Phân tích hàm lượng β caroten trong một số loại ngũ cốc có màu ở thừa thiên huế bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (tt)

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

TRƢƠNG NGỌC BẢO HIẾU

PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG β - CAROTEN
TRONG MỘT SỐ LOẠI NGŨ CỐC CÓ MÀU
Ở THỪA THIÊN HUẾ BẰNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
DemoChuyên
Version -ngành:
Select.Pdf
SDK
Hóa
Phân

Tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
THEO ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGÔ VĂN TỨ
Thừa Thiên Huế, Năm 2017

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của

riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu ghi trong luận
văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử
dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công
trình nào khác.
Tác giả luận văn

Trƣơng Ngọc Bảo Hiếu

Demo Version - Select.Pdf SDK

ii


Lời Cảm Ơn
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS.TS. Ngô Văn Tứ đã
giao đề tài, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
thực hiện và hoàn thành luận văn này, đồng thời đã bổ sung cho tôi
nhiều kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu
khoa học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô trong khoa Hóa
trường Đại học Sự phạm và Đại học Khoa học - Đại học Huế đã
giảng dạy, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian
học Cao học và thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Trung tâm kiểm
nghiệm thuốc, mỹ phẩm và thực phẩm Thừa Thiên Huế đã giúp đỡ và
tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện luận văn.
Bằng tình
cảm chân
thành, tôi xinSDK
gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia

Demo
Version
- Select.Pdf
đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn
thành luận văn thạc sĩ này.
Xin chân thành cảm ơn!
Thừa Thiên Huế, năm 2017

Trương Ngọc Bảo Hiếu

iii


MỤC LỤC
Trang phụ bìa .......................................................................................................... i
Lời cam đoan.......................................................................................................... ii
Lời cảm ơn .............................................................................................................iii
Mục lục ................................................................................................................... 1
Danh mục các từ viết tắt .......................................................................................... 4
Danh mục các bảng và hình ..................................................................................... 5
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 8
NỘI DUNG ........................................................................................................... 10
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 10
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NGŨ CỐC ........................................................... 10
1.2. GIỚI THIỆU VỀ CAROTENOIT ................................................................... 12
1.2.1. Cấu tạo ........................................................................................................ 12
1.2.2. Tính chất...................................................................................................... 14
1.2.3. Nhân tố và cơ chế sự mất carotenoit ............................................................ 14
1.3. TỔNG QUAN VỀ β-CAROTEN .................................................................... 15

Demo Version - Select.Pdf SDK

1.3.1. Lịch sử tìm ra β-caroten và vitamin A .......................................................... 15
1.3.2. Cấu tạo ........................................................................................................ 16
1.3.3. Tính chất...................................................................................................... 18
1.3.4. Quá trình chuyển hóa β-caroten thành vitamin A ......................................... 19
1.3.5. Chức năng của β-caroten đối với sức khỏe con ngƣời .................................. 20
1.3.6. Nguồn cung cấp β-caroten ........................................................................... 21
1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH β-CAROTEN ........................................ 22
1.4.1. Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............................................................... 22
1.4.2. Quang phổ ................................................................................................... 22
1.4.3. Sắc kí khí ..................................................................................................... 23
1.4.4. Điện di mao quản ......................................................................................... 23
1.4.5. Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (APCI) .............................................. 24
1.4.6. Quang Phổ Hồng Ngoại Biến Đổi Fourier (FTIR) ........................................ 24
1.5. GIỚI THIỆU VỀ PHƢƠNG PHÁP HPLC ..................................................... 25
1.5.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp HPLC ............................................................ 25
1


1.5.2. Các giai đoạn chạy sắc ký HPLC ................................................................. 26
1.5.3. Pha tĩnh trong HPLC.................................................................................... 26
1.5.4. Pha động trong HPLC .................................................................................. 27
1.5.5. Detector trong HPLC ................................................................................... 27
1.5.6. Cách đánh giá peak, phƣơng pháp định lƣợng theo HPLC ........................... 29
1.5.6.1. Cách đánh giá peak ................................................................................... 29
1.5.6.2. Phƣơng pháp định lƣợng ........................................................................... 29
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................... 33
2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ........................................................................... 33
2.2. DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT .......................................................................... 33

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 34
2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu và chuẩn bị mẫu ........................................................ 34
2.3.2. Kỹ thuật xử lý mẫu ...................................................................................... 34
2.3.3. Chuẩn bị mẫu trắng ...................................................................................... 34
2.3.4. Khảo sát các điều kiện phân tích .................................................................. 34
2.3.4.1. Bƣớc sóng phát hiện ................................................................................. 34
2.3.4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của pha động ............................................................. 34

