PHÁT HIỆN LAWSONIA INTRACELLULARIS TRÊN HEO BẰNG KỸ THUẬT NESTEDPCR Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ Thú y

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y
*************************

LÊ HUỲNH PHƯƠNG DUNG

PHÁT HIỆN LAWSONIA INTRACELLULARIS TRÊN HEO
BẰNG KỸ THUẬT NESTED-PCR

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ Thú y

Giáo viên hướng dẫn
TS. NGUYỄN ĐÌNH QUÁT
BSTY. PHÙNG HỮU PHƯỚC

Tháng 08/2012

i


XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
Họ và tên sinh viên thực tập: Lê Huỳnh Phương Dung.
Tên khóa luận tốt nghiệp: “Phát hiện Lawsonia intracellularis trên heo
bằng kỹ thuật nested-PCR”.
Đã hoàn thành khóa luận theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các
ý kiến nhận xét cũng như đóng góp của Hội đồng chấm thi tốt nghiệp 2007 - 2012
ngày 16 tháng 08 năm 2012.

Giáo viên hướng dẫn

TS. NGUYỄN ĐÌNH QUÁT

BSTY. PHÙNG HỮU PHƯỚC

ii


LỜI CẢM TẠ
Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến công ơn sinh thành, dưỡng dục và hy
sinh của Ba Mẹ đã tận tụy lo cho con đến ngày hôm nay, cùng những người thân
luôn yêu thương, giúp đỡ và động viên con trong những năm qua.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
TS. Nguyễn Đình Quát và BSTY. Phùng Hữu Phước đã hết lòng giảng dạy,
hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo tôi suốt thời gian thực tập và hoàng thành luận văn tốt
nghiệp.
Luôn ghi nhớ và cảm ơn
Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Ban chủ nhiệm khoa Chăn Nuôi Thú Y cùng toàn thể quý thầy cô đã tận tình
dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua.
Xin chân thành cảm ơn
Ban giám đốc và các anh chị Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm
TP. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt
quá trình tực tập tốt nghiệp.
Cảm ơn tập thể lớp DH07TY đã cùng chung sức và giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp.
Sinh viên
Lê Huỳnh Phương Dung

iii

TÓM TẮT KHÓA LUẬN
Luận văn “Phát hiện Lawsonia intracellularis trên heo bằng kỹ thuật nestedPCR”.
Thời gian thực hiện từ ngày 01/02/2012 đến ngày 15/07/2012 tại Bệnh Viện
Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Mục đích: Xác nhận sự hiện diện của Lawsonia intracellularis trên heo sau
cai sữa đến hạ thịt được mổ khám tại Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm
Tp. Hồ Chí Minh để có thêm thông tin về dịch bệnh.
Phương pháp nghiên cứu : chúng tôi tiến hành thu thập được 144 mẫu bệnh
phẩm (gồm 45 mẫu ruột và 99 mẫu phân) từ những heo bị tiêu chảy nghi do
Lawsonia intracellularis.
Kết quả thu được như sau :
Triệu chứng lâm sàng : biếng ăn, chậm tăng trưởng trong nhiều tuần, tiêu
chảy, phân hơi lỏng có màu như bột xi măng ướt. Bệnh tích đại thể gồm có biểu mô
tăng sinh và sưng dày, viêm nhẹ trên bề mặt niêm mạc. Bệnh tích vi thể có sự thoái
hóa của lông nhung, bề mặt niêm mạc hồi tràng thoái hóa, fibrin bao phủ hồi tràng.
Quy trình nested-PCR đã được tối ưu hóa :
(1)

94 0C : 5 phút

(2)

94 0C : 45 giây
57 0C : 45 giây

x 35 chu kỳ

72 0C : 30 giây
(3)

72 0C : 10 phút

Tỷ lệ mẫu phân và mẫu ruột dương tính với L. intracellularis bằng kỹ thuật
nested-PCR tương ứng là 34,34 % và 37,78 %.

iv


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa ..................................................................................................................... i
Xác nhận của giáo viên hướng dẫn ............................................................................ ii
Lời cảm tạ.................................................................................................................. iii
Tóm tắt ...................................................................................................................... iv
Mục lục........................................................................................................................v
Danh sách các chữ viết tắt ....................................................................................... viii
Danh sách các bảng ................................................................................................... ix
Danh sách các hình......................................................................................................x
Chương 1 MỞ ĐẦU ..................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2 Mục đích và yêu cầu .............................................................................................2
1.2.1 Mục đích.............................................................................................................2
1.2.2 Yêu cầu...............................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN ..........................................................................................3
2.1 Bệnh tăng sinh đường ruột (Proliferative enteropathy-PE; Ileitis) .......................3
2.1.1 Khái niệm ...........................................................................................................3
2.1.2 Lịch sử và nguyên nhân gây bệnh ......................................................................3
2.1.3 Căn bệnh.............................................................................................................4
2.1.4 Truyền nhiễm học ..............................................................................................5

