XÁC ĐỊNH PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BRADFORD

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 4
XÁC ĐỊNH PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BRADFORD
I.

NGUYÊN TẮC

 Tìm hiểu sơ lược về protein và Coomasie Brilliant Blue G-250
o Protein
• Là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các

đơn phân là axít amin
• Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide
(gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp
theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau
của protein.
• Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm,
khuấy cơ học... hay tác nhân hóa học như axit, kiềm mạnh, muối kim
loại nặng,... các cấu trúc bậc hai, ba và bậc bốn của protein bị biến
đổi nhưng không phá vỡ cấu trúc bậc một của nó, kèm theo đó là sự
thay đổi các tính chất của protein so với ban đầu.
• Có tính kị nước do các gốc kỵ nước của các acid amin(aa) trong
chuỗi polipeptit của protein hướng ra ngoài các gốc này liên kết với
nhau tạo liên kết kỵ nước.
o

Coomasie Brilliant Blue G-250
• Coomassie Brilliant Blue G-250 là một trong hai hình thức hóa học
của một hợp chất triphenylmethane disulfonated
• Công thức phân tử: C47H50N3O7S2+; Khối lượng phân tử:
833.0458 [g/mol]
thường được sử dụng như một loại thuốc nhuộm để phát hiện

protein trong phương pháp điện di gel và Bradford để xác định
lượng protein. G-250 tạo phản ứng màu với protein (màu xanh),nên
nó còn được gọi là thuốc nhuộm Coosamie
• Nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue G- 250 là phương pháp
nhuộm phổ biến nhất thường được sử dụng phát hiện protein trên gel
polyacrylamide (Wilson,1983). Rất dễ phát hiện khi có khoảng 0,1
– 1 µg protein trên băng
•


Tùy theo hàm lượng protein mà ta có thể thay đổi tỉ lệ thành phần
các chất cũng như chất nhuộm.
• Đối với Coomassie Brilliant Blue G- 250 nên sử dụng để
nhuộm đối với những protein có trọng lượng phân tử polypeptide
thấp
 Bản chất của phản ứng
o Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi
Coomassie Brilliant Blue G – 250 liên kết với protein trong dung dịch axit.
Dạng proton hoá của thuốc nhuộm Coomassie Blue có màu đỏ da cam.
Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với cả nhóm kỵ
nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi
trường của các gốc mang điện tích dương, sự proton hoá không xảy ra và có
màu xanh xuất hiện.
o Các protein khi phản ứng xanh Coomassie sẽ hình thành hợp chất màu có
khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sống 595nm (hấp thụ cực đại ở bước
sống này)
 Đặc điểm của phản ứng
o Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch.Nồng độ Protein
càng cao thì màu xanh càng đậm
o Không phụ thuộc vào nồng độ acid amin của dung dịch

o Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml.Nhạy
hơn phương pháp Lowry gấp 4 lần
o Dễ phát hiện và tiết kiệm thời gian
o Ít bị ảnh hưởng bởi các chất thường gặp trong tế bào chẳng hạn như muối
•

II. THỰC HÀNH
 Hóa chất cần dùng
o Dung dịch mẫu cần xác định
o Dung dịch albumin 1mg/ml
• Cân chính xác 10mg albumin pha loãng 1ml nước cất
• Lắc đều cho tan,giữ ở 20oC để tạo dung dịch có nồng độ 0.1mg/ml
o Dung dịch thuốc thử Bradford
• Coomasie Brilliant Blue G-250 :0.001g
• Ethanol 990
• Acid phosphoric 85% :8.5g
• Phẩm màu CBB
 Cách tiến hành thí nghiệm


o

Bước 1: chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn với nồng độ pha loãng theo
bảng sau

ống số
Dung dịch
albumin
0,1mg/ml (ml)
Nồng độ albumin

(µg)
Nước cất (ml)
Thuốc thử
Bradford

1
0

2
0.1

0
1
2

3
0.2

4
0.3

5
0.4

a
0.5

10

20

30

40

50

0.9
2

0.8
2

0.7
2

0.6
2

0.5
2

Bước 2:sau khi pha loãng dung dịch với nồng độ xác định ta tiến hành cho
dung dịch Bradford vào với thể tích là 2 ml,thực hiện các phản ứng còn lại
với các ống cách nhau một phút
o Bước 3:tiến hành đem các ống nghiệm trên để xác định giá trị OD của từng
ống
o

Bước4 :chuẩn bị mẫu thí nghiệm là enzyme Amilaza,cách tiến hành cũng

tương như bước trên,sao cho mẫu được pha loãng cho trị số đọ quang đo
được trong khoảng của đường chuẩn
o Bước5 :ghi nhận kết quả và dựa vào giá trị OD để vẽ biểu đồ đường chuẩn
o

