ 1
1.1.4.5. Số đĩa lý thuyết N
Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc kí, người ta dùng khái niệm
số đĩa N. Đây là một đại lượng, về hình thức, có thể coi mỗi đĩa trong cột sắc kí như là
một lớp chất nhồi có chiều cao (bề dày) là H. Tất nhiên đây là lớp có tính chất động, và bề
dày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố, như:
- Đường kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt tròn hay mảnh.
- Độ xốp, kích thước lỗ xốp của hạt pha tĩnh.
- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan (chất phân tích).
- Tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc kí.
- Độ nhớt của pha động.

Vì thế với một hệ nhất định và trong những điều kiện sắc kí đã chọn, thì chiều cao
H cũng có những giá trị xác định ứng với các chất tan. Chiều cao lí thuyết H và số đĩa lí
thuyết N được xác định theo công thức:
L W
H=  i
16  t Ri

2


÷
÷


(1.8)
12


2

 tR 
L
N=
= 16  i ÷
H
 Wi 

(1.9)

Trong đó Wi là chiều rộng đáy pic sắc kí và tRi là thời gian lưu của chất i.

Trong thực tế của quá trình sắc kí, thì số đĩa hiệu dụng Nef và chiều cao hiệu dụng
Hef của một cột sắc kí mới là đại lượng giúp ta đánh giá đúng được khả năng của một cột
tách và hiệu quả của nó là như thế nào, tốt hay không tốt trong mỗi trường hợp cụ thể.
2

L  wt 
H ef = 
÷
16  t Rt − t0 ÷


(1.10)
2

 t R − t0 
N ef = 16.  t
÷
 wt 

(1.11)

Nếu giá trị Nef là quá nhỏ thì không có sự tách tốt của các chất, hoặc sự tách
không hoàn toàn.Nhưng nếu Nef là quá lớn thì cũng không cần thiết. Vì khi đó pic sắc kí
của các chất tách xa nhau quá và việc rửa giải là tốn nhiều pha động.
1.1.4.6. Độ phân giải R
Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử khỏi nhau trong một phép sắc kí. Hai
cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để khi độ phân giải càng cao. Độ phân giải
được tính theo công thức sau:
RAB =

(

2 t RB − t RA

)

w B +w A

(1.12)

Nếu R càng lớn thì hai chất A và B càng tách ra xa nhau, khi này giữa hai pic sẽ có
một đoạn đường nền nằm ngang theo trục hoành của biểu đồ sắc kí. Song nếu đoạn đường
nền này dài quá thì cũng không cần thiết. Vì như thế ta tốn nhiều dung môi (pha động) để
rửa giải các chất hơn. Do đó giá trị R chỉ vừa đủ để tách hoàn toàn hai chất ra khỏi nhau
là tốt. Nghĩa là chỉ cần hai pic vừa tách ra khỏi hẳn nhau dứt khoát là được.

13


a)

b)

c)

Hình 1.5. Giản đồ về sự tách hai pic sắc A và B
a)

Tối thiểu để có sự tách.

b)

Đủ để hai chất tách khỏi nhau.

c)

Hai chất tách xa hẳn nhau.

1.1.4.7. Phương trình Van Deemter
Phương trình Van Deemter thể hiện mối quan hệ giữa chiều cao H của một đĩa và
tốc độ tuyến tính của pha động u. Phương trình Van Deemter được viết như sau:
H = A+

Trong đó:

B
+ (CS + CM )u
u

(1.13)

+ A: hệ số mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán xoáy đến H.

+

B: hệ số khuếch tán dài.

+

CS và CM: hệ số chuyển khối của pha tĩnh và pha động.

Nếu biểu thị các đường biểu diễn tổng cộng trong quan hệ của H với u thì chúng ta
có được đường cong Van Deemter.

14


Hình 1.6. Phương trình đường cong Van Deemter
Hệ số A phụ thuộc vào đường kính hạt nhồi d p trong pha tĩnh; cách chúng được
nhồi trong cột hoặc được phủ trên bản mỏng được biểu diễn qua λ (hệ số nạp cột) phụ
thuộc vào độ đồng thể của chất nhồi, dạng hình học và kích thước của cột:
A = 2.λ.dp

(1.14)

Hệ số B chỉ ra cho ta ảnh hưởng của hệ số khuếch tán D M của chất tan ở trong pha
động theo hướng chiều dài của cột.
B = 2γ. DM

(1.15)

