PHÂN LẬP ESCHERICHIA COLI VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN NÀY TRÊN GÀ.

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y
*****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP ESCHERICHIA COLI VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH
GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN NÀY TRÊN GÀ.

Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ HẠNH DUNG
Lớp: DH07DY
Ngành: Dược Thú Y
Niên khóa: 2007-2012

Tháng 08/2012


BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y
****************

LÊ THỊ HẠNH DUNG

PHÂN LẬP ESCHERICHIA COLI VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH
GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN NÀY TRÊN GÀ

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sĩ thú y

Giáo viên hướng dẫn

TS. NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH
TS. NGUYỄN TẤT TOÀN

Tháng 08/2012

i


XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
Họ và tên sinh viên thực tập: Lê Thị Hạnh Dung
Tên luận văn: “Phân lập Escherichia coli và xác định đặc tính gây bệnh của vi
khuẩn này trên gà”. Đã hoàn thành yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến
nhận xét, đóng góp của Hội Đồng chấm thi tốt nghiệp Khoa ngày…./…./2012.
Giáo viên hướng dẫn 1

Giáo viên hướng dẫn 2

TS. NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH

TS. NGUYỄN TẤT TOÀN

ii


LỜI CẢM ƠN
Xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến Cha Mẹ, gia đình, những người thân yêu
nhất đã hết lòng dạy dỗ tôi, cho tôi ăn học nên người.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Phước Ninh, TS.
Nguyễn Tất Toàn đã tận tình chỉ dạy hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm
quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ Nhiệm Khoa Cơ Bản, Ban Chủ Nhiệm
Khoa Chăn Nuôi Thú Y và cùng toàn thể quý thầy cô khoa Chăn Nuôi Thú Y đã tạo
mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Bệnh Viện Thú Y trường Đại Học Nông Lâm cùng
toàn thể cán bộ công nhân viên đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập.
Cám ơn các bạn trong và ngoài lớp đã cùng tôi học tập giúp đỡ nhau trong
suốt quãng đời sinh viên.
Xin chân thành cảm ơn!
Lê Thị Hạnh Dung

iii


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Đề tài “Phân lập Escherichia coli và xác định đặc tính gây bệnh của vi
khuẩn này trên gà” được tiến hành tại Bệnh Viện Thú Y trường Đại Học Nông
Lâm Tp.HCM, thời gian từ ngày 25/11/2011 đến 4/05/2012.
Phân lập vi khuẩn E. coli trên 36 mẫu bệnh phẩm (túi khí) trên những gà có
bệnh tích điển hình và gà không có bệnh tích điển hình do E. coli được đem đến mổ
khám tại Bệnh Viện Thú Y. Kết quả ghi nhận tỉ lệ dương tính với E. coli là 21/36
(58,33 %).
Sau đó thử kháng sinh đồ của 21 gốc E. coli phân lập được với 13 loại kháng
sinh, đa số đề kháng cao với một số kháng sinh như trimethoprim/ sulfamethoxazone
(85,72 %); ampicillin, amoxicillin và tetracycline (76,19 %); kanamycin và
doxycycline (71,43 %) và chỉ còn nhạy với một số kháng sinh như neltimicin (95,24
%), colistin (90,48 %), tobramycin (80,96 %), gentamycin (66,67 %), cephalexin
(52,38 %). Vi khuẩn kháng trung bình với cefuroxine (66,67 %).
Tiến hành chọn ra 15 gốc E. coli phân lập được tiêm truyền trên phôi trứng
12 - 13 ngày tuổi xác định độc lực. Trong đó, có 10 gốc có độc lực cao chiếm tỉ lệ
66,67 %, 4 gốc độc lực trung bình 26,67 % và 1 gốc không có độc lực 6,66 %. Tỉ lệ

chết phôi trong khoảng từ 0 - 100 %.
Xác định đặc tính gây bệnh trên gà con 1 ngày tuổi của 8 gốc E. coli có độc
lực cao và 2 gốc có độc lực trung bình cho tỉ lệ gà con chết sau khi tiêm vi khuẩn
dao động trong khoảng 20 - 100 %.
Kết quả kiểm tra 2 gene liên quan đến độc lực của E. coli gây bệnh gia cầm
là fimC và iucD trên 10 gốc có độc lực bằng PCR cho thấy tỉ lệ số gốc mang gene
fimC là 90 %, gene iucD là 60 % và tỉ lệ số gốc có mang cả 2 gene là 50 %.

iv


MỤC LỤC
TRANG TỰA................................................................................................................... i
XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ............................................................ii
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ iii
TÓM TẮT LUẬN VĂN .................................................................................................iv
MỤC LỤC ........................................................................................................................ v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ............................................................................................ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH – SƠ ĐỒ .............................................................................. x
Chương 1 MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.1Đặt vấn đề ........................................................................................................................... 1
1.2 Mục đích và yêu cầu .......................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1 Sơ lược về vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) .............................................................. 3
2.1.1 Đại cương ........................................................................................................................ 3
2.1.2 Đặc điểm sinh học: ......................................................................................................... 3
2.1.2.1 Đặc điểm hình dạng và sự nhuộm màu .................................................................... 3
2.1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy ....................................................................................................... 4
2.1.2.3 Đặc tính sinh hóa ......................................................................................................... 4