III. KẾT QUẢ

Ống số

1

2

3

4

5

6

Chỉ số OD

0.103

0.105

0.108

0.112

0.112

0.112

 Quan sát bằng mắt thường
o Quan sát bằng mắt thường ta nhận thấy theo thứ tự nồng độ tăng dần của
o

các ống thì màu xanh của dd cũng đậm dần
Ống số 1 là nhạt nhất và ống số 6 là đậm nhất


 Dựa vào kết quả đo hấp thụ (OD) ở bước sống 595nm
o Nồng độ albumin càng cao thì giá trị OD càng lớn
IV. PHẦN MỞ RỘNG
o Protein sau khi được tách chiết và làm sạch có thể định lượng được
o Nếu protein là enzyme thì định lượng thông qua xác định hoạt độ của

enzyme,một đơn vị hoạt độ enzyme là 1 lượng enzyme tham gia chuyển
hóa 1 mol cơ chất trong 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn
o Protein được xem là sạch nếu nững bước tách chiết và làm sạch không làm
tăng hoạt độ riêng của chúng nữa khi đó thì quá trình tách chiết và làm sạch
mới được hoàn thiện
 Phần lớn các phương pháp xác định gián tiếp protein đều dựa trên cơ sở xác định
lượng nitrogen –phương pháp Kjeldahl
o Nguyên lí của phương pháp này là vô cơ hóa H2SO4 đậm đặc và xúc
tác.dùng một kiềm mạnh(NaOH,KOH) đẩy NH3 từ muối ( NH4)2SO4 sau
đó hứng NH3 vào dung dich có nồng độ xác định để chuẩn độ acid dư.Từ
đó tính được lượng Nitrogen có trong nguyên liệu

o Ưu điểm:
• Phương pháp này có khả năng ứng dụng cho hầu hết các loại mẫu
• Mẫu thực phẩm: thuỷ hải sản, nước mắm, các loại đậu, thức ăn nuôi
tôm cá, rau quả…
• Đất, nước thải
• Bã men bia, bánh dầu đậu nành, bánh dầu cao su…
Những yếu tố làm ảnh hưởng đến kết quả phân tích:
• Nồng độ HCl 0,25N không đảm bảo chính xác
• Lấy mẫu không đại diện
• Cân mẫu không chính xác
• Nguồn nước bị nhiễm N
 Định lượng Protein bằng phương pháp Lowry
o Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng màu của protein và thuốc thử Folin, cường
độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ protein, và dựa vào đường
chuẩn của protein, có thể tính được hàm lượng protein của mẫu nghiên cứu.
o Ưu điểm:
• Được sử dụng rộng rãi để xác định nhiều loại protein khác nhau
• Có độ nhạy cao cho phaeps xác định được protein ở nồng độ 1g/ml
o Nhược điểm:
• Cường độ màu còn phụ thuộc nhiều vào từng loại protein
o


•

Nhiều chất khác có thể làm ảnh hưởng tăng hoặc giảm nồng độ màu
vì vậy phương pháp này chính xác khi quá trình chiết tách protein
đảm bảo tinh khiết

 Định lượng Protein bằng phương pháp quang phổ

o Nguyên tắc: Phát hiện và đo protein.các protein hấp thụ cực đại các tia cực

tím ở bước sống 280nm và độ hấp thu thay đổi theo từng loại protein
o Ưu điểm:
• Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch là
độ hấp thụ tia cực tím của nó
o Nhược điểm:
• Phụ thuộc nhiều vào đọ sạch của protein.Nếu protein tinh sạch thì
nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo giá trị được đo. Nếu protein
không tinh sạch thì nồng độ của protein tổng số được tính tương đối
từ độ hấp phụ.
• Không dùng cho các dung dịch có nồng đọ protein thấp dưới
0.1mg/ml hoặc khi có mặt nhiều chất khác nhau mà cùng hấp thụ
một vùng cực tím hoặc protein ở trong dd dưới dạng huyền phù
•
 Định lượng Protein bằng phương pháp Dumas
o Nguyên tắc: Phương pháp đốt cháy Dumas để xác định protein thô. Quy
trình dùng một thiết bị lò điện đun nóng mẫu phân tích lên đến 600oC trong
một lò phản ứng được bịt kín với sự hiện diện của oxy. Hàm lượng nitơ của
khí đốt sau đó được đo bằng cách dùng máy dò dẫn nhiệt. Mỗi lần xác định
chỉ cần khoảng 2 phút

V. BIỆN LUẬN