2.1.5 Triệu chứng ........................................................................................................6
2.1.6 Bệnh tích ............................................................................................................7
2.1.7 Chẩn đoán...........................................................................................................9
2.1.8 Điều trị ...............................................................................................................9
2.1.9 Phòng bệnh .......................................................................................................10
2.2 Giới thiệu về kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .................................10
2.2.1 Khái niệm kỹ thuật PCR ..................................................................................10

v


2.2.2 Lịch sử ..............................................................................................................10
2.2.3 Nguyên tắc của phương pháp PCR ..................................................................11
2.2.4 Primer (đoạn mồi) ............................................................................................12
2.2.5 Thành phần cơ bản của phản ứng PCR ............................................................13
2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR .......................................................14
2.2.7 Các hạn chế của PCR .......................................................................................16
2.2.8 Giá trị sử dụng của PCR...................................................................................16
2.3 Giới thiệu về kỹ thuật nested-PCR (nPCR) ........................................................17
Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................18
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu.......................................................................18
3.1.1 Thời gian ..........................................................................................................18
3.1.2 Địa điểm ...........................................................................................................18
3.2 Đối tượng khảo sát ..............................................................................................18
3.3 Nội dung thực hiện ..............................................................................................18
3.4 Vật liệu, nguyên liệu và hóa chất thí nghiệm ......................................................18
3.4.1 Vật liệu .............................................................................................................18
3.4.2 Nguyên liệu dùng cho phản ứng nested-PCR ..................................................19
3.4.3 Hóa chất ...........................................................................................................19
3.5 Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................20

3.5.1 Số mẫu khảo sát ...............................................................................................20
3.5.2 Phương pháp ghi nhận triệu chứng lâm sàng ...................................................21
3.5.3 Phương pháp ghi nhận bệnh tích đại thể ..........................................................21
3.5.4 Quy trình cắt mẫu vi thể ...................................................................................21
3.5.5 Thiết kế kỹ thuật nested – PCR để phát hiện L. intracellularis. ......................23
3.5.5.1 Quy trình tách chiết DNA theo bộ Kit Wizard® Genomic DNA Purification
Kit (Promega, Mỹ). ........................................................................................23
3.5.5.2 Quy trình thực hiện nested-PCR đối với L. intracellularis...........................25
3.6 Công thức tính .....................................................................................................27
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................28

vi


4.1 Triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể và vi thể bệnh do L. intracellularis ....28
4.1.1 Triệu chứng lâm sàng .......................................................................................28
4.1.2 Bệnh tích đại thể...............................................................................................30
4.1.3 Bệnh tích vi thể ................................................................................................31
4.2 Xây dựng quy trình kỹ thuật nested-PCR để phát hiện L. intracellularis ..........34
4.3 Tỷ lệ mẫu dương tính với L. intracellularis bằng kỹ thuật nested-PCR.............37
4.3.1 Tỷ lệ mẫu dương tính với L. intracellularis trên tổng số mẫu khảo sát ..........37
4.3.2 Tỷ mẫu dương tính với L. intracellularis tại Bệnh Viện Thú Y ......................37
4.3.3 Tỷ mẫu dương tính L. intracellularis trên ổ dịch PRRS ..................................39
4.3.4 Tỷ lệ mẫu dương tính với L. intracellularis ở địa bàn khác ............................40
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................42
5.1 Kết luận ...............................................................................................................42
5.2 Đề nghị ................................................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................43
PHỤ LỤC .................................................................................................................47

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
PE

Proliferative enteropathy

NE

Necrotic enteritis

PIA

Porcine intestinal adenomatosis

PHE

Proliferative hemorrhagic enteropathy

Nested-PCR

Nested-Polymerase Chain Reaction

PRRS

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

IEC-18

rat intestinal cells

PK

Pig Kidney

IPEC-J2

Piglet intestinal epithelial cells-J2

IS

Lleal Symbiont

E. coli

Escherichia coli

McCoy

Mouse fibroblast cells

HBS

Hemolytic Bowel Syndrome

PCV2

Porcine Circovirus 2

TGE

Transmissible Gastroenteritis

ELISA

Enzyme Linked Immunosorbent Assay

DNA

Deoxyribonucleic acid

cDNA

complementary Deoxyribonucleic acid

ATP

Adenosin triphosphat

EDTA

Ethylene diamine tetra acetic acid

dATP

dexoxyadenosine triphosphate

dCTP

dexoxycytosine triphosphate

dGTP

dexoxyguanosine triphosphate

dTTP

dexoxythimine triphosphate

dNTPs

deoxynucleoside triphosphate

Kp

Kilo base

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Số mẫu khảo sát tại Bệnh Viện Thú Y ......................................................20 
Bảng 3.2 Số mẫu khảo sát tại các địa bàn khác ........................................................20 
Bảng 3.3 Số mẫu khảo sát tại 2 ổ dịch PRRS ...........................................................20 
Bảng 3.4 Tên các đoạn mồi .......................................................................................25 
Bảng 4.1 Triệu chứng lâm sàng của các heo bị tiêu chảy nghi do L. intracellularis.
........................................................................................................................28 
Bảng 4.2 Bệnh tích đại thể. .......................................................................................30 

Bảng 4.3 Bệnh tích vi thể. .........................................................................................31 
Bảng 4.4 Kết quả chẩn đoán tổng số mẫu khảo sát bằng kỹ thuật nested-PCR........37 
Bảng 4.5 Kết quả chẩn đoán mẫu ruột bằng kỹ thuật nested-PCR tại Bệnh Viện Thú
Y .....................................................................................................................37 
Bảng 4.6 Kết quả chẩn đoán mẫu phân bằng kỹ thuật nested-PCR tại Bệnh Viện
Thú Y .............................................................................................................37 
Bảng 4.7 Kết quả chẩn đoán mẫu ruột bằng kỹ thuật nested-PCR ...........................39 
Bảng 4.8 Kết quả chẩn đoán mẫu phân bằng kỹ thuật nested-PCR tại các địa bàn
khác ................................................................................................................40 
Bảng 4.9 Kết quả chẩn đoán mẫu ruột bằng kỹ thuật nested-PCR tại các địa bàn
khác ................................................................................................................40 