2.1.2.4 Sức đề kháng ................................................................................................................ 5
2.1.3 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố ................................................................................. 5
2.1.3.1 Cấu trúc kháng nguyên ............................................................................................... 5
2.1.3.2 Độc tố ............................................................................................................................ 6
2.1.3.3. Tính chất gây bệnh ..................................................................................................... 7
2.2 Bệnh do E. coli trên gà ...................................................................................................... 8
2.2.1 Truyền nhiễm học ........................................................................................................... 8
2.2.1.1 Động vật cảm thụ ........................................................................................................ 8
2.2.1.2 Chất chứa căn bệnh ..................................................................................................... 8

v


2.2.1.3 Phương thức truyền lây............................................................................................... 8
2.2.1.4 Đường xâm nhập ......................................................................................................... 9
2.2.2 Cơ chế sinh bệnh............................................................................................................. 9
2.2.3 Triệu chứng và bệnh tích ............................................................................................... 9
2.2.3.1 Triệu chứng .................................................................................................................. 9
2.2.3.2 Bệnh tích.................................................................................................................... 10
2.2.4 Chẩn đoán ...................................................................................................................... 10
2.2.5 Phòng và điều trị bệnh ................................................................................................. 10
2.3 Giới thiệu phương pháp PCR (Polymerase chain reaction)........................................ 11
2.3.1 Giới thiệu ....................................................................................................................... 11
2.3.2 Nguyên tắc chung ......................................................................................................... 12
2.3.3 Các giai đoạn của phản ứng PCR ............................................................................... 12
2.3.4 Thành phần phản ứng PCR.......................................................................................... 12
2.3.5 Kiểm tra kết quả PCR .................................................................................................. 13
2.3.6 Ứng dụng của phương pháp PCR ............................................................................... 13
2.4 Nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................................................... 13
2.4.1 Trong nước .................................................................................................................... 13

2.4.2 Ngoài nước .................................................................................................................... 15
Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ........................................ 17
3.1 Thời gian và địa điểm ...................................................................................................... 17
3.1.1 Thời gian. ....................................................................................................................... 17
3.1.2 Địa điểm ................................................................................................................ 17
3.2 Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................................... 17
3.3 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................... 17
3.4 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................ 17
3.4.1 Phân lập vi khuẩn E. coli trên gà bệnh....................................................................... 19
3.4.1.1 Phân lập vi khuẩn E. coli trên gà bệnh ................................................................... 19
3.4.1.2 Thử kháng sinh đồ ..................................................................................................... 21
3.4.2 Xác định độc lực của các gốc E. coli phân lập được qua phôi trứng gà ................ 22

vi


3.4.3 Ghi nhận đặc tính gây bệnh trên gà con 1 ngày tuổi ................................................ 25
3.4 Khảo sát các gene độc lực từ các gốc E. coli phân lập bằng phương pháp PCR ............ 28
3.5 Xử lý số liệu ..................................................................................................................... 30
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 31
4.1 Kết quả phân lập các gốc E. coli trên gà khảo sát và thử kháng sinh đồ .................. 31
4.1.1 Tỷ lệ dương tính với E. coli ........................................................................................ 31
4.1.2 Kết quả kháng sinh đồ của các gốc vi khuẩn E. coli phân lập được. ..................... 33
4.2 Xác định độc lực của các gốc E. coli phân lập được qua phôi trứng gà ................... 38
4.2.1 Ghi nhận số phôi chết trong thời gian theo dõi ( 0 - 48 giờ) ................................... 38
4.2.2 Quan sát bệnh tích đại thể trên những phôi trứng đã chết ....................................... 39
4.3 Điểm triệu chứng và bệnh tích trên gà .......................................................................... 40
4.3.1 Tỉ lệ gà con chết sau khi tiêm huyễn dịch vi khuẩn ................................................. 40
4.3.2 Triệu chứng lâm sàng của gà con trong thời gian theo dõi ..................................... 40
4.3.3 Bệnh tích đại thể và vi thể ........................................................................................... 42

4.4 Kết quả kiểm tra một số gene độc lực của vi khuẩn E. coli ....................................... 45
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 47
5.1 Kết luận ............................................................................................................................. 47
5.2 Đề nghị ............................................................................................................................. 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 48
PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 51

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APEC: Avian pathogenic Escherichia coli
BA: Bool Agar
BHI: Brain Heart infusion Broth
CFU: Colony – forming units
CRD: Chronic Respiratory Disease
DNA: Deoxyribonucleic acid
dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphat
EMB: Eosin Methylen Blue
EPEC: Enteropathogenic E. coli
ETEC: Enterotoxigenic E. coli
EIEC: Enteroinvasie E. coli
IMViC: Indol, Methyl Red, Voges – Proskauer, Simon’s Citrate
LT: Heat labile toxin
LPS: Lipopolysaccharide
MCK: Mac Con Key
NA: Nutrient agar
SLT: Shiga Like Toxin
ST: Heat stable toxin
KIA: Kligler iron agar

PCR: Polymerase chain reaction
TBE: Tris – borate EDTA
UV: Ultra violet
VTEC: Verotoxigenic E. coli