Demo Version - Select.Pdf SDK

2.3.4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ dòng ......................................................... 34
2.3.5. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích ........................................... 35
2.3.5.1. Khảo sát tính tƣơng thích hệ thống HPLC ................................................. 35
2.3.5.2. Khảo sát khoảng tuyến tính ....................................................................... 35
2.3.5.3. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng .................................. 35
2.3.5.4. Độ lặp lại .................................................................................................. 36
2.3.5.5. Độ đúng .................................................................................................... 37
2.3.5.6. Định lƣợng và tính toán kết quả ................................................................ 37
2.3.5.7. Xử lý số liệu thực nghiệm và đánh giá kết quả phân tích ........................... 37
2.3.6. Áp dụng phƣơng pháp để định lƣợng β-caroten trong một số loại ngũ cốc
có màu ở Thừa Thiên Huế ..................................................................................... 40
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 41
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH THEO PHƢƠNG PHÁP
HPLC .................................................................................................................... 41
3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chạy sắc ký ................................................................... 41
2


3.1.2. Ảnh hƣởng của thành phần pha động ........................................................... 42
3.1.3. Ảnh hƣởng của tốc độ dòng pha động .......................................................... 44

3.2 KỸ THUẬT XỬ LÝ MẪU .............................................................................. 46
3.3. ĐÁNH GIÁ ĐỘ TIN CẬY CỦA PHƢƠNG PHÁP HPLC XÁC ĐỊNH βCAROTEN ............................................................................................................ 47
3.3.1. Độ ổn định của hệ thống HPLC sử dụng detectơ PAD ................................. 47
3.3.2. Khoảng tuyến tính của phƣơng pháp định lƣợng .......................................... 47
3.3.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng ................................................... 48
3.3.4. Độ lặp lại của phƣơng pháp ......................................................................... 49
3.3.5. Độ đúng của phƣơng pháp ........................................................................... 50
3.4. XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ................................................. 52
3.5. ÁP DỤNG PHƢƠNG PHÁP ĐỂ PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG βCAROTEN TRONG MỘT SỐ MẪU NGŨ CỐC CÓ MÀU Ở THỪA THIÊN
HUẾ ...................................................................................................................... 54
3.5.1. Mẫu phân tích .............................................................................................. 54
3.5.2. Phân tích và đánh giá hàm lƣợng β-caroten trong một số mẫu ngũ cốc có
màu ở Thừa Thiên Huế ........................................................................................ 54

Demo Version - Select.Pdf SDK

3.5.3. Đánh giá kết quả phân tích hàm lƣợng β-caroten so với hàm lƣợng ở bảng
thành phần thực phẩm Việt Nam của Bộ y tế (2007) .............................................. 59
3.5.4. Đánh giá hàm lƣợng β – caroten trong cùng một mẫu ngũ cốc có màu ở điều
kiện bảo quản khác nhau ................................................................................................ 61
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 64
PHỤ LỤC ............................................................................................................. P1
Phụ lục 1. Sắc ký đồ khảo sát khoảng thuyến tính, LOD và LOQ .......................... P1
Phụ lục 2. Sắc ký đồ các mẫu ngũ cốc có màu ....................................................... P3

3


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Stt

Ký hiệu

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

1

AOAC

Association of Official

Hiệp hội các nhà hóa phân

Analytical Chemists

tích chính thức

2

BHT

Butylated hydroxytoluene

Hydroxytoluen butylat

3

CAS

Chemical Abstracts Service

Hiệp hội hóa chất Hoa Kỳ

4

ĐKTN

Experimental condition

Điều kiện thực nghiệm

5

HPLC

6

IUPAC

7

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

8

LOQ

Limit of quantitation

Giới hạn định lƣợng

9

MeOH

Methanol

Metanol

10

OCC

Open column chromatography

Sắc ký cột mở

11

PAD

Photodiode Array Detector

12

ppb

Part per billion

Phần tỷ

13

ppm

Part per million

Phần triệu

14

Rev

Recovery

Độ thu hồi

15

RF

Fluoresence

Huỳnh quang

16

RP

Reverse phase

Pha ngƣợc

17

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

18

S/N

Signal to noise ratio

29

TCVN

Vietnam standard

Tiêu chuẩn Việt Nam

20

THF

Tetrahydrofuran

Tetrahydrofuran

21

UV-VIS

Ultraviolet visible

Tử ngoại – khả kiến

22

V

Volume

Thể tích

23

VSATTP

Hygiene and food safety

Vệ sinh an toàn thực phẩm

High performance liquid
chromatography
International Union Of Pure And
Applied Chemistry