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Ruột chứa máu tươi hay cục máu.................................................................8 
Hình 2.2 Sự tăng sinh của biểu mô .............................................................................8 
Hình 4.1 Triệu chứng lâm sàng của heo bị tiêu chảy nghi do L. intracellularis ......29 
Hình 4.2 Màu phân heo bị tiêu chảy nghi do L. intracellularis ................................29 
Hình 4.3 Đoạn hồi tràng dày lên

Hình 4.4 Niêm mạc ruột tăng sinh ...............30 

Hình 4.5 Viêm hồi tràng, lông nhung thoái hóa và có vài đốm xuất huyết (100X). 32 
Hình 4.6 Một vài tế bào vi khuẩn nằm trong tế bào chất của tế bào biểu mô trong
mào ruột (1000X). ..........................................................................................32 
Hình 4.7 Tiết chất viêm có nhiều bạch cầu che phủ niêm mạc, lông nhung hư hại
nhẹ (200X). ....................................................................................................33 

Hình 4.8 Viêm hồi tràng có tiết chất sợi huyết, nhiều bạch cầu. Có lớp hoại tử bao
phủ bề mặt (200X). ........................................................................................33 
Hình 4.9 Kết quả chẩn đoán L. intracellularis bằng kỹ thuật PCR thông thường ....34 
Hình 4.10 Kết quả nested-PCR chạy thử nghiệm nhiệt độ annealing ở 54 0C .........35 
Hình 4.11 Kết quả nested-PCR chạy thử nghiệm nhiệt độ annealing ở 51 0C .........35 
Hình 4.12 Kết quả nested-PCR chạy thử nghiệm nhiệt độ annealing ở 48 0C .........36 
Hình 4.13 Kết quả chạy thử nghiệm nhiệt độ annealing ở 57 0C..............................36 
Hình 4.14 Kết quả chẩn đoán L. intracellularis bằng kỹ thuật nested-PCR tại Bệnh
Viện Thú Y. (Ghi chú: L = ladder. Các mẫu 1 đến 10 các mẫu tại Bệnh Viện
Thú Y dương tính với L. Intracellularis. .......................................................38 
Hình 4.15 Kết quả chẩn đoán L. intracellularis bằng kỹ thuật nested-PCR tại ổ dịch
PRRS. ( Ghi chú: L = Ladder. Các mẫu 1, 2 dương tính tại ổ dịch PRRS) ...39 
Hình 4.16 Kết quả chẩn đoán L. intracellularis bằng kỹ thuật nested-PCR tại trại
khác. (Ghi chú: L = ladder; các mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11 dương tính;
mẫu 6 âm tính) ...............................................................................................41 

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Việt Nam là một nước có nền nông nghiệp phát triển trong đó ngành chăn
nuôi nói chung và chăn nuôi heo nói riêng chiếm một vị trí rất quan trọng trong nền
kinh tế. Ngày nay nhiều thành tựu khoa học kỹ thuật đã được ứng dụng rộng rãi
trong chăn nuôi heo giúp nâng cao năng suất cũng như chất lượng thịt heo một cách
đáng kể. Tuy nhiên, bên cạnh những thành tựu đạt được ngành chăn nuôi heo vẫn
còn gặp phải nhiều khó khăn trong công tác phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh.
Một trong những bệnh ảnh hưởng đến năng suất chăn nuôi heo là bệnh tiêu
chảy. Tiêu chảy là bệnh xảy ra phổ biến trên heo, bệnh xảy ra trên heo ở mọi lứa

tuổi, nhưng trầm trọng ở giai đoạn heo cai sữa do heo mới sinh ra hệ vi sinh vật
đường ruột và hệ thống miễn dịch của heo con phát triển chưa toàn diện. Hậu quả
làm chết heo, làm giảm khả năng tăng trưởng, tăng tỷ lệ còi cọc và gây tổn thất về
kinh tế cho các nhà chăn nuôi. Có nhiều nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chảy như
thời tiết thay đổi đột ngột, vệ sinh chăm sóc kém, do heo mẹ mắc bệnh trong thời
gian mang thai và sau khi sinh, do hệ vi sinh vật đường ruột gây bệnh, do vi khuẩn,
do cầu trùng, virus… Trong những nguyên nhân kể trên thì tiêu chảy do vi khuẩn
nội bào Lawsonia intracellularis gây ra là một bệnh đang được quan tâm nghiên
cứu hiện nay.
Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu tìm hiểu về tình
hình lây nhiễm và ảnh hưởng của Lawsonia intracellularis trên heo, nhưng ở Việt
Nam chưa có công trình nghiên cứu nào báo cáo về tình hình lây nhiễm cũng như
ảnh hưởng của Lawsonia intracellularis được công bố. Vậy Lawsonia

1


intracellularis đã xuất hiện ở Việt Nam chưa? Tỷ lệ lây nhiễm là bao nhiêu? Ảnh
hưởng của nó đến đàn heo như thế nào ?... Xuất phát từ thực tế trên , được sự đồng
ý của Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, dưới
sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Đình Quát và BSTY Phùng Hữu Phước chúng tôi
tiến hành thực hiện đề tài “Phát hiện Lawsonia intracellularis trên heo bằng kỹ
thuật nested-PCR”.
1.2 Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Thiết kế kỹ thuật nested-PCR để xác định sự hiện diện của Lawsonia
intracellularis trên heo sau cai sữa đến hạ thịt được mổ khám tại Bệnh Viện Thú Y
Trường ĐH Nông Lâm Tp. HCM để giúp ích cho công tác chẩn đoán bệnh.
1.2.2 Yêu cầu
Ghi nhận triệu chứng lâm sàng của các heo bị bệnh tiêu chảy nghi do