Trong đó:
DM: hệ số khuyếch tán của chất tan ở trong pha động theo hướng chiều dài của cột
γ: hằng số đặc trưng cho sự khuếch tán trong một đơn vị thời gian và tr o ng
γ
đ iề u ki ệ n nạ p tố t th ì hầ u nh ư bằ ng 1.
H ệ s ố C t ỉ l ệ th uậ n vớ i tố c đ ộ ph a đ ộn g và ả nh h ư ở ng đá n g k ể đ ế n
đư ờ n g c on g H - u. H ệ s ố CM và CS được tính theo công thức sau:
2
CM = ϕ.(dp) / D M

(1.16)
C S = k . ρ2 / D S

(1.17)

15


Trong đó:
+ ϕ: một hệ số thực nghiệm, nó được quyết định bởi hệ số dung tích k i ’ của chất tan.
+ k: một hằng số phụ thuộc vào điều kiện nạp cột, và thường nhỏ hơn 2.
+ ρ:tỷ khối của pha tĩnh.
+ Ds: hệ số khuyếch tán của chất tan trong pha tĩnh.
Đường cong Van Deemter được dùng để xác định tốc độ pha động tối ưu u opt mà
tại tốc độ đó chiều cao đĩa H là nhỏ nhất nên hiệu quả tách là tốt nhất.
1.1.5. Định lượng bằng HPLC
1.1.5.1. Phương trình cơ bản để định lượng
Trong kỹ thuật HPLC, để định lượng một chất, người ta dựa theo hai phương
trình cơ bản sau đây về mối quan hệ giữa pic sắc kí (diện tích, hay chiều cao) của chất
với nồng độ C của chúng được bơm vào cột tách.
H = a.C + b

(1.17)

S = a.C+ b

(1.18)

Trong đó:
+ H : Chiều cao pic sắc kí của chất.

+ S : Diện tích pic sắc kí của chất.
Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật HPLC, chúng ta có thể dùng một
trong hai phương pháp chuẩn hoá là phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm
chuẩn.Việc chọn phương pháp nào là tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng
chất phân tích.
1.1.5.2. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả
Dựa trên (1.17) và (1.18) ta có thể xác định nồng độ các chất phân tích theo
phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn.
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê toán học với
các đặc trưng sau:
16


Giá trị trung bình:

1 n
x = ∑ xi
n i =1
n

s=

∑( x − x )
i =1

Độ lệch chuẩn:

2

n −1

SRD% =

Độ lệch chuẩn tương đối:

(1.19)

s
×100
x

(1.20)

(1.21)

1.2. Caffein [3, 4]
Tên chung quốc tế: Caffein.
Công thức phân tử: C8H10N4O2.
Nhóm dược lí: thuốc hướng tâm thần.
Dược lực:
Caffein là thuốc thuộc dẫn xuất xanthin được chiết
từ cà phê, ca cao hoặc được tổng hợp từ axit uric. Caffein
có tác dụng rõ trên thần kinh trung ương.
Dược động học:
Thuốc hấp thu nhanh qua đường uống và đường
tiêm. Thuốc đạt nồng độ tối đa tr huyết tương sau khi uống khoảng một giờ.
Thuốc phân bố rộng rãi trong cơ thể, qua nhau thai và sữa mẹ, thể tích phân bố 0,4
– 0,6 l/kg.
Chuyển hóa:
Thuốc chuyển hóa ở gan bằng phản ứng dimethyl và oxy hóa.

Thải trừ:
Thuốc thải trừ qua nước tiểu chủ yếu ở dạng đã chuyển hóa. Thời gian bán thải
khoảng 3 – 7 giờ, kéo dài ở trẻ sơ sinh và trẻ đẻ non.
Tác dụng:
17


Trên thần kinh trung ương:caffein kích thích ưu tiên trên vỏ não làm giảm các cảm
giác mệt mỏi, buồn ngủ; làm tăng hưng phấn vỏ não, tăng cảm nhận giác quan, do đó tăng
khả năng làm việc và làm việc minh mẫn hơn. Tuy nhiên, nếu sử dụng caffein liên tục và
kéo dài thì sau giai đoạn hưng phấn là ức chế. Với liều sử dụng cao, caffein tác dụng trên
toàn bộ hệ thần kinh trung ương gây co giật.
Trên hệ tuần hoàn: caffein kích thích làm tim đập nhanh, mạnh tăng lưu lượng tim
và lưu lượng mạch vành. Ở liều điều trị thuốc ít ảnh hưởng đến huyết áp.
Trên hệ hô hấp: kích thích trung tâm hô hấp, làm giãn phế quản và giãn mạch phổi.
Tác dụng này càng rõ khi trung tâm hô hấp bị ức chế.
Trên hệ tiêu hóa: gây táo bón, tăng tiết dịch vị, có thể gây loét dạ dày, tá tràng.
Trên cơ trơn: thuốc có tác dụng làm giãn cơ trơn mạch máu, mạch vành, cơ trơn
phế quản và cơ trơn tiêu hóa.
Trên thận: thuốc làm giãn mạch thận, tăng sức lọc cầu thận, giảm tái hấp thu Na
nên có tác dụng lợi tiểu, tuy nhiên tác dung lợi tiểu kém.