Demo Version - Select.Pdf SDK

4

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Hiệp hội Hóa Học Quốc Tế

Detector mảng diot phát
quang

Tỷ lệ tín hiệu chia cho
nhiễu


DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
1. BẢNG
Stt

Bảng

Tiêu đề

1

Bảng 1.1

Hàm lƣợng β-caroten trong một số loại thực phẩm

21

2

Bảng 1.2

Phƣơng pháp thêm chuẩn đƣờng chuẩn

31

3

Bảng 2.1

Ma trận thực nghiệm để phân tích ANOVA một yếu tố

39

4

Bảng 2.2 Bảng phân tích phƣơng sai theo ANOVA một yếu tố

39

5

Bảng 3.1 Hệ số đuôi peak với các tỷ lệ về dung môi pha động

42

6

Bảng 3.2 Các thông số cơ bản ở tốc độ dòng khác nhau

44

7

Bảng 3.3 Các thông số sắc ký của peak β – carotene

48

8

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

48

9

Bảng 3.5 Kết quả xác định giới hạn phát hiện

49

10

Bảng 3.6 Kết quả diện tích peak và nồng độ khảo sát độ lặp lại

50

11

Bảng 3.7

Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu ngũ cốc
Kết quả thời gian lƣu và diện tích peak các mẫu thêm

Trang

50

12

BảngDemo
3.8
Version - Select.Pdf SDK
chuẩn

51

13

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu ngũ cốc

51

14 Bảng 3.10 Thông tin về các mẫu ngũ cốc chế biến lấy đợt 1

54

15 Bảng 3.11 Thông tin về các mẫu ngũ cốc chế biến lấy đợt 2

54

16 Bảng 3.12

17 Bảng 3.13

18 Bảng 3.14

19

Bảng 3.15

20

Bảng 3.16

Kết quả phân tích hàm lƣợng β – caroten trong mẫu ngũ
cốc (mẫu đợt 1)
Kết quả phân tích hàm lƣợng β – caroten trong mẫu ngũ
cốc (mẫu đợt 2)
Kết quả phân tích ANOVA một yếu tố của mẫu ngũ cốc

55

56

57

M1
Kết quả phân tích ANOVA một yếu tố của mẫu ngũ cốc

57

M2
Kết quả phân tích ANOVA một yếu tố của mẫu ngũ cốc
M3
5

57


Kết quả phân tích ANOVA một yếu tố của mẫu ngũ cốc

21

Bảng 3.17

22

Bảng 3.18

23

Bảng 3.19

24

Bảng 3.20

25

Bảng 3.21 Kết quả kiểm tra hàm lƣợng β – caroten

26

Bảng 3.22

27

Bảng 3.23

58

M4
Kết quả phân tích ANOVA một yếu tố của mẫu ngũ cốc
M6
Kết quả phân tích ANOVA một yếu tố của mẫu ngũ cốc
M7
Kết quả phân tích hàm lƣợng β – caroten trong 06 mẫu
ngũ cốc

58

58

60
60

Kết quả phân tích hàm lƣợng β-caroten trong mẫu kê ở
điều kiện bảo quản mẫu khác nhau

61

Kết quả đánh giá theo phƣơng pháp ANOVA một yếu
tố đối với mẫu kê ở điều kiện bảo quản mẫu khác nhau

Demo Version - Select.Pdf SDK

6

62


2. HÌNH
Tiêu đề

Stt

Hình

1

Hình 1.1

Một số loại ngũ cốc

10

2

Hình 1.2

Sơ đồ giải phẫu hạt ngũ cốc

11

3

Hình 1.3

Một số carotene phổ biến trong thực phẩm

12 - 13

4

Hình 1.4

Một số xanthophyll phổ biến trong thực phẩm

13 - 14

5

Hình 1.5

Sơ đồ biến đổi carotenoit

6

Hình 1.6

7

Hình 1.7

Quá trình chuyển hóa β-caroten thành vitamin A

19

8

Hình 1.8

Minh họa quá trình tách các chất trong cột sắc ký

25

9

Hình 1.9

Giới thiệu hệ thống HPLC

25

10

Hình 1.10

Detectror phổ hấp thụ quang phân tử UV-VIS

28

11

Hình 1.11

Detector mảng diot phát quang của Agilent

29

12

Hình 1.12

Chuẩn hoá một điểm

30

13

Hình 1.13

Đồ thị của phƣơng pháp đƣờng chuẩn

30

14

Version
Select.Pdf
SDK
HìnhDemo
1.14 Đồ
thị của -phƣơng
pháp thêm
chuẩn đƣờng chuẩn

15

Hình 3.1

Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động

16

Hình 3.2

Sắc ký đồ của hệ pha động methanol : nƣớc với các
tốc độ dòng khác nhau

44 - 45

17

Hình 3.3

Sắc đồ dung dịch thử β-caroten và chuẩn β-caroten

46

18

Hình 3.4

Đƣờng hồi quy tuyến tính

49

19

Hình 3.5

20

Hình 3.6

21

Hình 3.7

Một số đồng phân hình học quan trọng của βcaroten

Sắc ký đồ khảo sát độ đúng của phƣơng pháp khi
thêm chuẩn β-caroten
Quy trình phân tích mẫu ngũ cốc theo phƣơng pháp
HPLC
Biểu đồ hàm lƣợng β-caroten (ppm) trong một số
loại ngũ cốc có màu