Lawsonia intracellularis được mổ khám tại Bệnh Viện Thú Y Trường ĐH Nông
Lâm Tp.HCM.
Khảo sát bệnh tích đại thể của các heo bị tiêu chảy nghi do Lawsonia
intracellularis được mổ khám.
Lấy mẫu phân và mẫu ruột trên những heo bị tiêu chảy nghi do Lawsonia
intracellularis được mổ khám.
Cắt mẫu vi thể các mẫu ruột lấy từ những heo được mổ khám.
Thử nghiệm quy trình nested-PCR để phát hiện Lawsonia intracellularis.

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Bệnh tăng sinh đường ruột (Proliferative enteropathy-PE; Ileitis)
2.1.1 Khái niệm
Là bệnh truyền nhiễm trên heo do vi khuẩn nội bào bắt buộc Lawsonia
intracellularis (L. intracellularis) gây nên biểu hiện bằng sự dày lên của niêm mạc
ruột non và thỉnh thoảng ở ruột già (Rowland và Lawson, 1992). Heo mắc bệnh có
vẻ nhợt nhạt, chậm tăng trưởng, tiêu chảy, ruột bị hoại tử (NE), viêm hạch ruột của
heo (PIA) và làm xuất huyết tăng sinh ở ruột (PHE) (Lawson và Gebhart, 2000).
2.1.2 Lịch sử và nguyên nhân gây bệnh
Bệnh xảy ra và ảnh hưởng đến hệ thống chăn nuôi heo trên toàn thế giới, đặc
biệt trong đàn gia súc khỏe, ảnh hưởng đến heo sau cai sữa, heo lứa, heo gần xuất
chuồng, heo hậu bị (Lawson và Gebhart, 2000).
PE được mô tả như là một bệnh đường ruột quan trọng trên heo cách đây hơn
70 năm. Những đặc trưng của PE tìm thấy ở heo được mô tả đầu tiên bởi Beister và
Schwarte vào năm 1931 (Beister H và Schwarte L, 1931).
Cho đến thập niên 1970 vi khuẩn nội bào được tìm thấy bên trong những tế
bào hẻm tuyến (crypt cells) đang tăng sinh trong những trường hợp PHE ở heo

(Rowland và ctv, 1973). Một số loài Campylobacter có đặc tính hình thái tương tự
L. intracellularis được phân lập từ những bệnh tích của PE. Những loài đó bao gồm
Campylobacter mucosalis, C. hyointestinalis, C. jejuni and C. coli. Tuy nhiên ,
những loài vi khuẩn Campylobacter này không gây bệnh tích PE đặc hiệu khi gây
bệnh thực nghiệm (Kashiwazaki và ctv, 1971; McCartney và ctv, 1984).
Đầu tiên các nhà khoa học đặt tên là vi khuẩn giống Campylobacter. Sau đó

3


vi khuẩn nội bào được đưa tên là Lleal Symbiont (IS) intracellularis và được coi
như là một loài riêng biệt khác với loài Campylobacter (Gebhart và ctv, 1993). Tên
L. intracellularis được đặt cho sinh vật một cách trang trọng vào năm 1995 trong
vinh dự của nhà khoa học người Scottish, Lawson là người khám ra vi khuẩn này.
2.1.3 Căn bệnh
Phân loại
L. intracellularis là một vi khuẩn nội bào bắt buộc gây ra bệnh tăng sinh
đường ruột ở nhiều loài động vật có vú, đặc biệt là heo (Lawson và Gebhart, 2000).
L. intracellularis là một thành viên của nhóm delta của Proteobacteria
(Gebhart và ctv 1993) và phân biệt rõ ràng từ những tác nhân gây bệnh trong tế bào
khác (McOrist và ctv, 1995a).
Đặc điểm hình thái, cấu trúc
L. intracellularis là vi khuẩn Gram (-), vi hiếu khí, sống nội bào bắt buộc,
không có lông roi, không tạo bào tử, hình thái cong hoặc que dạng chữ S (Lawson
và ctv, 1993).
Vi khuẩn dài 1,25 - 1,75 µm và rộng 0,25 - 0,43 µm, không có chiên mao và
không bào tử. (Lawson và Gebhart, 2000).
Toàn bộ hệ gen mới đây đã được giải trình tự tại đại học Minnesota và chứa
xấp xỉ 1,46 Mb. (Gebhart và Kapur, 2003).
Đặc điểm nuôi cấy

Hiện tại, sự phát triển của L. intracellularis trong môi trường nuôi cấy thông
thường hay môi trường canh vẫn chưa thành công. Bởi vậy, sự nuôi cấy vi khuẩn
này chỉ phát triển trên tế bào nhân thật chuyên biệt bao gồm tế bào biểu mô ruột của
chuột (IEC-18), tế bào ruột thai người (Int 407), tế bào thận heo (PK-15) (Lawson
và ctv, 1993), tế bào biểu bì ruột heo con (IPEC-J2) (McOrist và ctv, 1995a).
Môi trường thích hợp dùng cho nuôi cấy vi khuẩn L. intracellularis trên tế
bào là DMEM với sự bổ sung 5 - 10 % huyết thanh bò.