+

Nguyên nhân là do caffein ngăn cản phân hủy AMPv do ức chế cạnh tranh với
phosphodiesterase. Nồng độ AMPv tăng thúc đẩy các phản ứng làm tăng canxi nội bào,
tăng hoạt động của cơ tim, tăng chuyển hóa, tăng phân hủy lipid, tăng glucose trong máu.
Chỉ định:
Caffein được dùng trong các trường hợp kích thích thần kinh trung ương khi mệt
mỏi, suy nhược; suy hô hấp, tuần hoàn; hen phế quản.

Chống chỉ định:
Không dùng caffein với các trường hợp mẫn cảm với thuốc, suy mạch vành, nhồi
máu cơ tim, nhịp tim nhanh, ngoại tâm thu.
Liều lượng:
Ống tiêm: 1ml dung dịch 0,7%. Uống: 0,1 – 0,2 g/lần và 2 lần/ngày.
Quá liều:
Triệu chứng là mất ngủ, bồn chồn, kích thích nhẹ.

18


1.3. Các phương pháp phân tích caffein
Hàm lượng caffein có trong huyết thanh người và thức uống có cola đã được
Wenrui Jin và các cộng sự xác định bằng phương pháp điện di mao quảnvào năm 2000.
-4
Giới hạn phát hiện của caffein thu được là 2,9.10 mM và độ lệch chuẩn của thời gian
điện di và diện tích pic thu được của caffein lần lượt là 0,68% và 2,3% [7].
Năm 2000, Guzin Alpdogan, Kadir Karabina, Sidika Sungurg dùng phương pháp
phổ đạo hàm để xác định caffein trong các loại nước uống như cola, cà phê và trà, lấy
phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao được sử dụng làm phương pháp đối chiếu với
chương trình sắc kí sử dụng cột C18, hỗn hợp methanol: nước theo tỉ lệ thể tích 30:70
thu được pic sắc kí tại thời gian lưu là 5,14 phút. Kết quả thu được giới hạn phát hiện
của caffein với phương pháp trên là 2 μg/g; 1,5 μg/ml và 2 μg/g đối với trà, cola và cà
phê [8].

19


CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
1

Hóa chất, dụng cụ

2.1.1. Hóa chất
Chất chuẩn bao gồm: caffein dạng bột của Sigma-Aldrich
Dung môi: kênh B: Metanol độ tinh khiết > 99,9% của Merck, kênh C: acetonitrile
độ tinh khiết > 99,9% của Merck, kênh D:đệm pH=3 .
Hóa chất khác: Metanol độ tinh khiết > 99,9%.
2.1.2. Dụng cụ , thiết bị
Dụng cụ bao gồm: Pipet: 1, 2, 5, 10, 20ml, micro pipet 10-100µm, micro pipet
100- 1000µm và đầu côn, lọ đựng mẫu 2ml dùng cho máy chạy sắc ký, bình định mức: 5,
10, 50, 100ml, ống đong, phễu, giấy lọc.
Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu gồm: cân phân tích chính xác đến 0,0001g, máy
rung siêu âm, máy điều nhiệt, hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của hãng
Shimadzu, Nhật Bản gồm (Bộ loại khí dung môi, Degasser- DGU-14AM, van trộn dung
môi FCV- 10ALVP, bơm dung môi bốn kênh LC- 10ADVP, bộ ổn nhiệt cột tách CTO10 ASVP, van bơm mẫu với thể tích vòng mẫu 20µl, detector UV-Vis SPD-M10A VP, hệ
điều khiển SCL-10AVP, phầm mềm điều khiển và xử lý số liệu LCMS solution Ver 3, cột
sắc ký: LiChrospher 100 RP-18 (5µm)).
2.2. Thực nghiệm
2.2.1. Khảo sát điều kiện tối ưu
2.2.1.1. Chọn thể tích vòng mẫu
Độ chính xác, độ đúng và lượng mẫu cần thiết nạp vào cột tách không những phụ
thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào trong
cột.
Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi được thể
tích bơm mẫu vào cột.Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần làm chân pic sắc kí bị doãng
ra. Nếu vòng mẫu quá dài, lượng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tượng doãng pic xảy
ra càng lớn gây ra sự chen lấn pic trong quá trình tách.
Lượng mẫu được xác định bằng thể tích vòng chứa mẫu mà ta lựa chọn. Với thể
tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn V0 thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay