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Số lượng mẫu gà đã mổ khám ...................................................................20 
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................23 
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................26 
Bảng 3.4 Bảng điểm triệu chứng của gà bị bệnh do vi khuẩn E. coli .......................27 
Bảng 3.5 Bảng cho điểm bệnh tích đặc trưng do vi khuẩn E. coli...........................28 
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR ........................................................................29 
Bảng 3.7 Trình tự các primer được sử dụng trong phản ứng PCR ...........................30 
Bảng 3.8 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ............................................................30 
Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli ..............................................................31 
Bảng 4.2 Kết quả kháng sinh đồ của E. coli .............................................................34 
Bảng 4.3 Kết quả kháng sinh đồ của 17 gốc E. coli ................................................36 
Bảng 4.4 Kết quả kháng sinh đồ của 4 gốc E. coli ..................................................37 
Bảng 4.5 Kết quả tỉ lệ phôi trứng chết sau 2 ngày theo dõi ......................................38 
Bảng 4.6 Tỉ lệ chết của gà con thí nghiệm sau 7 ngày theo dõi................................40 
Bảng 4.7 Điểm trung bình triệu chứng của gà trong thời gian theo dõi. ..................41 
Bảng 4.8 Điểm bệnh tích trung bình ở một số cơ gan sau 7 ngày ............................42 
Bảng 4.9 Tỉ lệ phát hiện gene độc lực.......................................................................45 

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH – SƠ ĐỒ
Hình 2.1 Hình vi khuẩn E. coli ..................................................................................... 4
Hình 2.2 Cấu trúc kháng nguyên E. coli ....................................................................... 5
Hình 4.1 Khuẩn lạc E. coli có màu tím ánh kim trên môi trường EMB ..................... 32
Hình 4.2 Kết quả kháng sinh đồ .................................................................................. 35
Hình 4.3 Bệnh tích đại thể trên phôi gà ...................................................................... 39
Hình 4.4 Gà có triệu chứng bệnh do E. coli. ............................................................... 41
Hình 4.5 Bệnh tích đại thể trên gà thí nghiệm ............................................................ 42
Hình 4.6 Tim xuất huyết nhiều ................................................................................... 44
Hình 4.7 Viêm phổi lan rộng....................................................................................... 44
Hình 4.8 Lách sung huyết ........................................................................................... 44
Hình 4.9 Túi khí dày tích casein ................................................................................. 44
Hình 4.10 Thận sung huyết, xuất huyết ..................... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.11 Biểu mô ruột bong tróc .............................................................................. 44
Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại của fimC và iucD ........................... 45
Sơ đồ 3.1 Các bước tiến hành thí nghiệm ................................................................ 188 
Sơ đồ 3.2 Qui trình phân lập vi khuẩn E. coli ............................................................. 20 
Sơ đồ 3.3 Cách pha huyễn dịch vi khuẩn E. coli ........................................................ 23 
Sơ đồ 3.4 Quy trình thử nghiệm độc lực vi khuẩn trên phôi trứng ............................. 24 

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Escherichia coli là một tác nhân gây bệnh chủ yếu trong chăn nuôi gia cầm,
được xem là một trong những nguyên nhân gây thiệt hại lớn về kinh tế cho ngành
chăn nuôi gà công nghiệp trên toàn thế giới. Bệnh xảy ra ở gà mọi lứa tuổi, làm
giảm tỉ lệ ấp nở, giảm tỉ lệ đẻ, giảm tăng trọng, làm tăng tỉ lệ chết, tăng chi phí sản

xuất (Barnes & Gross, 1997). E. coli có khả năng gây bệnh trên tất cả các cơ quan
như viêm túi khí, viêm màng bao quanh gan, tim, viêm phổi, nhiễm trùng huyết, túi
lòng đỏ và thường hay kết hợp với nhiều bệnh khác làm cho bệnh trở nên trầm trọng
hơn nhất là kết hợp với Mycoplasma gallisepticum gây viêm khớp, sưng phù đầu,
viêm màng bụng…gây thiệt hại cho người chăn nuôi, chậm xuất chuồng. Vì thế cần
chẩn đoán chính xác bệnh để có biện pháp phòng và điều trị kịp thời.
Khả năng gây bệnh của E. coli còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố bên trong và
bên ngoài tác động như: điều kiện môi trường như chuồng nuôi không đủ tiêu
chuẩn, thức ăn và nước uống bị ô nhiễm, tình trạng nuôi nhốt quá đông…và gia cầm
bị trong giai đoạn nhạy cảm (suy giảm miễn dịch, stress, chấn thương…) (Dho Moulin và Fairbother, 1999). Bản thân vi khuẩn E. coli gây bệnh trên gia cầm tổng
hợp nhiều yếu tố, có yếu tố là độc tố và có yếu tố không phải là độc tố. Nhưng chưa
có yếu tố độc lực cụ thể nào được xác định là chịu trách nhiệm gây bệnh E. coli ở
gia cầm (Antão và ctv, 2008). Đồng thời, do có nhiều chủng kháng nguyên E. coli
gây bệnh và việc điều trị bằng kháng sinh hiện nay không đạt được hiệu quả cao. Vì
vậy, việc kiểm soát và phòng trị bệnh gặp rất nhiều khó khăn.
Việc sử dụng phôi gà và gà con làm mô hình thử nghiệm để gây nhiễm với
E. coli phân lập từ thực địa kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử PCR để xác định

1


gene độc lực giúp chúng ta hiểu rõ hơn cơ chế gây bệnh, các yếu tố độc lực liên
quan đến E. coli trên gia cầm là điều rất cần thiết. Đồng thời, kiểm tra tính nhạy
cảm của E. coli với một số loại kháng sinh giúp hiểu hơn về tình trạng sử dụng
kháng sinh hiện nay, từ đó nâng cao hiệu quả trong công tác phòng và điều trị bệnh
nhằm bảo vệ sức khỏe con người và vật nuôi.
Với những lý do trên, được sự chấp thuận của Khoa Chăn Nuôi - Thú Y,
trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh và dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn
Thị Phước Ninh và TS. Nguyễn Tất Toàn chúng tôi thực hiện đề tài: “ Phân lập
Escherichia coli và xác định đặc tính gây bệnh của vi khuẩn này trên gà.”