4


2.1.4 Truyền nhiễm học
Loài vật mắc bệnh
PE thường được tìm thấy nhiều nhất ở lợn, tuy nhiên nó cũng được mô tả ở
chuột bạch (Frisk và Wagner, 1977), chồn (Fox và Lawson, 1988), thỏ (Fox và ctv,
1994), cáo (Eriksen và Landsverk, 1985), chó (Collins và ctv, 1983), chuột
Vandenburghe và ctv, 1985), ngựa (Williams và ctv, 1996), cừu (Chalmers và ctv,
1990), hưu, nai (Drolet và ctv, 1996), đà điểu sa mạc Úc (LeMarchand và ctv,
1995), đà điểu Châu Phi (Cooper và ctv, 1997), linh trưởng (Klein và ctv, 1999),
chuột lang (Elwell và ctv, 1981).
Mặc dù có mặt ở khắp nơi trong thiên nhiên, L. intracellularis chưa bao giờ
được phát hiện ở người trong các bệnh đường ruột. Bởi vậy mà L. intracellularis
gây bệnh PE không được xem là một bệnh truyền lây từ động vật sang người
(McOrist và ctv, 2003).
Cách sinh bệnh
Theo Phạm Ngọc Thạch: vi khuẩn có thể sinh sản trong tế bào 7 - 14 ngày và
có thể tồn tại bên ngoài tế bào cho đến hai tuần trong điều kiện 5 0C nhưng không
thể nhân lên. Vi khuẩn thuần tự nhiên có thể gây ra tất cả các thể bệnh. Vi khuẩn
xâm nhập các tế bào màng ruột non, thông thường là phần cuối của ruột non và đôi
khi ở ruột già, nhân lên, tạo ra các tế bào non, chưa trưởng thành xuất hiện ra bên

ngoài, làm mất khả năng hấp thu của các lông nhung và khuyến khích các hố ngăn
cách dài ra, do đó làm cho niêm mạc ruột không thể hấp thụ, làm cho tại các khu
vực bị nhiễm bệnh dày lên và có nhiều chỗ sưng lên. Viêm xảy ra làm mất máu và
các tế bào biểu bì của ruột non bị nhiễm bệnh. Như vậy để bù lại cho niêm mạc ruột
non, màng nhầy dày lên và có thể bị phá vỡ và trở thành hoại tử như trong bệnh
viêm ruột hoại tử, cuối cùng dẫn đến tăng sinh của lớp cơ bên dưới trong khu vực
ruột bị tăng sinh. Việc phá vỡ nhanh có thể gây ra mất máu lớn đổ vào hồi tràng gây
ra hiện tượng xuất huyết tăng sinh đường ruột (PHE). Những con heo còn lại sẽ
miễn dịch với bệnh (Trích dẫn: Bệnh viêm ruột hoại tử ở heo, Phạm Ngọc Thạch,
2011).

5


2.1.5 Triệu chứng
Triệu chứng lâm sàng thường thấy trong thời gian gần đây ở heo cai sữa và
kéo dài đến khoảng 6 tuần, có thời gian ủ bệnh 3 - 6 tuần và có thể gây bệnh cho gia
súc ở mọi lứa tuổi. Các triệu chứng đầu tiên là không tăng cân hoặc giảm trọng
lượng, do heo kém ăn. Heo bệnh có vẻ nhợt nhạt, có thể nôn mửa, thiếu máu và có thể
có phân đen do sự hiện diện của máu bị đổi thành màu đen. Một số con heo trong phân
có hạt lợn cợn, chúng phân bố đều khắp đặc biệt giống như bột xi măng ướt, đặc biệt là
nơi nhiễm trùng thấy có xoắn khuẩn hiện diện. Sau 4 - 6 tuần bị ảnh hưởng heo có thể
hồi phục hoàn toàn. Một số chết đột ngột ở giai đoạn này với hiện tượng ruột bị
tăng sinh và xuất huyết nhanh. Thông thường heo bị nhợt nhạt, nhiệt độ cơ thể thấp
(37,8 0C, 100 0F) 1 - 2 giờ trước khi chết và có thể thấy ở mọi lứa tuổi 6 - 10 tuần
trở lên. Trên những đàn giống, heo có thể chết bất ngờ khi thể xuất huyết tăng sinh
(PHE) xâm nhập vào đàn. Đàn mới bị nhiễm, có thể 12 % đàn bị mắc bệnh và 6 %
có thể chết. Một số con hồi phục vẫn còi cọc. Chúng có thể biểu hiện ốm, xanh và
có thể có tiêu chảy (Rowland và Lawson, 1992).
Những trường hợp lâm sàng PIA được nhận thấy ở những con heo sau cai

sữa giữa 6 và 20 tuần tuổi. Những dấu hiệu nổi bật của PIA bao gồm chứng biếng
ăn, tiêu chảy và chậm tăng trưởng kéo dài trong nhiều tuần. Tiêu chảy có thể xuất
hiện khi bệnh tích đặc trưng hiện diện, làm cho thể bệnh này của PE rất khó phát
hiện. Trong những thể gây dịch địa phương PIA, heo sẽ ăn uống bình thường nhưng
chậm tăng trưởng. Những con heo nhiễm trùng nghiêm trọng thường liên quan đến
sự dày lên niêm mạc hồi tràng ở các mức độ khác nhau hay những bệnh tích hoại tử
của ruột non (McOrist và Gebhart, 1999).
Những thể bệnh PHE thường xảy ra ở lợn trưởng thành giữa 4 - 12 tháng
tuổi. Phân đen giống hắc ín là dấu hiệu lâm sàng phổ biến đầu tiên; sau đó thì tiêu
chảy, phân lỏng, màu hơi đỏ. Tuy nhiên một số heo chết mà không có sự bất thường
nào về phân. Ước lượng rằng khoảng 50 % heo trong đàn chết khi nhiễm thể PHE,
nhưng một nửa còn lại sẽ phục hồi sau một thời gian ngắn mà không có những dấu