20


diện tích của pic sẽ tăng tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu = V0 mà tiếp tục tăng thể tích
mẫu thì chiều cao pic sắc kí cũng không tăng nữa và lúc đó pic sắc kí sẽ tù, doãng chân
và không sắc nét. Vì vậy việc lựa chọn thể tích vòng mẫu cũng rất quan trọng. Nếu độ
nhạy đủ để phân tích, thường dùng vòng mẫu có thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo nên pic
có độ sắc nét cao, tránh doãng pic. Trong phân tích HPLC người ta thường sử dụng các
vòng mẫu 10, 20, 30, 50 và 100 µl trong đó vòng mẫu 20 µl thường hay được sử dụng
nhất. Trong đề tài nghiên cứu này để phân caffein chúng tôi lựa chọn van bơm mẫu 6
chiều và thể tích vòng mẫu là 20 µl.
2.2.1.2. Chọn cột
Trong đề tài nghiên cứu này, caffein là chất rất ít phân cực và dựa vào dược điển
Mỹ USP 23, 24 quy định về chỉ tiêu phân tích định lượng các thành phần trong dược
phẩm, nên ta phải chọn các loại cột RP – HPLC. Trên thị trường có rất nhiều hãng sản
xuất cột sắc kí pha đảo C8 và C18. Tuy nhiên cột Brownlee RP – 18 của hãng Perkin
Elmer được sử dụng rộng rãi trong ngành kiểm nghiệm dược phẩm và được trang bị cho
hệ thống HPLC của phòng thí nghiệm của trường, cho thấy khả năng tách tốt, thời gian
lưu ngắn và được nhà sản xuất hỗ trợ về kỹ thuật nên chúng tôi chọn cột Brownlee RP –
18,5µm, 220 x 4,6mm cho phép định lượng này.
2.2.1.3. Khảo sát thành phần pha động
Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng lớn đến quá trình rửa giải
các chất mẫu ra khỏi cột. Trong phân tích HPLC, khái niệm lực rửa giải là đặc trưng cho
quá trình sắc kí. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của dung môi pha
động thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích qua đó làm thay
đổi hệ số lưu của chất phân tích đó. Vì vậy để có được tỷ lệ thành phần pha động phù hợp
cần tiến hành khảo sát hệ sắc kí với tỷ lệ thành phần pha động khác nhau với các điều
kiện sắc kí như nhau:
- Cột tách : RP – 18,5µm, 220x4,6 mm.
- Thể tích vòng mẫu: 20 μl.

- Tốc độ dòng: 1.2 ml/phút.
- Detector: 270nm

21


2.2.1.4. Khảo sát tốc độ pha động
Để khảo sát ảnh hưởng của tốc độ pha động, tiến hành khảo sát sự thay đổi
chiều cao pic sắc kí theo bước sóng của detector với điều kiện chạy sắc kí:
-Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm.
-Thể tích vòng mẫu: 20µl.
-Tốc độ dòng: 1.2 ml/phút.
-Detector: UV-VIS.
-Pha động: pha động đã khảo sát ở 2.2.1.3.
Tổng kết các điều kiện đã khảo sát suy ra điều kiện tối ưu để phân tích caffein.
2.2.2. Xác định Caffein
2.2.2.1. Xác định khoảng tuyến tính
Khoảng tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích. Một chất
chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nồng độ của
chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính.
Để khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ của caffein và diện tích pic sắc kí, ta
lần lượt pha các dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần trong dung môi pha động. Sau đó
tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 2.2.1, ghi giá trị
diện tích pic và dùng phần mềm Microsoft Excel xây dựng phương trình hồi quy mối
quan hệ giữa nồng độ C và diện tích pic Spic.
2.2.2.2. Phân tích một số loại cà phê trên thị trường
Chúng tôi tiến hành phân tích một số loại cà phê thông dụng được bán trên thị
trường và một số loại cà phê bán dạo , thông qua đó đánh giá chất lượng cà phê đặc
biệt là cà phê bán dạo.