1.2 Mục đích và yêu cầu
Mục đích
Phân lập và xác định đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli làm cơ sở cho
công tác chẩn đoán và phòng trị bệnh có hiệu quả.
Yêu cầu
Nắm được những đặc điểm cơ bản về bệnh E. coli trên gà, các yếu tố gây
bệnh.
Nắm được phương pháp, qui trình chẩn đoán trong phòng thí nghiệm về bệnh
E. coli trên gà.
Phân lập các gốc E. coli trên gà có bệnh tích điển hình và không điển hình do
E. coli gây ra.
Xác định độc lực của các gốc E. coli phân lập được qua phôi trứng gà 12-13
ngày tuổi và gà con 1 ngày tuổi. Ghi nhận bệnh tích đại thể và vi thể trên gà sau khi
tiêm các gốc vi khuẩn E. coli phân lập được.
Xác định các gene độc lực của các gốc E. coli có khả năng gây bệnh.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về vi khuẩn Escherichia coli (E. coli)
2.1.1 Đại cương
Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), vi khuẩn Eschesrichia
coli (E. coli) thuộc:
Lớp: Schyzomycetes
Bộ: Eubacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Tộc: Escherichiae
Giống: Escherichia

Loài: Escherichia coli
Escherichia coli được gọi tắt là E. coli còn có tên là Bacterium coli commue
được ông Escherich phát hiện năm 1885 trong trường hợp tiêu chảy ở trẻ em.
E. coli là trực khuẩn ruột già, vi khuẩn này có mặt trong ruột hầu hết động
vật, ở phần cuối ruột non hay ruột già, ít khi có ở dạ dày hay phần trước ruột non
của các loài động vật như: chó, mèo, heo, bò, ngựa, gia cầm và người.
Vi khuẩn thường theo phân ra ngoài nên ta thường thấy vi khuẩn trong đất,
nước, không khí. Trong tự nhiên vi khuẩn sống được vài tuần đến vài tháng. Động
vật non cảm nhiễm đặc biệt với E. coli.
2.1.2 Đặc điểm sinh học
2.1.2.1 Đặc điểm hình dạng và sự nhuộm màu
E. coli là trực khuẩn Gram âm, bắt màu hồng, kích thước 1 - 3 x 0,5 hai đầu
tròn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn di động, không hình thành nha
bào, có giáp mô thỉnh thoảng thấy bắt màu lưỡng cực ở hai đầu.

3


Hình 2.1. Vi khuẩn E. coli
( />2.1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy
Vi khuẩn E.coli là trực khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi, có thể nuôi cấy ở
nhiệt độ 370C, pH = 7,4. Mọc tốt trên môi trường dinh dưỡng thông thường và chịu
được sự biến thiên nhiệt độ từ 4 - 450C. Trên môi trường thạch dinh dưỡng tạo
khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng đục hơi lồi, để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn. Trên môi
trường thạch máu có chủng dung huyết α, β và có chủng không gây dung huyết.
Trên thạch gelatin không tan chảy. Môi trường canh dinh dưỡng làm đục đều môi
trường, sau lắng xuống đáy có màu tro nhạt, đôi khi có màu xám, mùi trứng thối.
Trên môi trường chuyên biệt: môi trường Mac Conkey (MCK): tạo khóm đỏ hồng;
trên môi trường Eosin methylen blue (EMB): tạo khuẩn lạc màu tím ánh kim; trên
môi trường Kligler iron agar (KIA): lên men đường glucose và lactose (vàng/vàng),

sinh hơi, không sinh khí H2S. Môi trường Brilliant green agar (BGA) tạo khóm
xanh lá mạ.
2.1.2.3 Đặc tính sinh hóa
E. coli lên men sinh hơi đường glucose, lactose, manitol, galactose. E. coli
lên men không sinh hơi đường maltose, arabinose, lên men hay không lên men
đường saccarose, không lên men dextrin, glycogen, salisin amidon, ít khi lên men
inulin, pectin. Phản ứng IMViC: ++-- (indol +, methylred +, voges proskauer -,
citrate -).

4


2.1.2.4 Sức đề kháng
E.coli bị tiêu diệt ở nhiệt độ 550C trong 1 giờ, 600C trong 15 - 30 phút, 95%
bị diệt ở nhiệt độ đông lạnh trong 2 giờ. Trong tự nhiên có thể tồn tại từ vài tuần
đến 1 tháng, chủng độc lực cao có thể tồn tại trên 4 tháng.
Vi khuẩn này dễ dàng bị diệt bởi các chất sát trùng thông thường như: acid
fenic, HgCl2, formol trong 5 phút, có khả năng chịu đựng được các yếu tố lý hóa
cao hơn các vi khuẩn khác như Salmonella, Shigella (Tô Minh Châu và Trần Thị
Bích Liên, 2006).
2.1.3 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố
2.1.3.1 Cấu trúc kháng nguyên