6


hiệu rõ ràng của giảm trọng lượng hay dấu hiệu bất thường của thể trạng (McOrist
và Gebhart, 1999).
Thể PE cận lâm sàng có thể là bệnh phổ biến nhất ở lợn đang tăng trưởng,
nhưng khó nhận biết vì không có những dấu hiệu lâm sàng đặc trưng. Các kỹ thuật
về huyết thanh học hay PCR có thể có hoặc có thể không phát hiện L. intracellularis
trong thể PE cận lâm sàn (Rowland và Lawson, 1992).
Có một số bệnh trên đường ruột ở heo mà có dấu hiệu lâm sàng tương tự như
các thể khác nhau của PE như hôi chứng ruột xuất huyết (HSB), bệnh do khuẩn E.
coli, bệnh Circovirus type 2 (PCV2), chứng viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE),
bệnh do Rotavirus, bệnh thương hàn heo và bệnh hồng lỵ heo (Rowland và Lawson,
1992).
Bởi vậy, để phân biệt được các tác nhân gây bệnh này thì điều quan trọng là
phải mổ khám để kiểm tra bệnh tích, kết hợp với tiến hành những phương pháp
chẩn đoán thích hợp khác để cho kết quả chẩn đoán chính xác hơn.

2.1.6 Bệnh tích
Những bệnh tích mô bệnh học phổ biến đối với các thể bệnh PE là sự tăng
nhanh u tuyến của biểu mô trong những tế bào hẻm tuyến của ruột non và trong
những tuyến nhày của ruột già và bởi sự có mặt của vi khuẩn bên trong những tế
bào ruột này. Những tế bào hẻm tuyến giãn rộng và kéo dài, chung hàng với những
tế bào biểu mô chưa trưởng thành trong giai đoạn gián phân. Những tế bào hình ly
thì biến mất trên những tế bào biểu mô bị nhiễm không phải là một bệnh tích phổ
biến của PE (McOrist và Gebhart, 1999).
PHE là thể cấp tính của PE gây bệnh tích đặc trưng ở đoạn cuối hồi tràng và
kết tràng. Dạng này của PE thường xảy ra trên heo trưởng thành từ 4-12 tháng tuổi
và thường được tìm thấy trong những đàn khỏe khi những heo hậu bị được nhập từ
ngoài vào. Những bệnh tích của PHE bao gồm ruột sưng và tích dịch (McOrist và
Gebhart, 1999).
Ruột chứa máu tươi hay máu cục đông đặc và những cụm fibrin (Hình 2.1).
Tuy nhiên không thấy sự viêm loét hay bào mòn biểu mô ruột (Ward và

7


Winkelman, 1990).

Hình 2.1 Ruột chứa máu tươi hay cục máu (Ward và Winkelman, 1990)
PIA là thể mãn tính và phổ biến nhất của PE. Dạng này của PE thì thường
được tìm thấy trên những heo sau cai sữa đến xuất chuồng và gây bệnh ở 50 cm
phần cuối của hồi tràng đoạn nối với kết tràng (McOrist và Gebhart, 1999).
Những bệnh tích của PIA gồm có biểu mô tăng sinh và sưng dày, viêm nhẹ
trên bề mặt niêm mạc (Hình 2.2) (Knittel, 1999).

Hình 2.2 Sự tăng sinh của biểu mô (Knittel, 1999)
Bệnh tích vi thể cho thấy rằng màng nhày được mở rộng với những tế bào

hẻm tuyến rẽ nhánh chung với những tế bào biểu bì chưa trưởng thành. Những tế
bào hẻm tuyến được kéo dài và mở rộng, được lót thêm những tế bào biểu bì chưa
trưởng thành dày đặc. Fibrin bao phủ quanh hồi tràng. Sự tụ lại và thoái hóa lông
nhung được nhận diện ở hồi tràng. Phát hiện vi khuẩn bên trong tế bào là một đặc