7

Trang

15
16 - 18

32
43

52

53

61


MỞ ĐẦU
Carotenoit là các sắc tố tự nhiên tạo ra màu vàng, da cam, đỏ trong rất nhiều
loại hoa quả (gấc, chanh, cam, nho,…), rau (cà rốt, cà chua,…), nấm và hoa; chúng

cũng có mặt trong các sản phẩm động vật nhƣ: trứng, tôm hùm, cá,… Ngày nay,
các hợp chất carotenoit rất đƣợc quan tâm, nghiên cứu và đã đạt đƣợc các kết quả
không chỉ về ảnh hƣởng của chúng đến cơ thể sinh vật mà còn đƣa ra một số sản
phẩm thuốc và thực phẩm thuốc bổ sung hàng ngày cho cơ thể [4], [12].
β-caroten là một trong số 600 loại carotenoid tồn tại trong tự nhiên. Trong
cơ thể, ngƣời ta đã tìm thấy khoảng 70 carotenoit là tiền chất của vitamin A, trong
đó có β-caroten. Và khi bị thừa thải thì β – carotene sẽ đƣợc dự trữ trong gan đến
lúc cần thiết chứ không phải bị đào thải nhƣ khi thừa thải vitamin A. β – caroten
tham gia và ảnh hƣởng đến một số quá trình sinh lý trong cơ thể: tăng cƣờng hệ
miễn dịch, ngăn ngừa một số ung thƣ, làm giảm nguy cơ mắc phải nhiều bệnh về
tim mạch, lão hóa, sa sút trí nhớ ở ngƣời già,…[7], [43], [44].
β – caroten có nhiều trong gấc, cà rốt, dƣa đỏ, củ cải đỏ, dâu tây, bí ngô,…
và một số ngũ cốc: khoai lang, kê, đậu nành, đậu xanh, vừng đen,… [8], [15].
Ngũ cốc là một trong những loại thực phẩm không thể thiếu trong khẩu phần

Demo Version - Select.Pdf SDK

ăn hàng ngày. Nó cung cấp rất nhiều dƣỡng chất cho cơ thể, bao gồm chất xơ, tinh
bột, các axit béo thiết yếu, các chất chống oxi hoá, các vitamin, các khoáng chất,
lignin và các hợp chất phenolic. Các hợp chất này có khả năng làm giảm nguy cơ
mắc các bệnh về tim mạch, ung thƣ, đái tháo đƣờng, béo phì và các bệnh khác [42].
Ngũ cốc có màu là một trong những sản phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao.
Việc nghiên cứu xác định hàm lƣợng β-caroten có trong các loại ngũ cốc có màu
giúp ngƣời tiêu dùng lựa chọn sản phẩm ngũ cốc có màu thích hợp để bổ sung vào
khẩu phần ăn hàng ngày, góp phần nâng cao giá trị dinh dƣỡng của những bữa ăn
và chăm sóc tốt hơn sức khoẻ con ngƣời.
Hiện nay, trên thế giới cũng nhƣ ở nƣớc ta đã có nhiều công trình nghiên
cứu thành công về xác định hàm lƣợng β – caroten trong các loại rau củ và hạt bằng
các phƣơng pháp khác nhau nhƣ: quang phổ hấp thụ phân tử, sắc ký lỏng hiệu năng
cao,… [7], [8], [24], [28], [42].

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một trong những phƣơng pháp
đƣợc sử dụng phổ biến để phân tích hàm lƣợng β-caroten. Phƣơng pháp sắc ký lỏng
8


hiệu năng cao có độ nhạy cao, hiệu suất tách cao, tiết kiệm đƣợc thời gian và dung
môi. [30], [37], [39], [40].
Tuy nhiên, các nghiên cứu xác định hàm lƣợng β – caroten trong các loại
ngũ cốc – nguồn thực phẩm trong đời sống hàng ngày chƣa đƣợc nghiên cứu đầy
đủ. Vì vậy, tôi chọn đề tài: “Phân tích hàm lượng β - caroten trong một số loại
ngũ cốc có màu ở Thừa Thiên Huế bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao” với mục tiêu sau:
- Xây dựng quy trình phân tích β - caroten bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao.
-

Áp dụng quy trình phân tích hàm lượng β - caroten vào một số loại ngũ
cốc có màu ở Thừa Thiên Huế.
- Đánh giá và so sánh hàm lượng β - caroten trong từng loại ngũ cốc để có
cơ sở lựa chọn khẩu phần ăn hợp lý nhằm đảm bảo lượng β – caroten cần
thiết cho cơ thể.

Demo Version - Select.Pdf SDK

9