Hình 2.2. Cấu trúc kháng nguyên E. coli
( />Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), cấu trúc kháng nguyên
của vi khuẩn E. coli phức tạp, gồm 4 loại: O, H, K và F.
Kháng nguyên thân O (Ohn)
Kháng nguyên thân O có bản chất là Lipopolysaccharide (LPS), có trên 160
loại phân bố trong vách tế bào. Kháng nguyên này bền với nhiệt độ và cồn, không
bị phân hủy ở nhiệt độ 100 - 1200C trong 2 giờ, các chất có cồn, acid HCl 1 N chịu

được 20 giờ. Đồng thời, kháng nguyên O cũng bị tiêu diệt bởi formol. Kháng
nguyên O được chia làm 4 nhóm: OI, OII, OIII, OIV.
Vi khuẩn E. coli gây bệnh ở gia cầm thường là 4 nhóm lớn gồm: nhóm OI
(O18, O15), nhóm OII (O18, O20, O86), nhóm OIII (O1), nhóm OIV (O121, O138,
O149, O151: K88 (B)). Nhóm gây bệnh phổ biến nhất là O78: K80 (B), O2: K1 (L).

5


Trên gà bệnh do E. coli thường thấy các type: O1, O2, O35, 078 (Nguyễn
Ngọc Hải, 2008).
Kháng nguyên giáp mô K (Kapsul)
Có bản chất là polysaccharide, có hơn 100 loại, chịu nhiệt kém bị phá hủy ở
1000C/ 1 giờ, có khi đến 1210C/ 2 giờ.
Kháng nguyên K gồm 4 kháng nguyên: A, B, L và M. Các kháng nguyên này
có khả năng ngưng kết huyết thanh của kháng nguyên O. Nhiệm vụ của kháng
nguyên này: hỗ trợ phản ứng ngưng kết cùng với kháng nguyên O trong cấu trúc
kháng nguyên, tạo thành hàng rào bảo vệ giúp kháng nguyên chống lại các tác động
ngoại cảnh và hiện tượng thực bào.
Typ A: rất chịu nhiệt, không bị hủy ở 1000C trong 1 giờ, tính kháng nguyên
khả năng liên kết, kết tủa đều giữ nguyên.
Typ B (B1 - B6): tương đối chịu nhiệt khi đun sôi ở 1000C trong 1 giờ vẫn
giữ được khả năng ngưng kết và kết tủa khác với kháng nguyên L. Kháng nguyên
này thường thấy trong vi khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột.
Typ L: không chịu nhiệt bị hủy ở 1000C trong 1 giờ, mất khả năng ngưng
kết, kết tủa và tính kháng nguyên.
Typ M: chưa được rõ.
Kháng nguyên lông bám F (Focsman)
Kháng nguyên tiêm mao, bản chất là protein kết dính vào tế bào thành ruột,
có dạng hình sợi giúp kết dính vi khuẩn vào nhung mao ruột.

Kháng nguyên H (Hauch)
Bản chất là protein, có 60 loại, chịu nhiệt thấp, 1000C trong 2 giờ thì mất tính
chất kháng nguyên, phần lớn E. coli có chung type kháng nguyên này.
2.1.3.2 Độc tố
Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), vi khuẩn E. coli sinh các
độc tố sau:
Nội độc tố (endotoxin): được sinh ra khi vi khuẩn bị tiêu diệt.

6


Ngoại độc tố (exotoxin)
Là độc tố mà vi khuẩn E. coli tiết ra bao gồm: enterotoxigenic E. coli
(ETEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), enteroinvasive E. coli (EIEC),….
Ngoại độc tố làm tan huyết. Loại độc tố này hướng mạch máu, gây nên hiện
tượng phù thũng.
Ngoài ra, E. coli còn tiết một số độc tố khác như: cytotoxin, haemolysin.
2.1.3.3. Tính chất gây bệnh
Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), ngày nay người ta chia
E. coli gây bệnh ra làm nhiều nhóm và tùy thuộc vào độc lực của chúng.
Gồm có 3 nhóm chính:
E. coli độc tố ruột: enterotoxigenic E. coli (ETEC), E. coli gây bệnh tích ở
ruột: enteropathogenic E. coli (EPEC), E. coli xâm lấn ruột: enteroinvasive E. coli
(EIEC).
Và một số nhóm khác như: Vasotoxin E. coli hay verotoxin (VTEC), Avian
panthogenic E. coli (APEC).
Enterotoxigenic E. coli (ETEC): đây là độc tố được nói đến nhiều nhất và nó
được xem là nguyên nhân gây tiêu chảy thông thường trên thú non (độc tố đường
ruột), có 2 loại:
LT (heat labile enterotoxin): độc tố đường ruột không chịu nhiệt, gây tiêu

chảy, mất nước, gây độc đối với tế bào thần kinh. Trọng khối phân tử MW: 91,5
Kda chia làm 2 phần LTa và LTb, có tính chất kháng nguyên.
ST (heat stable enterotoxin): là độc tố đường ruột chịu nhiệt, gây tiêu chảy,
gồm Sta/1 và STb/2, không có tính chất kháng nguyên.
Những động vật mang độc tố ETEC sản xuất LT và ST sẽ gây tiêu chảy trầm
trọng và kéo dài hơn những thú mà E. coli chỉ tạo được LT hay ST. Khả năng sinh
enterotoxin cũng có thể thay đổi nếu cấy chuyển nhiều, một số dòng sẽ mất khả
năng sinh enterotoxin.
Enteropathogenic E. coli (EPEC): bao gồm một số type huyết thanh cổ điển,
cơ chế gây bệnh chưa rõ.