8


tính phổ biến (McOrist và Gebhart, 1999).
2.1.7 Chẩn đoán
Chẩn đoán lâm sàng
Bệnh tăng sinh đường ruột cần được xem xét nếu heo đang phát triển trở
thành nhợt nhạt, giảm cân với tình trạng phân đen ở những con heo hiện diện trong
chuồng lâu ngày, các dấu hiệu này và những cái chết bất ngờ từ bệnh viêm ruột xuất
huyết tăng sinh nhanh, nhưng cũng có thể là do viêm loét dạ dày. Bệnh tiêu chảy
hoặc phân lỏng không phải là một chỉ báo đáng tin cậy của bệnh nhưng thường xảy
ra. Bệnh tăng sinh đường ruột có thể được xác nhận sau khi mổ khám heo bị nhiễm.
Phần cuối của hồi tràng dày, nhợt và nó làm lớp đệm bên dưới ảnh hưởng hạn chế
nếp gấp. Các phần của ruột già cũng có thể bị ảnh hưởng. Có thể các cục máu bị
đông trong ruột và máu đen này xuất hiện khi nó đến ruột già (PHE). Không có hiện
tượng loét dạ dày. Màng ruột bị bệnh có thể được phủ bằng các mô chết (Rowland
và Lawson, 1992).
Trong nhiều năm, sự chẩn đoán PE ở heo chỉ dựa vào những triệu chứng lâm
sàng như tiêu chảy hay bệnh tích đại thể và vi thể. Chẩn đoán lâm sàng khá khó
khăn, có thể nghi ngờ khi có tiêu chảy từng hồi, đôi khi xuất huyết, đi cùng với ăn
không ngon, gầy yếu. Tuy nhiên khi khám tử với bệnh tích bội triển niêm mac ruột,
việc chẩn đoán trở nên dễ hơn đôi chút. Cần phải phân biệt với bệnh hồng lỵ, bệnh
do Salmonella mãn tính, bệnh lở loét dạ dày, bệnh do độc tố nấm (Rowland và
Lawson, 1992).
Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Bệnh tích vi thể.
Hóa mô miễn dịch.
Phản ứng huyết thanh học như ELISA, IFA.
PCR hay nested-PCR.
2.1.8 Điều trị
Có thể điều trị bằng kháng sinh như tetracycline, sulphonamide hay tylosin.

9


Có thể dùng tetracycline trộn trong thức ăn 300 – 400 ppm, dùng trong 2
tuần.
Kết hợp salinomycine và lincomycin trong nước uống trong 2 tuần khi bắt
đầu dịch.
Chlotetracyclin kết hợp với sulphamethazine cũng được dùng.
2.1.9 Phòng bệnh
Để phòng bệnh cần giới hạn những yếu tố phát triển bệnh: thay đổi chuồng
nuôi, những stress, thay đổi dinh dưỡng, nhiệt độ chuồng, mật độ nuôi... dẫn đến
giảm sức đề kháng của vật nuôi.
Kiểm soát chặt chẽ heo mới mua về. Đàn nhân giống phải nhập từ đàn gia
súc sạch. Tiêm phòng có thể ngăn ngừa triệu chứng lâm sàng và làm giảm hoặc
ngăn ngừa nhiễm độc lực L. intracellularis. Chúng ta không nên sử dụng kháng sinh
mọi lúc.
2.2 Giới thiệu về kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.2.1 Khái niệm kỹ thuật PCR
PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo
ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.
Coli hay nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục
vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn
đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống (nguồn:

/>2.2.2 Lịch sử
Thử nghiệm PCR được một nhà khoa học người Mỹ tên là Kary Mullis phát
minh vào năm 1985. Lúc đó Kary Mullis chỉ là một nhà hoá sinh học khá tầm
thường, làm việc tại một phòng thí nghiệm cũng không hiện đại mấy. Ý tưởng của
phát minh này đến trong đầu K. Mullis một cách tình cờ khi ông lái xe qua một
vùng đồi núi tại bắc California vào một buổi chiều mà trong đầu vẫn cứ miên man
suy nghĩ về công trình nhân bản ADN mà ông đang làm tại phòng thí nghiệm, và rồi
ông bị chạy lố đường nên phải lùi xe quay về lối cũ. Khi lùi xe như vậy, ông chợt

10


thấy rõ hai làn bánh xe mới bị tách khỏi hai làn bánh xe cũ!!.Hình ảnh này chợt làm
loé sáng ra trong đầu ông ý tưởng dùng nhiệt độ để làm biến tính sợi đôi DNA
thành hai mạch đơn...Nhờ đó ông đã phát minh ra thử nghiệm PCR. Công trình
nghiên cứu này được ông gửi đến tờ Nature nhưng bị từ chối vì ban biên tập cho
ông là một tác giả vô danh. Do vậy ông gửi bài đến tờ Scientific American và ban
biên tập tạp chí khoa học này đã nhận diện được đây là một phát minh lớn, họ đăng
tải ngay trong số báo (1985) Vol. 253, 34-157. Chỉ một thời gian ngắn sau đó, K.
Mullis lập tức được nổi tiếng trong giới khoa học thời bấy giờ vì đã thực hiện được
ước mơ của nhiều nhà khoa học thời đó là nhân bản được DNA trong ống nghiệm
mà không cần phải nhờ đến các tế bào chủ như vi khuẩn hay nấm men, đồng thời
mở ra được rất nhiều triển vọng trong nghiên cứu và ứng dụng. Tám năm sau, phát
minh này đã đem lại cho tác giả một nữa giải Nobel hóa học (1993). Có thể nói
trong lịch sử khoa học, hiếm có một nhà khoa học nào có được một kỳ tích như vậy:
Đạt được giải Nobel chỉ 8 năm sau phát minh!!. Mà quả thật kỳ tích này cũng rất
xứng đáng, vì PCR chính là một công cụ cách mạng nhất trong nghiên cứu và ứng
dụng y sinh học (Phạm Hùng Vân, 2009).
2.2.3 Nguyên tắc của phương pháp PCR
Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn

các bản sao từ một trình tự ADN đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme
polymerase. Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của enzyme polymerase trong
qua trình tổng hợp DNA từ mạch khuôn. Tất cả các ADN polymerase đều cần
những mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của
mạch khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của ADN
polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Một phản ứng PCR là một
chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:
Giai đoạn biến tính: tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành dạng mạch đơn.
Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung.
Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi AND mới giống chuỗi AND gốc .