22


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ- THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát điều kiện tối ưu
3.1.1. Khảo sát thành phần pha động
Để khảo sát thành phần pha động, tiến hành chạy chương trình sắc kí như mục
2.2.1.2 đã trình bày với sự thay đổi thành phần pha động. Dung dịch chất chuẩn của
caffein được pha loãng từ dung dịch gốc 206ppm. Thành phần dung môi pha động được
chọn để khảo sát là acetonitril và đệm pH=3 với các tỉ lệ thể tích khác nhau.
Kết quả sự phụ thuộc của thời gian lưu, chiều cao pic sắc kí vào thành phần pha
động được chỉ ra trong bảng 3.1 và hình 3.1.
270nm4nm (1.00)

270nm,4nm (1.00)

1.50

3.0

1.25

2.5

1.00

2.0

1.5

0.75

1.0

0.50

0.5

0.25

0.00

2.5

7.5

10.0

12.5

min

0.0

4.593

mAU(x100)

5.0

270nm4nm (1.00)

mAU(x100)

270nm4nm (1.00)

3.0

3.0

2.5

10.0

15.0

min

2.5

2.0

2.0

1.5

1.5

1.0

1.0

0.5

0.5

0.0

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

mAU(x100)

270nm4nm (1.00)

3.0

min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

min

3.232

0.0

5.0

3.943

0.0
0.0

5.718

mAU(x100)

2.831

mAU(x100)

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

min

Hình 3.1. Sắc kí đồ của caffein khi khảo sát pha động
a)10%ACN b 15%ACN c)20%ACN
23

d)25%ACN e)30% CAN


Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của thơi gian lưu, chiều cao pic sắc kí vào tỉ lệ của ACN

trong pha động
Caffein
% Acetonnitrin

Thời gian lưu (tR – phút)

Diện tích pic (S)

10

2.831

3148336

15

5.718

2878244

20

4.593

4129364

25

3.943

3414134

30

3.232

3144746

Nhìn vảo bảng 3.1 và pic sắc kí trong hình 3.1 nhận thấy với tỷ lệ ACN 15% chất
tách rõ ràng, pic sắc nét và thời gian rửa giải không quá nhanh cũng không quá chậm.
Tiến hành chạy sắc kí kiểm tra mẫu 09 theo chương trình sau :
 Cột tách: RP – 18, 5µm, 220 x 4,6 mm.
 Thể tích vòng mẫu: 20 μl.
 Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
 Detector: 270 nm
Do đó lựa chọn tỉ lệ pha động 15 % CAN/85% đệm để tiến hành phân tích caffein
3.1.2. Khảo sát tốc độ pha động
Sự ảnh hưởng của tốc độ pha động đến thời gian lưu và chiều cao pic sắc kí được
khảo sát bằng cách tiến hành chạy sắc kí mẫu 09 với các tốc độ khác nhau:
• 0,8 ml/phút.
• 1ml/phút.
• 1,2ml /phút.
• 1,4 ml/phút.
Các điều kiện còn lại của quá trình sắc kí không đổi, cụ thể như sau:
• Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm.
• Thể tích vòng mẫu: 20µl.
• Detector UV-VIS: 270 nm.
• Pha động: pha động đã khảo sát
24

Kết quả khảo sát tốc độ pha động được chỉ ra ở bảng 3.2 và hình 3.2
Bảng 3.2. Mối quan hệ giữa tốc độ pha động và diện tích pic
Tốc độ pha
Thời gian lưu
Diện tích pic
động u(ml/phút)
( tR)
(Sp)
0.8
8.532
4368170
1.0
7.874
2819241
1.2
5.718
2650101
1.4
4.797
2469137

Hình 3.2. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào tốc độ pha động Caffein
Theo đường cong Van Deemter, giá trị tốc độ tối ưu để hiệu quả tách là lớn nhất là
1,2 ml/phút.
Như vậy từ các khảo sát ở trên ta rút ra được điều kiện chạy tối ưu để phân tích
caffein như sau:
- Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm
-

Pha động : 15% ACN -85% H2O

-

Tốc độ pha động: 1,2 ml/phút.

-

Detectơ UV-VIS: λ = 270 nm.

-

Thể tích vòng mẫu : 20µl.
3.2. Phân tích mẫu caffein
3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính
Để khảo sát khoảng tuyến tính của caffein, ta tiến hành khảo sát dãy dung dịch
chuẩn có nồng độ tăng dần: 2.06 ppm; 5.17ppm;8.27ppm; 10.33 ppm; 15.50ppm; 20.60
ppm; 41.63ppm . Dãy dung dịch này được pha loãng từ dung dịch caffein gốc có nồng độ
206.0 ppm. Sau đó, tiến hành chạy sắc kí với từng dung dịch của mỗi dãy chuẩn theo
chương trình sắc kí sau:
- Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm

-

Pha động : 15%ACN/85%đệm
25