7


Enteroinvasive E. coli (EIEC): gồm nhiều type huyết thanh gây bệnh với
những triệu chứng bệnh giống với Shigella, E. coli xâm lấn màng niêm ruột gây đi
tiêu rặn, phân có lẫn máu khó phân biệt với lỵ, viêm trực tràng.
Vasotoxin E. coli hay Verotoxin (VTEC): có trọng khối phân tử 70 Kda có
tính chất kháng nguyên.
Avian panthogenic E. coli (APEC): biểu hiện chính là tích dịch túi khí, có
nhiều thanh dịch, gây bệnh đường ruột gia cầm và thường kết hợp với yếu tố ngoại
cảnh và nhân tố mở đường. Độc tố APEC phân lập được hầu như thuộc serotype:
O1, O2, O78, và yếu tố độc lực gắn liền với chủng F (Fibriae: lông mềm) với giáp
mô K1 chịu nhiệt và dung huyết.
2.2 Bệnh do E. coli trên gà
2.2.1 Truyền nhiễm học
2.2.1.1 Động vật cảm thụ
Gia cầm, các loài chim, động vật hữu nhũ ở mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh
do E. coli gây ra, nhưng con non hoặc những con đang bị bệnh, suy yếu thì dễ mắc
bệnh hơn cả. Trên gà, bệnh thường xảy ra ở giai đoạn 1 - 10 ngày tuổi, những con

gà ở giai đoạn chuẩn bị đẻ.
Trong phòng thí nghiệm chuột lang, chuột bạch và thỏ đều mẫn cảm khi tiêm
canh trùng dưới da gây viêm cục bộ, nếu tiêm liều lớn gây bại huyết và giết chết
con vật.
2.2.1.2 Chất chứa căn bệnh
Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), trên gà vi khuẩn có trong
gan, lách, tủy xương, buồng trứng, túi khí,… ngoài ra vi khuẩn còn có trong con
khỏe mang trùng. Trong tự nhiên vi khuẩn tồn tại khắp nơi: nền chuồng, thức ăn,
nước uống, chất độn chuồng. Ngoài ra, vi khuẩn còn hiện diện trong bụi nền
chuồng, trong điều kiện khô vi khuẩn tồn tại rất lâu.
2.2.1.3 Phương thức truyền lây
Các con đường lây bệnh chủ yếu của vi khuẩn E. coli là truyền lây qua trứng
do cơ thể mẹ bị nhiễm bệnh, qua vỏ trứng do bị nhiễm bẩn từ phân hoặc môi trường

8


chuồng trại bị nhiễm trùng, qua đường hô hấp do gà bị bệnh CRD làm cho niêm
mạc phế quản bị tổn thương, vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua vết thương. Truyền
lây qua thức ăn và nước uống nhiễm trùng.
2.2.1.4 Đường xâm nhập
Bệnh do E. coli lây lan chủ yếu qua đường tiêu hóa do ăn phải thức ăn, nước
uống có chứa mầm bệnh. Bệnh có thể lây nhiễm qua đường hô hấp, niêm mạc mắt.
Bệnh có thể lây nhiễm qua đường hô hấp do gà bị nhiễm CRD (Chronic
Respirstory Disease) làm cho niêm mạc phế quản bị tổn thương, vi khuẩn xâm nhập
qua vết thương vào cơ thể.
Bệnh truyền lây qua trứng do gà mẹ bị nhiễm bệnh. Vi khuẩn xâm nhập qua
vỏ trứng do vỏ trứng bị nhiễm bẩn từ phân hoặc từ môi trường chuồng trại bị nhiễm
trùng.
2.2.2 Cơ chế sinh bệnh

Bệnh xảy ra do sức đề kháng của gia súc, gia cầm kém (bởi sự thay đổi khẩu
phần ăn, nhiệt độ, stress,…) màng niêm ruột giảm chức năng bảo vệ tạo điều kiện
cho vi khuẩn xâm nhiễm. Vi khuẩn E.coli gia tăng số lượng nhanh chóng tấn công
vào hệ thống mạch máu, hạch lâm ba, tủy xương gây nhiễm trùng huyết, viêm túi
khí, viêm màng bao tim, viêm cơ tim. Nếu vi khuẩn xâm nhiễm từ đường hô hấp
chúng sẽ định vị tại túi khí, sau đó vào máu gây nhiễm trùng huyết. Vi khuẩn E.coli
sau khi vào máu sẽ định vị ở những vùng khác nhau: khớp, túi khí, màng hoạt dịch,
màng bao tim, sau đó di chuyển đến gan, lách làm cho gan, lách bị viêm, tạo những
khối u ở gan, lách sưng to sậm màu.
2.2.3 Triệu chứng và bệnh tích
2.2.3.1 Triệu chứng
Theo Lê Văn Năm (2010), thời gian nung bệnh có thể từ vài ngày đến vài
tuần tùy thuộc vào độc lực và số vi khuẩn gây nhiễm, sức đề kháng, điều kiện
chuồng trại, thức ăn, nước uống. Thường có 2 thể bệnh:
Cấp tính: phần lớn bệnh xảy ra ở thể này, bệnh diễn biến nhanh, con vật sốt,
khát nước, bỏ ăn và chết.