11


( Nguồn: />2.2.4 Primer (đoạn mồi)
Primer
Là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước chỉ vài chục base
(18-30), có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc
của chuỗi DNA đích khi chuỗi đích này được biến tính thành sợi đơn. Trong thử
nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính :

12


(1) Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn
càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không
thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR
càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu.
(11) Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng
hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3', (là đầu mà

nó xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi.
Thông thường trong phản ứng PCR, người ta dùng một cặp mồi, gọi là
primer set, trong đó có một mồi lên gọi là up-stream primer và một mồi xuống gọi
là down-stream prime. Cặp mồi này quyết định nên kích thước của sản phẩm PCR.
Chúng càng bắt cặp trên chuỗi đích xa nhau bao nhiêu thì kích thước của sản phẩm
PCR càng lớn bấy nhiêu và ngược lại, càng gần nhau bao nhiêu thì kích thước càng
nhỏ bấy nhiêu ( />2.2.5 Thành phần cơ bản của phản ứng PCR
DNA mẫu.
Mồi xuôi và mồi ngược.
4 dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) cung cấp năng lượng và base trong quá
trình phản ứng.
Dung dịch đệm cho phản ứng PCR, MgCl2, Taq polymerase.
Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp 1 mạch DNA mới từ khuôn
đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt.
Mồi là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu
3’ của mạch khuôn. DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới.
Mồi xuôi và mồi ngược có khả năng bắt cặp chuyên biệt với hai đầu của một
trình tự DNA. Mồi xuôi (forward primer: F) tác động lên dây DNA theo chiều 3’
5’. Mồi ngược (reserve primer: R) tác động lên dây DNA theo chiều 5’  3’. Phản
ứng PCR sẽ nhân bản trình tự DNA nằm giữa hai mồi ấy (Hồ Huỳnh Thùy Dương,
1998).

13


2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
DNA mẫu
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỹ
thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu thập từ dịch chiết tế
bào. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm với việc sử dụng các

polymerase cho hiệu quả cao hơn. Hơn nữa việc giảm mẫu ban đầu còn hạn chế
được các khuếch đại “ký sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ
Huỳnh Thùy Dương, 1998).
Enzyme
Taq polymerase (DNA polymerase) là enzyme chịu nhiệt được tách chiết từ
vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus. Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt
độ biến tính và xúc tác từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Nồng độ Taq quá cao có
thể tham gia vào việc làm sai lệch các kết quả. Ngược lại, nồng độ Taq quá thấp,
chúng ta sẽ không đủ số lượng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn
(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
Mồi primer và nhiệt độ lai
Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng
và có hiệu quả cao. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của kỹ thuật PCR và phải
tuân theo một số nguyên tắc:
Trình tự mồi chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi”
và mồi “ngược” và có cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung giữa các thành phần
khác nhau của mồi.
Tm của mồi “xuôi” và mồi “ngược” không tách biệt nhau quá xa. Thành
phần nucleotide của các mồi cân bằng, tránh các cặp C-G lặp đi lặp lại nhiều lần.
Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không
trùng với các trình tự lặp lại trên gen.
Trình tự nằm giữa hai mồi “xuôi” và “ngược” không nên quá lớn, phản ứng
PCR sẽ tối ưu hóa khi đoạn gen được tổng hợp có kích thước nhỏ hơn 1 Kb (Hồ
Huỳnh Thùy Dương, 1998).

14


Các thành phần khác của phản ứng PCR
Deoxynucleoside triphosphate (dNTPs).

Bốn dNTPs được sử dụng cho PCR khoảng chừng 100 mM/mồi nucleotide
bao

gồm:

dATP

(dexoxyadenosine

triphosphate),

dCTP

(dexoxycytosine

triphosphate), dGTP (dexoxyguanosine triphosphate), dTTP (dexoxythimine
triphosphate).
Tuy nhiên nồng độ dNTPs phụ thuộc vào:
Nồng độ MgCl2.
Nồng độ mồi.
Độ dài của đọan cần khuếch đại.
Số chu kỳ PCR.
Nồng độ cao hơn dễ dẫn đấn sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong
thành phần nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase.
Dung dịch đệm cần thiết cho phản ứng xảy ra. Nồng độ ion Mg2+ cũng là
nhân tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình PCR. Trong phản ứng có sự tương tác giữa
dNTPs và MgCl2. Nếu nồng độ dNTPs cao thì nồng độ MgCl2 sẽ tăng lên.
Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)
Phản ứng PCR thường không vượt quá 40 chu kỳ qua hai giai đoạn: Giai
đoạn đầu số lượng bản sao tăng lên theo cấp số nhân tỷ lệ với lượng mẫu ban đầu,

sau đó hiệu quả giảm hẳn vì nhiều nguyên nhân:
Sự phân hủy và cạn kiệt của các thành phần phản ứng.
Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.
Các bản sao vừa được tổng hợp không kết với mồi mà bắt cặp với nhau.
Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng
Thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR cần đáp ứng yêu cầu thay đổi nhiệt
độ thật nhanh và chính xác. Tuy nhiên, vì mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm riêng nên
mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần được tiến hành trên một loại thiết bị. Ống
nghiệm dùng cho các phản ứng của cùng một nghiên cứu phải cùng một kiểu vì đặc
tính truyền nhiệt của các ống này cũng như độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạo

15