9


Mãn tính: gà tiêu chảy mạnh, phân xanh, trắng, có lẫn máu, gà suy yếu và
chết.
Gà bị bệnh do E.coli lông bị xù, khó thở, sưng phù đầu, sưng mắt, sưng
khớp, da mặt tái. Ở gà con mới nở thì viêm rốn, lòng đỏ không tiêu. Trong trường
hợp kế phát bệnh trên đường hô hấp thì gà khò khè, chảy nước mũi, sưng mặt.
2.2.3.2 Bệnh tích
Túi khí viêm dày lên, xuất hiện casein.
Viêm màng bao tim, màng bao quanh gan, làm cho các màng này dày lên.
Tích dịch màng bao tim, tích nước xoang bụng, túi khí.
Gan sưng dễ vỡ, có đốm hoại tử.

Niêm mạc dày lên, sung huyết, xuất huyết.
Khớp sưng, tích dịch.
Lách, thận sưng chuyển màu sậm hay nhạt hơn.
Theo Nguyễn Thị Phước Ninh (2010) trường hợp gà bị CRD kết hợp với E.
coli thì sẽ gây viêm túi khí nặng, fibrin hoặc fibrin mủ, viêm màng bao tim và màng
bao quanh gan, trên gà đẻ có casein bao phủ lên buồng trứng.
2.2.4 Chẩn đoán
Dựa trên đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và đặc điểm bệnh tích quan
sát được sau khi mổ khám gà bệnh sau đó lấy bệnh phẩm xét nghiệm và phân lập vi
khuẩn.
Chú ý cần phân biệt với các bệnh có triệu chứng lâm sàng gần giống như
bệnh bạch lỵ, thương hàn, bệnh phó thương hàn và cần phân biệt với bệnh có bệnh
tích gần giống E. coli như hô hấp mãn tính.
2.2.5 Phòng và điều trị bệnh
Phòng bệnh
Do có nhiều chủng kháng nguyên E. coli nên việc phòng bệnh bằng vaccine
ít có hiệu quả.
Khi bệnh chưa xảy ra, phòng bệnh bằng phương pháp vệ sinh từ trong ra
ngoài: vệ sinh trứng ấp bằng thuốc sát trùng trứng, vệ sinh máy ấp, khu chăn nuôi,

10


dụng cụ chăn nuôi, vệ sinh chất độn chuồng, vệ sinh chuồng nuôi và thực hiện theo
nguyên tắc cùng vào cùng ra. Chuồng trại được sát trùng, tiêu độc định kỳ, để trống
chuồng một thời gian thích hợp.
Tăng cường sức đề kháng của cơ thể bằng cách cung cấp đủ vitamin, khoáng
chất, giảm tối đa stress (như nhiệt độ cao, gió lùa, khí amoniac, mật độ nuôi quá
đông, không đủ thông thoáng, ...). Đồng thời hạn chế người ra vào nơi nuôi và
người ra vào cần phải mặc quần áo bảo hộ để tránh làm phương tiện truyền vi

khuẩn.
Tiêm phòng vacin đầy đủ, chuồng trại thông thoáng và được sát trùng định
kỳ và được thay chất độn chuồng thường xuyên. Cách ly và điều trị ngay lập tức đối
với những con gà vừa nhiễm bệnh.
Điều trị
Để có kết quả điều trị cao quan trọng là cần phát hiện bệnh sớm, điều trị kịp
thời và sử dụng kháng sinh, thuốc trợ sức. Trong quá trình điều trị phải cải thiện vệ
sinh môi trường, thức ăn, nước uống, cung cấp vitamin nhằm tăng sức đề kháng cho
gia cầm. Để đạt kết quả tốt nhất nên kiểm tra kháng sinh đồ trước khi lựa chọn
kháng sinh để có phác đồ điều trị thích hợp, điều này cũng làm giảm nguy cơ vi
khuẩn kháng kháng sinh.
Hiện nay một số kháng sinh được khuyến cáo trong quá trình điều trị gồm:
cephalexin, gentamicin, norfloxacine,… Dùng trong 3 - 4 ngày liên tục.
2.3 Giới thiệu phương pháp PCR (Polymerase chain reaction)
2.3.1 Giới thiệu
Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây
chuyền nhờ polymerase) được phát minh bởi K.Mullis và cộng sự vào năm 1985.
Đây là kỹ thuật invitro cho phép nhân nhanh một gene mong muốn lên hàng triệu
lần trong thời gian ngắn. Đoạn DNA được khuyếch đại được nhận dạng nhờ cặp
primer đặc hiệu thường có chiều dài khoảng 20 - 30 nucleotide.

11


2.3.2 Nguyên tắc chung
PCR là kỹ thuật khuyếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự
xúc tác của enzyme DNA polymerase. Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu
trình nhiệt lặp lại (có thể từ 30 – 40 lần) gồm đun nóng (95oC), làm nguội (60 –
65oC), và ủ dài ở 72oC. Trong dung dịch có các primer (thường có 2 primer) bắt cặp
bổ sung ở hai đầu mạch đơn tương ứng.

Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
mạch khuôn mẫu điều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những
đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung với một 3’của mạch khuôn. DNA
polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Mồi xuôi tác động lên sợi DNA
theo chiều từ 3’- 5’. Mồi ngược tác động theo chiều 5’- 3’.
2.3.3 Các giai đoạn của phản ứng PCR
Một phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu
kỳ gồm 3 giai đoạn:
 Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính
Nhiệt độ được đưa lên 940C, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi
DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy các phân tử DNA mạch kép bị tách ra, tạo nên các sợi
đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới.
 Giai đoạn 2: Giai đoạn bắt cặp
Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ sẽ được hạ đến 550C–650C là nhiệt độ
thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích.
 Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài
Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 72oC giúp DNA polymerase tổng hợp
sợi mới. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA – polymerase và chiều dài
đoạn DNA cần khuếch đại.
2.3.4 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần của một phản ứng PCR bao gồm: khuôn mẫu (đoạn DNA cần
khuếch đại, không cần độ tinh sạch cao), cặp primer (nhân tố khuếch đại, thường
chứa 18–25 nucleotide), polymerase chịu nhiệt (Taq-polymerase) giúp chịu được

12


nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng,
dNTPs (các loại nucleotide triphosphate), dung dịch đệm (thường là MgCl2).
2.3.5 Kiểm tra kết quả PCR

Sản phẩm của phản ứng PCR sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di.
Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của
điện trường.
Acid nucleic là một phân tử tích điện âm, vì vậy chúng có thể dịch chuyển
qua bản gel từ cực âm sang cực dương dưới tác dụng của điện trường. Trên cùng
một bản gel, có cùng một dòng điện những phân tử khác nhau về trọng lượng nên di
chuyển được những quãng đường khác nhau sau một thời gian như nhau. Sau khi
phân tách bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA người ta dùng phương pháp làm
hiện hình. Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ
gắn xen vào các base của phân tử DNA và phát quang dưới tia tử ngoại. Như vậy dễ
dàng cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel. Đối với gel polyacrylamide,
các phân tử được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát
hiện bằng kỹ thuật phòng xạ tự ghi. Tùy thuộc kích thước DNA mà người ta chọn
loại gel, nồng độ gel, loại đệm (TBE hay TAE) (Lò Thanh Sơn, 2009).
2.3.6 Ứng dụng của phương pháp PCR
Phương pháp PCR có giá trị ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực như:
khảo cổ học, sinh học, pháp y, y học, nông nghiệp….Trong chăn nuôi, phương pháp
PCR dùng phát hiện các gen có ưu thế về giống tốt, về năng suất sinh sản hoặc xác
định giới tính khi tryền cấy phôi…Riêng trong lĩnh vực thú y, PCR được ứng dụng
rất nhiều trong chẩn đoán xác định tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, virus…và kỹ
thuật PCR còn phục vụ lĩnh vực nghiên cứu điều chế vắcxin.
2.4 Nghiên cứu trong và ngoài nước
2.4.1 Trong nước
Nguyễn Văn Hạng (1988), khảo sát tỷ lệ nhiễm khuẩn E. coli trên gia cầm ở
An Giang cho thấy tỉ lệ nhiễm tương đối thấp kết quả phân lập từ gan là 23,96 % .

13


Mai Chí Cần (2002), khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E. coli, Salmonella

và nấm phổi trên gà 1 ngày tuổi. Tỉ lệ nhiễm E. coli là 35,34 % (41/116) và kết quả
thử độc lực dựa trên chuột cho thấy tỷ gây chết chuột là 75 – 100 %.
Trương Ngọc Tuyết (2002), phân lập vi khuẩn E. coli từ gà bệnh 1 - 7 ngày
tuổi cho thấy dịch viêm là canh khuẩn nguyên thì type dung huyết (γ) gây chết
chuột 100 %, còn α và β không gây chết chuột.
Trần Đức Trung (2003), khảo sát tỉ lệ nhiễm E. coli và sự kháng thuốc trên
gà bệnh từ 2-10 tuần tuổi mổ khám tại Bệnh viện Thú Y trường Đại học Nông Lâm,
cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh chung là 69,44 % (50/72) và kết quả tiêm chuột các chủng
E. coli được phân lập đều có khả năng gây chết chuột, tỉ lệ chết cao từ 75-100 %.
Võ Thị Hồng Điệp (2004), định type kháng nguyên của vi khuẩn E. coli
được phân lập từ gà bệnh, sử dụng phương pháp tiêm truyền qua phôi trứng và
chuột bạch để đánh giá độc lực. Kết quả độc lực trên phôi trứng cho thấy số phôi
trứng chết có tỉ lệ biến động từ 66 – 88 % và gây chết chuột từ 14 – 20 %.
Năm 2008 Võ Thành Thìn cho biết bốn phản ứng multiplex PCR đã được
thiết lập để xác định các gen quy định thụ thể sắt (iron – receptor) có mang trong
các chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh ở gà: (1) fhuA/iutA/iron multiplex PCR phát
hiện các gen iroN, iutA và fhuA; (2) fyuA/fepA multiplex PCR phát hiện gen fyuA và
fepA; (3) chuA/ireA/fecA multiplex PCR khuếch đại ba gen chuA,fecA và ireA: (4)
fhuE/cir multiplex PCR phát hiện gen cir và fhuE. Ứng dụng phản ứng này, 20
chủng APEC phân lập được từ gà bị bệnh do E. coli tại tỉnh Phú Yên và Khánh Hòa
đã được phân tích khả năng cạnh tranh giành sắt thông qua việc phát hiện 10 gen
quy định sinh tổng hợp 10 thụ thể sắt khác nhau. Kết quả cho thấy tất cả các chủng
APEC đều có mang gen mã hóa iron – receptor. Cụ thể là fepA (100%), fhuE (95%),
cir (95%), iutA (90%), iroN (75%), ireA (55%), fhuA (50%), fecA (45%), chuA
(45%) và fyuA (25%).
Hồ Thị Kim Cúc (2011), phân lập E. coli và xác định đặc tính gây bệnh của
vi khuẩn này trên gà, sử dụng phương pháp tiêm truyền qua phôi trứng và trên gà

14